鲜血。2009年3月26日；113(13): 3059–3069.
淋巴瘤
综合高分辨率全基因组分析显示套细胞淋巴瘤中的单亲疾病、纯合子缺失、扩增和靶基因
,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,三 ,1 ,1 ,1 ,1 ,三，4 ,三 ,2和
1 西尔维亚·贝亚
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
伊齐亚尔·萨拉维里亚
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
路易斯·阿蒙戈尔
2西班牙巴塞罗那蓬佩·法布拉大学流行病学和公共卫生研究中心基因组调控中心基因与疾病项目；
马格达·皮尼奥
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
费尔南德斯
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
佩德罗·贾尔斯
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
弗吉尼亚州阿玛多
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
路易斯·埃尔南德斯
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
阿尔巴·纳瓦罗
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
德语Ott
三德国瓦茨堡大学病理学研究所；和
4德国斯图加特Robert-Bosch-Krankenhaus临床病理研究所
安德烈亚斯·罗森瓦尔德
三德国瓦茨堡大学病理学研究所；和
泽维尔·埃斯蒂维尔
2西班牙巴塞罗那蓬佩法布拉大学流行病学和公共卫生研究中心基因组调控中心基因与疾病项目；
埃利亚斯·坎波
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
1西班牙巴塞罗那巴塞罗那大学生物研究所August Pi i Sunyer医院诊所病理科血液病理科；
2西班牙巴塞罗那蓬佩法布拉大学流行病学和公共卫生研究中心基因组调控中心基因与疾病项目；
三德国瓦茨堡大学病理学研究所；和
4德国斯图加特Robert-Bosch-Krankenhaus临床病理研究所
通讯作者。 收稿日期：2008年7月28日；2008年10月17日接受。
- 补充资料
【补充方法、表格和图表】
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摘要
套细胞淋巴瘤（MCL）的遗传学特征是t（11；14）（q13；q32）易位和大量继发染色体改变。然而，目前只发现了有限数量的靶基因。我们结合高密度单核苷酸多态性阵列和基因表达谱研究了10个MCL细胞系和28个原发性肿瘤。我们在大多数样本中检测到了高度改变的基因组，其中存在大量的部分单亲双分裂症（UPDs）。17p的UPD是最常见的一种，它与TP53型基因失活。纯合缺失靶向4个已知的肿瘤抑制基因(CDKN2C型,BCL2L11型,CDKN2A基因、和RB1型)和6个新基因(FAF1（飞行一级）,地图2,SP100标准,MOBKL2B公司,ZNF280A型、和PRAME公司). 在35个不同区域发现了基因扩增和过度表达。最经常出现的扩增区域是11q13.3-q13.5、13q31.3和18q21.33，它们针对的是CCND1号机组,C13或25、和BCL2级分别是。有趣的是，包括UPDs在内的所有基因组改变的侧翼断点与拷贝数变异和片段重复丰富的基因组区域显著相关，表明这些区域的重组可能在MCL的基因组不稳定性中起作用。这种综合基因组分析揭示了可能与MCL发病机制相关的靶基因。
介绍
外套细胞淋巴瘤（MCL）是一种侵袭性B细胞肿瘤，其遗传学特征是t（11；14）（q13；q32）易位和细胞周期蛋白D1过度表达。实验研究表明，细胞周期蛋白D1可以作为癌基因发挥作用，但其致瘤性和转化特性需要其他机制的协同作用。1——三临床观察也支持了MCL进展中额外致癌事件的需要。特别是，在1%至2%的健康人的血液中发现了少量携带t（11；14）易位的细胞。4另一方面，MCL的基因组复杂性和某些继发染色体畸变与患者的预后相关，表明这些额外的遗传事件会影响该肿瘤的行为。5——8
利用比较基因组杂交（CGH）进行分子研究，5,6,9,10多色荧光原位杂交（M-FISH），11细菌人工染色体阵列，7,8,12——14和单核苷酸多态性（SNP）阵列15发现MCL中有大量染色体改变。复发性畸变包括某些染色体区域的丢失、获得和扩增，这些区域可能包含与相关肿瘤途径相关的关键基因。分子研究已经确定了许多这些基因；值得注意的是，其中大多数参与细胞周期调控和DNA损伤反应途径。三,16,17促凋亡基因纯合缺失的最新鉴定BCL2L11型MCL细胞系的研究表明，这些淋巴瘤中细胞生存途径的元素也可能发生基因改变。13,18然而，大多数复发性染色体改变的靶点仍然未知。从这个意义上说，BAC和10K-SNP阵列研究缩小了染色体改变涉及的一些最小区域。7,8,12——15然而，潜在的相关基因仍然难以捉摸，可能是由于某些区域分辨率低或缺乏这些区域中基因表达水平的信息。
MCL是基因组不稳定程度最高的淋巴肿瘤之一，19但这一现象的机制尚不清楚。人类基因组中一类新的遗传变异，称为结构变异，最近被发现，约占人类基因组序列的12%。20结构变化主要表现为拷贝数变化（CNV）20——22和片段复制（SD）。23SDs是发生在基因组多个位点的高度同源DNA复制序列，通过非等位同源重组使这些区域发生重排，从而定义了染色体不稳定的热点。有趣的是，SD经常出现在疾病相关重排的断点处。24最近在健康人群中发现了CNV20——22并且由有助于基因组变异和潜在的疾病易感性的缺失和重复组成。值得注意的是，CNV经常与编码基因和SDs重叠，21,25这表明这些可能是内在不稳定的基因组区域，可以触发基因组重排。24,26,27结构变异驱动的肿瘤样本中染色体改变的潜在介导和/或刺激尚不清楚，它们在淋巴肿瘤中的可能关系以前也没有评估过。
