临床投资杂志。2009年4月1日；119(4): 802–812.
PICK1缺乏通过破坏顶体形成导致小鼠雄性不育
,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,三 ,2和1
南晓
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
全锦
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物和三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
重审
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
金文英（Wenying Jin）
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
王俊奇
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
Kwong Man Lee（李光文）
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
李文江
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
Jun Xia先生
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物与科学系三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
1香港科技大学生物化学系，中华人民共和国香港九龙清水湾。2生物和三中华人民共和国香港新界沙田香港中文大学医学院李嘉诚健康科学研究所。
通讯地址：中华人民共和国香港九龙清水湾香港科技大学生物化学系夏军。电话：（852）2358-8714；传真：（852）2358-1552；电子邮件：kh.tsu@aixj. 收稿日期：2008年5月16日；2009年1月7日接受。
摘要
与C激酶1相互作用的蛋白（PICK1）是一种参与蛋白质运输的外周膜蛋白，其功能在神经元中有很好的特征。在这里，我们报告了缺乏PICK1的雄性小鼠是不育的，并且具有类似于人类疾病球形精子症的表型。睾丸的主要缺陷选取1-敲除小鼠在精子发生早期是顶体断裂。这种分裂随后导致细胞核伸长和线粒体鞘形成缺陷，导致圆头精子，精子数量减少，精子活力严重受损。我们发现PICK1与Golgi相关的PDZ和线圈基序蛋白（GOPC）以及蛋白激酶2的初级催化亚基（CK2α′）相互作用，这些蛋白的缺陷会导致小鼠的球形精子症。PICK1在圆形精子细胞中高表达，并定位于高尔基衍生的前顶体颗粒。GOPC在高尔基体区域与PICK1共定位，并促进PICK1阳性簇的形成。此外，睾丸生精小管的凋亡增加选取1–/–小鼠，在CK2α′缺陷小鼠中也可以看到这种表型。我们的结果表明，PICK1参与了囊泡从高尔基体向顶体的转运，并与其他蛋白质如GOPC和CK2α′在顶体生物发生中协同作用。
介绍
与C激酶1相互作用的蛋白（PICK1）是一种参与蛋白质运输的外周膜蛋白。PICK1最初被鉴定为来自酵母双杂交筛选的蛋白激酶C相互作用蛋白(1). 随后，发现许多蛋白质与PICK1相互作用(2). 这些蛋白质中的大多数是膜蛋白，如谷氨酸受体、多巴胺转运蛋白、Eph受体和酸感应离子通道(三–8). 这些相互作用通常发生在膜蛋白的C末端和PICK1突触后密度95、大圆盘和闭塞小带-1（PDZ）结构域之间，后者是一个特征鲜明的蛋白质相互作用模块。在大多数情况下，PICK1调节其PDZ结构域结合伙伴的亚细胞定位或细胞表面表达。
对PICK1在α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体贩运中的作用的研究为我们理解PICK1的功能提供了大量信息。AMPA受体是谷氨酸受体的一个亚型，调节大脑中大多数兴奋性突触传递(9). PICK1在AMPA受体贩运中的作用已被广泛研究，因为它在突触可塑性（学习和记忆的细胞模型）中的意义(10). PICK1被发现通过其PDZ结构域与AMPA受体亚单位GluR2和GluR3的C末端特异性相互作用(4,5). PICK1通过与AMPA受体的相互作用，诱导异种细胞中AMPA受体簇的形成，并将AMPA受体靶向神经元的突触。PICK1也被发现降低AMPA受体的表面表达(11). 研究发现，PICK1在突触靶向和AMPA受体表面表达中的作用对突触可塑性很重要，因为干扰PICK1与AMPA受体之间的相互作用会损害突触可塑性(12–14). PICK1在AMPA受体转运和突触可塑性中的作用已被来自选取1-被发现在AMPA受体转运和突触可塑性方面存在缺陷的敲除小鼠(15,16).