在本研究中，我们通过高密度SNP阵列和一系列MCL细胞系和原发性肿瘤的mRNA表达谱对复发性染色体改变进行了全面的高分辨率综合分析，以确定可能与这些肿瘤发病机制相关的新的遗传改变和潜在靶基因。染色体改变断点的相对精确定位使我们能够确定其与人类基因组结构变异的可能关联，以及CNV和SDs在MCL基因组不稳定发病机制中的潜在作用。
方法
样品
分析了10个MCL细胞系（HBL2、UPN1、MINO、REC1、GRANTA519、NCEB1、MAVER1、Z138、JEKO1和JVM2）和28个原代MCL（表S1，可在血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。为了确保原发肿瘤中肿瘤细胞的高含量，通过梯度离心法从16例白血病MCL患者的外周血中分离出单核细胞，并使用抗CD19磁性微球（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）纯化肿瘤细胞。流式细胞术测定，所有样品中的肿瘤细胞纯度均大于98%。5名患者的正常样本中有匹配的DNA。此外，我们选择了7个肿瘤细胞含量超过85%的高白血病原发性MCL和5个肿瘤含量高（～>85%）的冷冻组织样本。根据我们的稀释实验（见文件S1中的详细信息），肿瘤含量超过85%的高含量将阵列分析中污染正常细胞的潜在干扰降至最低。所有样本均来自病理科肿瘤库、医院诊所（西班牙巴塞罗那）和病理研究所（德国瓦茨堡）。所有病例均携带t（11；14）易位和/或过度表达的cyclin D1 mRNA或蛋白。使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取总RNA和DNA。TP53型如前所述，从外显子4至11进行突变分析。2824份额外的未净化初级MCL样本用于定量实时聚合酶链反应（qPCR）验证研究。该研究得到了医院诊所审查委员会的批准，并根据赫尔辛基宣言获得了知情同意。
SNP阵列和数据分析
使用标准GeneChip Mapping-100K分析协议（Affymetrix，Santa Clara，CA）对DNA拷贝数变化和杂合性丢失（LOH）的同步全基因组检测进行了研究。简单地说，用Xba公司我和Hin公司dIII酶，连接到适配器，并通过PCR扩增。PCR产物被浓缩并破碎，然后用生物素进行最终标记、变性，并杂交到基因芯片映射-100K阵列集（Affymetrix）的2个阵列。阵列使用Fluidics Station 450、GeneChip Scanner 3000和GCOS工作站版本1.4（Affymetrix）进行处理。使用GDAS和CNAT V3.0（Affymetrix）进行评估。为了最小化背景噪声，应用了0.5 Mb的平滑窗口。用于定义拷贝数变化和LOH的工作标准的确定是基于二倍体细胞系中已知的变化（文献S1）。单亲二体（UPD）定义为拷贝数中性杂合性杂合性缺失，单亲三体（UPT）定义为获得或扩增区域的杂合性丢失。基因组异常由2名独立观察员进行检查。
表达式数组和综合分析
按照之前发布的Affymetrix标准协议，使用HG-U133 Plus 2.0阵列（Affymotrix）进行表达谱分析。29进行基因表达差异分析，以确定改变区域内的解除调控的靶基因。这些综合分析分别对细胞株、纯化和非纯化MCL病例进行处理。90%以上的样本中被视为“不存在”（检测调用为“不在场”或“边缘”）的探针组被排除在外。为了确定纯合子缺失区域中的目标抑癌基因，我们比较了不同细胞系组或原发性MCL病例中探针集的表达水平：那些有潜在纯合子丢失的、那些有丢失的、以及那些没有拷贝数变化或增益/扩增的。只有纯合子缺失病例组中称为“non-present”的探针组和其余样本中称为”present“的探针组才被视为潜在的靶基因。为了鉴定扩增区域中推定的过表达癌基因，我们比较了扩增病例和拷贝数没有变化的病例中重叠区域中包括的基因的表达水平。比较中排除了相同染色体区域获得、UPD/UPT或丢失的病例。只有具有至少2倍变化的探针组被认为是过表达的。
定量实时PCR
使用ABI Prism 7700序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）通过qPCR测定不同基因的相对DNA拷贝数变化和mRNA表达。用SuperScript First-Strand试剂盒（Invitrogen）反转录1微克总RNA。TaqMan基因表达分析（应用生物系统）分别用于DNA和RNA验证。如有要求，可提供所有引物和分析的详细序列。比较阈值循环法（2-ΔΔCt)已使用应用资产负债表和GUSB公司基因分别作为拷贝数和表达分析的内源性参考。基于之前的实验30在细胞株稀释实验中，我们建立了以下截止值：单个缺失和纯合缺失分别小于0.7和0.3，低表达和缺失表达分别小于0.6和0.2。
鱼类
按照制造商的建议，使用双色双熔探针LSI对培养细胞进行FISH分析IGH公司/BCL2级、特定于位置的LSICCND1号机组橙色探针和CEP11绿色探针（伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫市Vysis-Abott）。这些图像是由奥林巴斯bx-60显微镜（奥林巴斯，梅尔维尔，纽约）以100倍的分辨率拍摄的。使用ISIS数字图像分析系统5.0版（Metasystems，Altlussheim，德国）进行数字图像采集、处理和评估。
染色体断点拷贝数变异和片段重复富集
研究MCL改变的断点是否代表随机事件或可能反映这些区域对特定基因组结构（即CNV和SDs的存在）导致的DNA重排的敏感性，我们评估了每个染色体断点两侧100-kb和50-kb区域中存在的这些结构变异。此外，我们进行分析时分别考虑了不同类型的染色体改变（UPD/UPT、纯合子缺失、丢失、增益和扩增）。进行了计算模拟，以评估观察到的与CNV和SDs相关的断点数量是否可能是偶然的结果或代表显著的富集。因此，我们沿着染色体随机分配了1000倍的断点位置，并计算了预期数量以及包含CNV或SD的预期中值、平均值、最大值和最小断点数量。这个P（P）值的计算方法是，观察到的数量等于或超过预期值的次数除以排列总数加1（观察到的≥预期的）/（排列+1）。31 P（P）小于0.05的值被认为是显著的。使用R（奥地利维也纳经济和工商管理大学统计计算R项目）进行分析。
结果
MCL细胞系拷贝数变化与LOH
我们用基因芯片映射-100K SNP阵列研究了10个MCL细胞系。所有实验的SNP呼叫率均大于94.2%。所有细胞系均出现拷贝数改变，共有179个丢失，133个增加，25个高水平DNA扩增（表S1）。在至少4个细胞系中观察到的改变区域为8q24.21、11q13.3-q14.2、12q13.3-q14.1和18q21.31-q22.1的增加，以及6q22.32-q24.3、9pter-p21.3和17pter-p13的减少。这些区域中包含的一些靶基因是MYC公司,CCND1号机组,CDK4/MDM2,BCL2级,CDKN2A基因、和TP53型本研究中使用的基因分型平台能够敏感地检测与DNA拷贝数无变化或甚至与分别对应于所谓UPD和UPT的拷贝数增加相关的LOH。每个MCL细胞系至少显示一条完整染色体或部分UPD/UPT。总的来说，共鉴定出69个UPD/UPT区域，平均每个细胞系6.9个（范围1-26；A；表S1）。HBL2在几乎所有染色体中都存在大量的UPD/UPT区（19个UPD和7个UPT）。在至少4个细胞系中重叠UPD/UPT的最小区域为2q31.1-q32.1、2q37.1-qter和9q(B） 在3个细胞系中，2q11.2-q12.2、2q31.1-q32.1和16q23.1-q24.1。
MCL中的单亲二体和单亲三体（A）SNP阵列检测到的UPD/UPT区域分布的象形文字。UPD/UPT显示在每条染色体的左侧；细条代表UPD区域，而粗条代表LOH（UPT）的增益/放大区域。在10个细胞系中检测到的UPD/UPT用绿色表示，而在初级MCL样品中检测到UPD/UPTs用蓝色表示。仅在肿瘤细胞中检测到的获得性UPD以橙色表示。经常重叠的区域以灰色显示。（B） 在MCL细胞系中检测到9号染色体的全部/部分UPDs和纯合缺失。9号染色体的剖面从pter（左）到qter（右）。对于每个细胞系，顶部面板表示拷贝数变化（基因组平滑分析[GSA]，P（P）值），底部面板表示LOH（−log10 LOHP（P）值）。基因组缺失和伴随LOH的区域用粗红色条划线，纯合子缺失（HD）用深红色方块表示，UPD区域用粗黑色条划线。MINO显示整个染色体9 UPD，而其余3个细胞系显示9q UPD和伴随的9pter-p21缺失。REC1和MAVER1显示CDKN2A基因9p21.3和MAVER1的基因有2个额外的纯合缺失（用星号表示；)。
仅在MINO细胞系中观察到17pter-p13.1处的UPD，该UPD与TP53型（表S4）。另外五个细胞系TP53型与剩余等位基因丢失相关的失活突变。
主MCL中的拷贝号更改和LOH
使用基因芯片映射-100K SNP阵列分析了28个初级MCL。所有实验的SNP呼叫率均大于93%。在86%的病例中观察到拷贝数改变（28例中的24例），共有135例丢失，60例增益，24例扩增（表S1）。最频繁的重叠增益出现在3q26.1-qter（39%）和8q24-qter（32%），而频繁的重叠损失出现在9p21、11q22-q23（各36%）、1p21.3-p22.1（32%，8pter-p21（25%）、6q23.3（21%）和10pter-p12.31（18%）。有趣的是，在13号染色体上发现了一种复杂的丢失模式：9例显示不连续的丢失（范围，每例2-6个丢失），而2例（MCL2和MCL24）显示单一丢失，2例患者（MCL22和MCL27）显示单体13。总的来说，36%的患者丢失了13q13.3-q31.1和13q33.3-qter区域。
28例MCL中有13例（46%）检测到部分UPD，平均每例0.8个（范围0-5；A） ●●●●。共有22个染色体区域显示UPDs，其中一个位点有UPT（18q21.33-q22.1扩增）。对5名患者的生殖DNA进行了研究。在肿瘤中检测到的7个UPD中，有4个也存在于3名患者的生殖系中，而在肿瘤中获得了3个UPD（20q时2个，17pter-p12时1个）。有趣的是，获得性UPDs在肿瘤样本中复发，而生殖系UPDs较小且无复发(A） ●●●●。所有的得失都是在肿瘤中获得的。在17pter-p13.1和20q11.22-q12（各3例）以及5p14-p12和16q23.1-q23.3（各2例）观察到UPD的重复重叠区域。
有趣的是，2个UPD位于17pter-p13.1的肿瘤（MCL3和MCL14）具有以下失活突变：TP53型尽管我们没有在TP53型在其余具有17p UPD（MCL1）的MCL中，通过微阵列分析，该肿瘤完全缺乏TP53 mRNA表达。此外TP53型在其他4例患者中发现该基因：2例17p缺失，2例无17p异常（表S4）。
MCL纯合子缺失的检测和验证
我们在10个细胞系中的8个（80%）和28个原代MCL中的4个（14%）中检测到23个纯合子缺失。这些纯合缺失涉及11个不同区域，平均大小为807.6 kb，靶向总共12个缺乏mRNA表达的基因(). 这些基因是FAF1（飞行一级）和CDKN2C型1p32.3（UPN1）(A） ，环氧乙烷和BCL2L11型2q12.1（MINO、JEKO1和Z138），地图22q34（UPN1），SP100标准2q37（MINO和JEKO1）(A） ，莫比尔2b9p21.2（MAVER1），MTAP公司和CDKN2A基因9p21.3（MAVER1、GRANTA519、HBL2、REC1和Z138），RB1型13q14.2（UPN1），以及ZNF280A型和PRAME公司22q11.22（GRANTA519和HBL2）(). 此外，我们发现3个纯合子缺失；其中一个（9p21.1）不包含任何已知基因，在剩下的2个（13q33.1和18q22.1）中，分别为各个基因设置探针(2014财年FGF和DSEL公司)表达式数组中的值不可计算。