最近的研究已经开始揭示PICK1调节蛋白贩运的分子机制。PICK1有两个主要领域。除了PDZ域外，PICK1还具有Bin/两性激素/Rvs（BAR）域。BAR结构域是新月形的二聚体，结合并促进膜曲率的形成，形成出芽囊泡(17). PICK1的BAR结构域与带负电荷的脂质结合，主要是磷脂酰肌醇(11). 脂质结合缺陷的PICK1失去其调节AMPA受体运输的能力，并损害突触可塑性的表达。在选取1-敲除小鼠后，发现野生型PICK1 cDNA可以修复突触可塑性缺陷，而脂质结合缺陷型PICK1cDNA则无法修复(15). 虽然PICK1的BAR结构域能够形成同型二聚体，但大脑中的大多数PICK1实际上与另一个BAR结构区形成异二聚体——包含蛋白质的胰岛细胞自身抗原69 kDa（ICA69）(18)，一种首次在1型糖尿病患者中发现的自身抗原(19). 与ICA69形成异二聚体减少了PICK1的突触靶向和AMPA受体的表面表达。这些结果表明，PICK1的BAR结构域通过其与膜曲率的结合，可能将PICK1 PDZ结构域-结合伙伴，如AMPA受体，作为运输囊泡的载体。从PICK1-ICA69异二聚体到PICK1-PICK1同源二聚体的转变可能决定这些运输囊泡的目的地。由于PICK1的PDZ结构域与40多种蛋白质结合，PICK1可能以类似的方式调节这些蛋白质的运输(2).
PICK1不仅在大脑中表达，而且在许多其他组织中也表达，在睾丸和胰腺中的表达水平相对较高(18). 脑外PICK1的功能基本上仍不清楚。这里我们报告说，令人惊讶的是，男性选取1-基因敲除小鼠完全不育。详细分析表明选取1-基因敲除小鼠的圆头精子顶体畸形，核形状异常，这是在一种称为球形精子症的人类疾病中发现的精子特征(20). PICK1定位于精子细胞中高尔基衍生的前顶体颗粒选取1-敲除小鼠可能是顶体前体颗粒异常运输的结果，导致顶体形成受损。
结果
Pick1精子异常–/–小鼠与人类球形精子症相似。
选取1-基因敲除小鼠看起来非常正常(15,16). 虽然是男性选取1–/–小鼠交配正常，完全不育。我们确定了垃圾的数量和大小，发现当选取1+/–雄性小鼠与选取1+/–在6个月的时间里，雌性小鼠的生育率与野生型小鼠相当（平均产仔数[平均±SEM]：雄性选取1+/+×女性选取1+/+，7.3±0.4，男性选取1+/–×女性选取1+/–, 7.1 ± 0.5; 平均产仔数：雄性选取1+/+×女性选取1+/+，4.3±0.2，男性选取1+/–×女性选取1+/–, 4.3 ± 0.2;n个= 20). 另一方面，当选取1–/–雄性与野生型或选取1+/–雌性小鼠，未获得后代。
为了研究PICK1缺乏如何导致男性不育，我们首先检测了选取1–/–老鼠。成人附睾尾精子总数选取1–/–小鼠（7.24×106± 0.81 × 106)显著小于野生型（17.69×106± 1.62 × 106)以及选取1+/–小鼠（12.41×106± 1.10 × 106)（图A） ●●●●。PICK1缺乏对精子活力的影响甚至更为严重。活动精子的数量选取1–/–小鼠的精子数量不到野生型同窝配偶的4%选取1–/–小鼠表现出快速进行性线性运动（图、B和C）。