表1
| 细胞带/样品 | 开始（kb） | 结束（kb） | 大小（kb） | SNP数量 | 基因数量 | 无表达基因 |
|---|
| 第123页 | | | | | | |
| UPN1型 | 50 465.6 | 52 103.6 | 1638 | 29 | 7 | FAF1（飞行一级）,CDKN2C型 |
| 第2季度12.1 | | | | | | |
| MINO公司 | 111 333.1 | 112 182.9 | 849.8 | 29 | 2 | 环氧乙烷,BCL2L11型 |
| JEKO1号机组 | 110 286.5 | 112 155.1 | 1868.5 | 31 | 7 | 环氧乙烷,BCL2L11型 |
| Z138号 | 111 517.6 | 111 623.9 | 106.3 | 5 | 2 | 环氧乙烷,BCL2L11型 |
| 第2季度34 | | | | | | |
| UPN1型 | 210 048.3 | 210 472.0 | 423.6 | 36 | 1 | 地图2 |
| 第2季度37 | | | | | | |
| MINO公司 | 230 936.6 | 231 248.6 | 312.1 | 26 | 1 | SP100标准 |
| JEKO1号机组 | 231 008.8 | 231 248.6 | 239.8 | 18 | 1 | SP100标准 |
| 9p21.1基因 | | | | | | |
| MAVER1号机组 | 28 761.5 | 30 316.1 | 1554.6 | 163 | 0* | — |
| 第9页第11.2页 | | | | | | |
| MAVER1号机组 | 27 316.8 | 27 758.4 | 441.6 | 41 | 三 | MOBKL2B公司 |
| 9第21.3页 | | | | | | |
| MAVER1号机组 | 21 762.3 | 22 102.6 | 340.3 | 21 | 三 | MTAP公司,CDKN2A基因 |
| 格兰塔519 | 21 204.9 | 22 519.4 | 1314.5 | 68 | 12 | MTAP公司,CDKN2A基因 |
| HBL2型 | 21 948.5 | 22 102.6 | 154.1 | 12 | 2 | CDKN2A基因 |
| 可再生能源1 | 21 948.5 | 22 404.6 | 456.1 | 16 | 2 | CDKN2A基因 |
| Z138号 | 21 844.2 | 22 449.0 | 604.8 | 26 | 4 | CDKN2A基因 |
| MCL9型 | 21 204.9 | 24 209.7 | 3004.8 | 183 | 14 | MTAP公司,CDKN2A基因 |
| MCL17型 | 20 835.8美元 | 23 113.2 | 2277.4 | 133 | 22 | ND（无损检测） |
| 13季度14.2 | | | | | | |
| UPN1型 | 47 812.8 | 47 817.9 | 5.1 | 6 | 2 | RB1型 |
| 13季度33.1 | | | | | | |
| JEKO1号机组 | 101 593.7 | 101 930.8 | 337.1 | 29 | 1† | — |
| 18季度22.1 | | | | | | |
| UPN1型 | 63 097.6 | 63 530.9 | 433.3 | 33 | 1† | — |
| 22季度11.22 | | | | | | |
| 格兰塔519 | 20 831.6 | 21 479.1 | 647.5 | 21 | 5 | ZNF280A型,PRAME公司 |
| HBL2型 | 20 831.6 | 21 479.1 | 647.5 | 21 | 5 | ZNF280A型,PRAME公司 |
| MCL11型 | 21 000.1 | 21 479.1 | 479.1 | 19 | 4 | ZNF280A型,PRAME公司 |
| MCL20型 | 20 830.9 | 21 270.4 | 439.6 | 18 | 4 | ND（无损检测） |
用SNP阵列和qPCR检测MCL细胞系中的纯合缺失（A）SNP阵列在3个MCL细胞系中检测到的1号和2号染色体的剖面，从pter（左）到qter（右）。GSA公司P（P）值表示副本号更改。箭头所指的最低值（垂直红线）突出显示了纯合子缺失和候选基因的区域。UPN1表现出一种新的纯合缺失，包括FAF1（飞行一级）基因位于1p32.3，而JEKO1和MINO在2q12.1和2q37处显示2个伴随的纯合子缺失，靶向BCL2L11型和SP100标准基因。此外，JEKO1显示整个2号染色体的2p增益和MINO增益。（B） 代表FAF1（飞行一级）和SP100标准基因qPCR验证。对于每个基因，显示了拷贝数变化（上部面板SNP阵列和下部面板qPCR）和表达值（顶部面板表达阵列和底部面板qRT-PCR）。DNA分析的色码表示拷贝数的变化，并显示出各自技术结果之间的高度一致性。类似地，相对mRNA表达水平以色阶表示（从绿色到红色，分别表示从低到高的表达），也显示出结果的高度一致性。纯合缺失区域中包含的基因(FAF1（飞行一级）UPN1和SP100标准JEKO1和MINO）中的mRNA水平无法检测到，支持其在这些MCL细胞系中的失活。
在28个原发性MCL中仅检测到4个与基因表达完全缺失相关的纯合缺失：2个在9p21.3靶向MTAP公司和CDKN2A基因（MCL9和17）和22q11.22的2（MCL11和20），包括ZNF280A型和PRAME公司。
为了验证先前未在MCL中描述的缺失基因的纯合子缺失，我们对FAF1（飞行一级）,地图2,SP100型,MOBKL2B公司、和婴儿车10个细胞系和一组独立的24个初级MCL中的基因(；B） ●●●●。qPCR证实了5个基因的纯合缺失(). 此外，我们通过qPCR证实了阵列检测到的9个杂合缺失(FAF1（飞行一级）GRANTA519和JEKO1中的基因，SP100标准REC1中的基因，MOBKL2B公司GRANTA519、JEKO1、NCEB1和UPN1中的基因PRAME公司MINO和NCEB1中的基因）。在24个初级MCL的独立组中，我们发现PRAME公司2例为单等位基因缺失，2例为其他肿瘤。的单等位基因缺失FAF1（飞行一级）（3例），SP100标准（7例），以及MOBKL2B公司观察5例。3个选定基因的纯合缺失病例中也证实了mRNA表达缺失(FAF1（飞行一级）,SP100标准、和MOBKL2B公司；B、 S1）。
表2
| 样品 | FAF1（第12.3页）* | 地图2（2q34）* | SP100（2q37）* | MOBKL2B（9p21.2）* | 表扬（22季度11.22）* |
|---|
| 格兰塔519 | 0.6 | 1.1 | 1.2 | 0.6 | 0† |
| HBL2型 | 0.9 | 1 | 1.4 | 1 | 0† |
| JEKO1号机组 | 0.5 | 0.5 | 0.1† | 0.5 | 1 |
| 合资企业2 | 1.2 | 0.9 | 1.5 | 1.6 | 0.9 |
| 专家1 | 1 | 0.9 | 1.2 | 0† | 1.2 |
| MINO公司 | 1.1 | 1.7 | 0† | 1.3 | 0.5 |
| 脑脊髓炎1型 | 1.2 | 1.2 | 1 | 0.3 | 0.5 |
| 可再生能源1 | 1.1 | 0.6 | 0.5 | 1.8 | 0.9 |
| UPN1型 | 0† | 0† | 1.9 | 0.5 | 0.8 |
| Z138号 | 1.2 | 1.1 | 1.2 | 1 | 1 |
| MCL验证集 | 3/21 | ND（无损检测） | 7/21 | 5/21 | 4‡/21 |
PRAME公司和锌f280a22q11.22处的基因定位在λ链簇V段的内含子区域，位于V7-35和更具端粒的V2-34之间。考虑到这两个基因的位置，我们检查了PRAME/ZNF280A公司轻链的缺失和表达。有趣的是，4个细胞系（HBL2、GRANTA 519、MINO和NCEB1）和2个具有纯合或单等位基因22q11.22缺失的原发病例（MCL11和MCL20）表达lambda链。相反，21个kappa链表达的样本中没有22q11.22缺失。这些发现表明PRAME/ZNF280A公司可能是位于V7-35着丝粒的J和V区域之间的lambda基因重排的结果。
MCL中的扩增和靶基因：C13或25，BCL2、和CCND1号机组
我们在10个细胞系中的8个（80%）和28个原发性MCL患者中的10个（36%）中检测到53个高水平DNA扩增，涉及35个不同的染色体区域，平均大小为7Mb（范围为0.45-71.3Mb；，S3）。细胞系（平均值，2.5；范围，0-7）的扩增频率高于原发肿瘤（平均值0.9；范围，0~6，表S1）。确定了6个重复重叠的扩增区域，其中含有高度过表达的基因(). 13q31.3和18q21.33区域的扩增分别在6个样本中检测到，而其他4个扩增区域仅在2个病例中观察到()。
表3
| 细胞带 | 样品 | 开始（kb） | 结束（kb） | 大小（kb） | 基因数量 | 重叠区域（基因数量） | 重叠区域过度表达的基因* | 重叠区域的推测microRNA |
|---|
| 8季度21.11季度24.3 | MCL26型 | 74 752.6 | 146 052.2 | 71 299.5 | > 500 | 8q24.21（2） | CCNE2公司,E2F5型,†EDD1公司,EIF2C2系统,BXL6型,FBXO43型,FZD6型,†(MYC公司),‡NIBP公司和几种锌指蛋白§ | — |
| 8季度24.21 | JEKO1号机组 | 127 321.4 | 128 809.0 | 1 487.5 | 2 | | (MYC公司)‡ | |
| 9翼-24.1 | Z138号 | 239.4 | 6 759.2 | 6 519.8 | 30 | 9p24.2-p24.1（14） | AK3公司,C9或38,†C9或46,CDC37L1型,JAK2号机组,†PPAPDC2,RANBP6公司,RCL1型,RFX3系列,†TPD52L3型 | hsa米尔101–2 |
| 9p24.2-p24.1页 | MCL21型 | 2 332.2 | 5 415.1条 | 3 082.9 | 14 | | ND（无损检测） | |
| 10p12.33-12.1页 | MCL19型 | 19 237.3 | 26 503.1 | 7 265.9 | 15 | 10p12.31-p12.1（11） | ND（无损检测） | hsa米尔603 |
| 10p12.31-p12.1页 | MCL20型 | 22 316.8 | 25 365.9 | 3 049.1 | 11 | | ND（无损检测） | |
| 11季度13.3至13.5季度 | 乙型肝炎病毒2型 | 68 979.0 | 76 176.0 | 7 197.0 | 77 | 11q13.3-q13.5（77） | ATG16L2型,C11或30,C11或51,CCND1号机组,†欧洲中部贸易数据中心2,CHCHD8公司,CLPB公司,DHCR7型,†FADD公司,†FCHSDs2,INPPL1公司,LRRC51型,MRPL48型,NADSYN1公司,†数字1,橙色1,†PGM2L1系列,POLD3（极3）,第页第1页,†PPME1型,槽口6a,RNF169号机组,SPCS2型,TNFRSF19L公司,UCP2号机组,†UCP3号机组,PAAF1型 | hsa mirs 139/326号 |
| 11季度13.3-季度14.1 | MAVER1号机组 | 69 059.8 | 80 083.5 | 11 023.7 | 101 | | | |