精子数量减少和精子形态异常选取1–/–老鼠。(A类)单个附睾尾精子总数：野生型(选取1+/+), 17.69 × 106± 1.62 × 106;选取1+/–, 12.41 × 106± 1.10 × 106;选取1–/–, 7.24 × 106± 0.81 × 106; 平均值±SEM，n个＝10**P（P）< 0.01. (B类)活动精子数：选取1+/+, 91.03 × 105± 15.5 × 105;选取1+/–, 47.68 × 105± 9.32 × 105;选取1–/–, 3.38 × 105± 1.21 × 105. (C类)线性活动精子数：选取1+/+, 58.80 × 105± 13.59 × 105;选取1+/–，22.13×105± 5.55 × 105;选取1–/–, 0. (D类)类球形精子百分比：选取1+/+, 1.57% ± 0.81%;选取1+/–, 2.26% ± 0.73%;选取1–/–, 88.69% ± 9.57% (n个= 3). (E类)未固定精子的形态。精子来自选取1–/–小鼠失去了正常精子典型的钩状头部；相反，它们有圆形或不规则的球形头部。此外，来自选取1–/–老鼠。(F类)精子顶体基质蛋白sp56（红色）和细胞核（nu，蓝色）的免疫染色。顶体选取1–/–小鼠无法获得新月形结构，经常被分割，并且位置错误。(G公司)精子线粒体鞘（ms，红色）和细胞核的免疫染色。线粒体鞘拾取–/–小鼠表现出各种缺陷，包括（从左到右）异常精子线粒体鞘聚集，线粒体鞘分裂，线粒体鞘与圆形核重叠，线粒体鞘包裹圆形核。比例尺：5μm。
在检查附睾尾部精子的形态时，我们观察到大量来自附睾尾侧的精子选取1–/–小鼠的头部异常，类似不规则形状的球体，而野生型小鼠的精子呈钩状（图E、 亮场图像）。DAPI标记细胞核，sp56标记顶体，可以清楚地显示缺陷。顶体是哺乳动物精子头部的一种特殊分泌结构(21–23). 它含有各种水解酶，当精子与卵子的透明带接触时会释放这些酶，这些酶有助于精子穿透卵子并与卵子融合。如图所示F、 精子的顶体选取1–/–小鼠未能获得典型的新月形状，存在定位错误、变形和碎片等缺陷。负责精子运动的线粒体鞘在选取1–/–老鼠。细胞色素氧化酶亚基I标记线粒体，免疫染色显示选取1–/–小鼠有各种各样的缺陷，包括在变形核附近聚集，分裂成两个单独的聚集物，与变形核重叠，在某些情况下包裹变形核（图G） ●●●●。定量结果表明，近90%的精子来自选取1–/–小鼠头部呈圆形，顶体异常，细胞核圆形，线粒体鞘异常（图D） ●●●●。相反，在野生型或杂合子小鼠中很少见到具有所有3种缺陷的异常精子。这些异常使人想起球形精子症的缺陷。球形精子症是一种人类不育疾病，其特征是具有畸形细胞核的圆头精子、异常顶体和畸形线粒体鞘(20).
Pick1精子发生异常–/–老鼠。
确定精子异常的原因选取1–/–小鼠，我们检测了雄性生殖道精子的形态。H&E染色显示，在附睾尾和附睾头的横切面上精子较少选取1–/–鼠标（图A；仅显示附睾尾）。此外，附睾中的精子选取1–/–小鼠是圆形的，而不是野生型和杂合子同窝小鼠的典型钩形（图A、 插图）。异常精子遍布附睾的发现表明，这些缺陷可能源于睾丸。的睾丸选取1–/–小鼠在大体检查后似乎是正常的。然而，他们被发现比野生型小鼠的体型略小（图B） ●●●●。我们测量了睾丸的重量，并将其标准化为小鼠的体重。我们发现选取1–/–小鼠体重明显轻于野生型和选取1+/–鼠标（图C） ●●●●。此外选取1+/–小鼠比野生型小鼠略轻。