| 11季度13.1至14.3季度‖ | MCL14型 | 64 457.5 | 92 492.5 | 28 034.9 | > 200 | CCND1号机组,†DGAT2公司,†第21页,†PPME1型,†PAAF1型† | | |
| 11季度13.3-季度23.3‖ | MCL1公司 | 69 041.4 | 119 717.6 | 50 441.9 | > 200 | | | |
| 11问题13.2-问题14.1‖ | MCL26型 | 68 435.5 | 81 720.1 | 13 284.5 | > 100 | | ATG16L2型,C11或30,SLCO2B1型 | |
| 11季度13.2-21季度‖ | MCL18型 | 68 986.2 | 95 676.4 | 26 690.2条 | > 150 | | ND（无损检测） | |
| 2013年第31季度至2012年第31季度 | 可再生能源1 | 85 593.0 | 91 208.3 | 5 615.3 | 2 | 13季度31.3（1） | C13或25† | hsa mirs 17/18a/19a/19b1/20a/92a1/622 |
| 13季度31.2季度32.1 | MCL20型 | 86 090.6 | 94 386.2 | 8 295.6 | 7 | | | |
| 13季度31.2至31.3季度 | MCL18型 | 88 696.3 | 92 595.3 | 3 899.0 | 1 | | | |
| 13季度31.3 | HBL2型 | 89 815.1 | 90 996.6 | 1 181.5 | 1 | | | |
| 13季度31.3 | JEKO1号机组 | 89 815.1 | 92 166.6 | 2 351.5 | 1 | | | |
| 13季度31.3 | MCL17型 | 90 738.1 | 91 700.9 | 962.8 | 1 | | | |
| 18季度12.2至22.1季度 | MINO公司 | 31 201.2 | 61 451.2 | 30 250.0 | 89 | 18q21.33（10） | BCL2级,†FVT1型,PHLPP公司,VPS4B（虚拟专用交换机） | hsa米尔122 |
| 18季度21.2季度22.2¶ | HBL2型 | 49 877.1 | 65 507.0 | 15 629.9 | 57 | | | |
| 18季度21.31季度22.2 | Z138号 | 52 434.9 | 66 564.3 | 14 129.4 | 48 | | | |
| 18年第21.32季度至第22.3季度 | 格兰塔519 | 55 604.1 | 69 248.9 | 13 644.8 | 33 | | | |
| 18季度21.33-季度22.1¶ | MCL21型 | 57 749.3 | 63 438.4 | 5 689.2 | 21 | | | |
| 18季度21.33 | MAVER1号机组 | 58 464.6 | 59 544.8 | 1 080.2 | 10 | | | |
在3个原发肿瘤和3个细胞系中检测到13q31.3扩增(). 仅针对最小区域C13或25编码致癌基因微小RNA多顺反子，其RNA在该位点扩增的细胞系中过度表达10倍以上。
一个初级MCL（MCL21）和5个细胞系具有4个基因的18q21.33区域扩增(BCL2级,FVT1型,PHLPP公司、和VPS4B（虚拟专用交换机）)mRNA表达水平高于未扩增细胞系。BCL2级是4个基因中表达水平最高的基因（比其他扩增基因高2到3倍）。放大BCL2级MAVER1、HBL2和1例原发病例经FISH确认(A、 B）。UPN1细胞系携带经FISH证实的18q21.33区域的等位基因缺失（数据未显示）。
BCL2级和CCND1号机组FISH分析证实MCL基因扩增.具有代表性中期的FISHBCL2级（红色），IGH公司（绿色），CCND1号机组（橙色）和CEP11（绿色）专用探针。（A） HBL2细胞系显示串联高拷贝数BCL2级放大（红色箭头）。（B） BCL2级该位点在来自验证集的初级MCL（红色信号）中扩增，该验证集也显示CGH的18q21扩增。（C） HBL2细胞系有一个扩增的CCND1-IGH型重排（红色箭头）和2条未转移的11号染色体CCND1号机组11号染色体着丝粒下方的信号（红色）（绿色）。这个CCND1-IGH型双色双熔探针证实了扩增融合（数据未显示）。（D） MAVER1细胞系有2个高水平串联扩增CCND1号机组（红色箭头）位于2条不同的染色体上：其中一条对应于第6染色体上的复杂t（11；14）易位。11携带第二个扩增区的染色体尚未被鉴定。一条带有红色的未转移的11号染色体CCND1号机组还观察到与绿色着丝粒11探针相关的信号。
在HBL2和MAVER1中发现11q13.3区域的扩增，这与高水平的细胞周期蛋白D1长转录物有关（探针集208712_at）。这些CCND1号机组扩增与易位等位基因相对应，并通过FISH证实(C、 D）。此外，4个原发肿瘤的病灶增益为11q13，涉及CCND1号机组其中3个位点的cyclin D1 mRNA水平也很高。
CNV和DNA断点两侧的片段复制
CNV和SDs是密切相关的结构，被认为是非等位同源重组的底物，可能有助于产生类似于脆性位点的染色体改变。27为了确定MCL中观察到的重复DNA断点是否与这些DNA区域相关，我们进行了计算模拟实验，以比较观察到的染色体断点数量与MCL中偶然出现的CNV或SDs数量之间的关系。鉴于GeneChip Mapping-100K SNP阵列的高分辨率，我们能够精确地绘制断点，并评估这些坐标与CNV和SDs的物理位置的关联，这些CNV和SD分别存放在基因组变异数据库和加利福尼亚大学圣克鲁斯表中。21我们考虑了SDs和CNV与每个断点两侧的100-kb区域重叠。总的来说，在目前的MCL系列中，我们检测到1200个染色体改变断点。1200个断点中，共有181个（15%）与SDs相关，比例略高于模拟数据（中位数为152，P（P）= .071). 有趣的是，1200个断点中有552个（46%）与CNV重叠，这一比例明显高于模拟数据的比例（中位数为412，P（P）< .001; 表S3）。在MCL断点处CNV的显著富集表明CNV可能有助于MCL基因组失衡的产生。根据改变类型（UPD/UPT，纯合子缺失、丢失、增益和扩增），我们发现CNV与UPD/UPT，纯合子缺失、丢失和增益显著富集，而SDs与纯合子丢失和缺失显著富集(; 表S3）。考虑每个断点两侧50-kb的CNV和SD时，发现了类似的显著关联（数据未显示）。
MCL断点CNV富集和片段重复的典型例子基于计算模拟，将含有CNV/SDs的预期断点数量与MCL细胞系和原发性肿瘤中观察到的断点数量进行比较，得出CNV/SDs基因座中MCL染色体断点的关联。发现UPDs/UPTs（A）和染色体丢失（B）的CNV位点断点显著富集。同样，在SD位点上发现丢失（C）的断点显著增加，而染色体获得的断点与SDs（D）无关。
讨论
高密度100K SNP阵列平台是一种快速可靠的检测方法，可以同时筛查整个基因组的DNA拷贝数变化和LOH。将此信息与表达阵列数据相结合为识别病理生物学相关的癌症基因提供了一个有价值的工具。我们在10个MCL细胞系和28个肿瘤细胞含量高的原发肿瘤中使用了这种综合方法。研究结果通过识别大量复杂的UPDs/UPT以及识别新的纯合子缺失和扩增，从而改变假定的肿瘤抑制基因、癌基因和致癌microRNA的表达，扩大了MCL肿瘤基因组复杂性的观点。
用SNP阵列观察到的基因组变化的全球概况证实并细化了MCL中先前描述的最常见区域。5——10,12——15正如预期的那样，MCL细胞系显示出与MCL原发肿瘤相比增加了5倍的变化数量。然而，在MCL原发病例中也发现了最常见的改变，并且与表达变化有关。此外，我们首次发现主要MCL中存在大量复杂UPD/UPT。最近在不同的血液肿瘤中发现了UPD，包括急性白血病，32,33多发性骨髓瘤，34慢性淋巴细胞白血病，35滤泡性淋巴瘤，36T前淋巴细胞白血病，37和5个MCL细胞系。38MCL中的UPD区域通常针对小而广泛的染色体区域。这种UPD也见于多发性骨髓瘤，34慢性淋巴细胞白血病，35和T前淋巴细胞白血病37这可能是由多个有丝分裂重组事件引起的现象。相反，滤泡性淋巴瘤中发现的UPDs36和急性髓细胞白血病32涉及大的染色体区域到达端粒，这表明它们可能起源于单个有丝分裂重组事件。此外，在大多数MCL中检测到的UPD/UPT是在染色体臂中发现的，同时受到UPD/UPT的损失、增加和其他区域的影响。MCL基因组中这种现象的高数量和复杂性与其他血液肿瘤没有相似之处，这可能反映了这些肿瘤的基因组不稳定性。有趣的是，只有T前淋巴细胞白血病似乎也携带相对复杂的UPD分布。37
某些染色体区域的UPD可能通过选择导致肿瘤发病的突变/甲基化基因在某些肿瘤的生物学中发挥重要作用，即：，FLT3、WT1、和CEBPA公司急性髓细胞白血病的基因，39,40 JAK2号机组骨髓增生性疾病，41和IGF2型和H19型肝母细胞瘤中的基因。42在我们的研究中，在3个原发性肿瘤和一个细胞系中检测到的4个17p UPDs与TP53型基因失活。在2名慢性淋巴细胞白血病患者中也观察到类似情况。43UPDs在其他染色体区域的可能意义尚不清楚，因为只有有限数量的UPDs位于已知肿瘤抑制基因的区域。在其他血液肿瘤中未观察到UPT。在我们的研究中，7个MCL细胞系和一个原发肿瘤显示不同染色体区域的UPT。有趣的是，18q21.33的UPT中含有高水平的DNA扩增BCL2级也与高表达水平相关的基因。有趣的是，对一些患者的正常DNA进行的平行分析表明，患者的生殖系中已经存在非复发性和小的UPD，但在肿瘤样本中获得了2个复发性UPD。
我们的综合基因组和表达分析使我们能够识别和验证MCL中的大量纯合缺失和潜在靶基因。以前使用BAC阵列的研究已经观察到纯合缺失，包括不同的肿瘤抑制基因(CDKN2C型,BCL2L11型,CDKN2A基因、和自动取款机)免疫球蛋白kappa和lambda位点（2p11.2和22q11.22），以及在有限数量的细胞系和原发性肿瘤中没有已知靶基因的区域（11p12-p14和13q32.3）。8,13,14,18,29在本研究中，我们在11个不同的区域发现了纯合子缺失，其中6个区域以前没有发现，并且我们已经证实了之前描述的纯合子丢失CDKN2C型,BCL2L11型,CDKN2A基因和22q11.22在最初观察到的相同细胞系中，也扩大了BCL2L11型,CDKN2A基因和22q11.22在其他细胞系（分别为MINO、MAVER1和HBL2）中。这个CDKN2C型据报道，该基因是1p32.3纯合缺失的靶基因。然而，我们现在发现，这种删除还包括FAF1（飞行一级）是NF-κB通路的抑制剂，抑制IKK活性，并在细胞质中独立保留NF-κ）B p65。44
我们的方法目标检测到的新的纯合缺失地图2（第2季度34），SP100标准（2q37），以及MOBKL2B公司（9p21.2）基因。地图2是神经元微管动力学的主要调节因子，最近与上皮癌细胞的迁移有关。45SP100与PML、TP53和DAXX蛋白一起是核体的组成成员。46最后，MOBKL2B公司在MAVER1中发现纯合缺失，而在其他细胞系中发现单一缺失。在其他没有基因组缺失的样本中也发现该基因的mRNA表达缺失或低水平（图S1）。MOBKL2B公司与月1日该基因是Hippo通路的成员，通过调节增殖和有丝分裂检查点调节参与癌症的发展。47
MCL中仅发现少数复发性扩增和候选癌基因，是最常见的8q24(MYC公司)，第12.2页(BMI1公司)和12q13(川东北4)。7,8,15在本研究中，我们检测到35个不同的扩增区域。复发率最高的是13q31.3和18q21.33，分别见于6个细胞系和原发性肿瘤。有趣的是，C13或25是小13q31.3扩增子中唯一包含的基因，其扩增与表达水平相关，比未扩增样品高10倍，表明该基因可能是MCL中这些扩增的靶基因。在不同的淋巴肿瘤中观察到13q31-q32扩增，并且C13或25被克隆为该扩增子最可能的候选基因。48该基因编码miR-17-92型多顺反子集群，似乎与MYC公司转化小鼠B细胞，减少细胞凋亡。49基因的扩增和过度表达C13或25偶尔在伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤和JEKO1 MCL细胞系中观察到。48,50以前曾有10%的MCL出现13q31-q32扩增。6我们的发现C13或25这些扩增的靶基因表明，这种改变可能在这些肿瘤中起致病作用。
18q21是MCL中经常获得和扩增的区域，6,7,15和更高的表达BCL2级在囊胚变异体中观察到该基因。51在本研究中，我们在5个细胞系和2个原发性肿瘤中观察到该区域的扩增。该扩增子的最小重叠区域包括10个基因，其中只有4个基因上调。这个BCL2级该基因表现出最高的mRNA过表达水平，表明它可能是这些扩增的靶点。这个BCL2级扩增和过表达可能通过促进细胞存活、促进细胞的基因组不稳定性、促进MCL的发病机制，52增加肿瘤细胞对针对BCL2家族成员的新治疗药物（即BH-3模拟药物）的耐药性。53
CCND1号机组该基因在2个细胞系中被扩增，并且也被包括在4个原发病例的局灶性11q13增益中。这些改变与细胞周期蛋白D1的高水平有关。对2个细胞系（HBL2和MAVER1）的FISH分析证实，扩增与易位等位基因相对应。这些扩增可能是增加细胞周期蛋白D1水平的另一种机制，类似于mRNA 3′UTR区的截断和突变的影响，这与短1.5kb转录物的高表达水平有关。54有趣的是，这两个细胞系只表达了长mRNA cyclin D1转录物，表明它们在3′UTR mRNA区域没有发生改变。放大CCND1/IGH融合基因仅在一种罕见的白血病MCL中被描述，该白血病MCL具有高cyclin D1过度表达，核型非常复杂，TP53型基因失活和一个非常积极的临床过程。55
除了这些对mRNA表达有重要影响的高度重复性遗传改变外，我们还检测到大量不太常见的畸变。这两种变化的生物学和临床意义可能不同。虽然针对有效抑癌基因和癌基因的复发事件可能具有重要的致病作用和临床影响，但较少见的畸变可能与反映MCL高度染色体不稳定性的乘客事件相对应。三,19
MCL基因组不稳定性的机制尚不清楚。CNV和SDs是DNA的防裂区，可能通过促进非等位同源重组而导致染色体改变。24,26,27事实上，在神经母细胞瘤的某些染色体的肿瘤破裂区域发现了SDs和CNV的富集，56家族性胰腺癌，57和癌细胞系。58此外，最近报道了结肠癌的染色体断点与CNV和SDs的全基因组关联。59在本研究中，我们首次发现在MCL染色体改变断点处CNV和SDs显著富集。我们发现多达46%的断点与CNV区域共定位，这一数字与结肠癌中的41%相似。59特别是，在MCL中，CNV区域经常与UPDs/UPT、纯合缺失、丢失和增益相关，但与扩增无关，而SDs更经常与纯合缺失和丢失相关。这些发现与之前对健康受试者的研究一致，研究表明SDs参与染色体丢失，但不参与染色体获得。25此外，这是首次发现这种结构变化与UPD/UPT区域相关。MCL是一种基因组高度不稳定性和DNA损伤修复途径改变的肿瘤，这些发现可能表明，许多染色体改变可能是由SDs和CNV驱动的非等位同源重组的异常修复引起的。
总之，我们的研究整合了MCL的高分辨率基因组和表达谱，发现了大量复杂的基因组穿插的UPDs，扩大了这些肿瘤基因组不稳定性的前景。此外，我们描述并证实了一些针对已知和新候选基因的纯合缺失和扩增，这些候选基因可能与这些淋巴瘤的发病机制有关。最后，我们描述了MCL染色体改变两侧断点处CNV和SDs的显著富集，表明这些结构可能导致肿瘤的基因组不稳定。
致谢
我们感谢梅丽莎·维瑟（Melissa Visser）、劳拉·普拉（Laura Pla）、蒙塞·桑切斯（Montse Sanchez）和伊拉塞马·纳亚奇（Iracema Nayach）提供的出色技术支持。
这项工作得到了Salud Carlos III研究所、卫生研究基金会（FIS06/0150；S.B.）、Española Ciencia y Tecnologia委员会（SAF05/5855；E.C.）、Salud Callos III Red Temática de Investigacio on Cooperativa de Cancer研究所（2006RET2039；E.C，美国国立卫生研究院SPECS（授予5 U01 CA114778-03；E.C.，A.R.）和淋巴瘤研究基金会（LRFMCLI-05-023，E.C.，A.R.；和LRF07168，P.J.）。E.M.H和A.R.由德国瓦茨堡大学临床研究跨学科中心提供支持。L.H.是August Pi i Sunyer生物研究所的研究员，得到了FIS和Programa d’estabilizaciód’investigadors de la Direcciöd’Estrategia i Coordinanciódel Departament de Salut（Generalitat de Catalunya）的支持。X.E.实验室的研究得到了加泰罗尼亚将军（卫生部、大学和创新部）的支持。
脚注
本文的在线版本包含数据补充。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：S.B.设计和执行研究，收集和分析数据，并撰写手稿；洛杉矶进行了模拟实验和分析；I.S.、M.P.、V.F.、E.M.H.、P.J.和A.N.进行了研究；V.A.和L.H.讨论了结果；G.O.和A.R.提供并修改了患者样本；X.E.监督的模拟实验和分析；E.C.设计了研究，修改了患者样本，监督了研究，并撰写了手稿；所有作者都对手稿的最终版本进行了批判性审查。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通信：Elias Campo，西班牙巴塞罗那维拉罗医院诊所血液病理科，邮编：17008036；电子邮件：se.bu.cinilc@opmace网站。
工具书类
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