精子发生异常选取1–/–老鼠。(A类)附睾H&E染色。精子数量选取1–/–老鼠比选取1+/+小鼠附睾尾横切面。插图：精子头部放大图，显示精子来自选取1–/–老鼠是圆头的。比例尺：10μm。(B类)的睾丸选取1–/–老鼠比那些选取1+/+或选取1+/–老鼠。比例尺：2 mm(C类)正常睾丸重量（睾丸重量（TW）×1000/BW）选取1–/–小鼠显著低于选取1+/+或选取1+/–老鼠。选取1+/+, 3.58 ± 0.11;选取1+/–, 3.25 ± 0.09;选取1–/–, 2.88 ± 0.19;n个= 10. 数据表示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (D类)生精小管的直径选取1–/–老鼠比选取1+/+和选取1+/–老鼠。选取1+/+，203.7±1.13微米；选取1+/–，206.2±5.2微米；选取1–/–，181.3±4.2μm；n个= 50. (E类)睾丸H&E染色。生精小管的管腔选取1–/–小鼠比野生型小鼠略大。3种基因型中精原细胞（白色箭头）、精母细胞（白色箭）和圆形精子细胞（黑色箭头）的形态相似。然而，成熟精子较少选取1–/–老鼠和精子的头部选取1–/–老鼠是圆的，而在选取1+/+和选取1+/–老鼠（黑色箭头）。底部行显示了顶部面板中装箱区域的更高放大视图。比例尺：10μm。
从睾丸切片的H&E染色中，我们发现生精小管选取1–/–小鼠通常比野生型小鼠小（图E） ●●●●。我们测量了圆形生精小管的直径，发现它们在选取1–/–小鼠（181.3±4.2μm）比野生型小鼠（203.7±1.1μm）和选取1+/–（206.2±5.2μm）小鼠（图D） ●●●●。生精小管中的细胞层大部分保存在选取1–/–小鼠，精原细胞无明显变化（图E、 白色箭头）、精母细胞（白色箭头）和圆形精子细胞（黑色箭头）。然而，精子靠近内腔中心选取1–/–小鼠有圆形细胞核（图E、 黑色箭头），腔中成熟精子较少。这表明选取1–/–在精子发生过程中，小鼠可能发生从圆形精子细胞到成熟精子的转变。
PICK1定位于圆形精子细胞中的高尔基衍生小泡。
为了了解PICK1缺陷是如何导致精子异常的，我们测定了PICK1在小鼠睾丸中的定位。我们发现PICK1在生精小管的圆形精子细胞中高度表达，这是用四氯化二氨基联苯胺（DAB）作为底物的免疫组织化学分析显示的（图A） ●●●●。免疫荧光染色证实了这一点，显示PICK1定位于圆形精子细胞的核周区域（图B） ●●●●。高倍镜显示，PICK1集中在细胞质的一端，部分与高尔基体的既定标记GM130重叠（图C） ●●●●。这表明PICK1可能参与精子细胞中高尔基体相关囊泡的贩运。为了证实这一点，我们用金颗粒标记PICK1，并在透射电镜下检查其在圆形精子细胞中的分布。PICK1在圆形精子细胞高尔基体和顶体之间的区域富集（图D） ●●●●。特别是，PICK1与高尔基衍生的前顶体颗粒相关（图D、 箭头）。
PICK1在精子细胞中高度表达，并定位于高尔基体周围。(A类)睾丸切片的DAB染色选取1+/+和选取1–/–老鼠。PICK1在圆形精子细胞中高度表达。背景染色选取1–/–老鼠的体重很低。(B类)PICK1、β-微管蛋白和DAPI的三重免疫荧光染色，标记细胞核。PICK1主要集中在圆形精子细胞的核周区。(C类)PICK1与高尔基体标记物GM130在睾丸切片（上部）和睾丸涂片染色（下部）的精子细胞中部分共定位。比例尺：10μm。(D类)PICK1位于高尔基体和顶体（ac）之间的高尔基体衍生的前顶体颗粒上。箭头表示标记为PICK1的金色颗粒。箭头表示核膜（ne）。右侧面板显示了左侧面板中方框区域的放大倍数较高的视图。比例尺：200 nm。
PICK1缺乏会导致顶体畸形。
由于顶体是由高尔基体产生的前顶体颗粒形成的，因此PICK1在高尔基体衍生囊泡中的定位促使我们研究PICK1与顶体形成之间的关系。我们使用抗顶体基质蛋白sp56的抗体作为标记物，标记精子发生不同阶段的顶体。在精子发生的早期阶段，即高尔基体阶段，PICK1（图A、 箭头，红色信号）位于顶体附近或部分与顶体重叠（图A、 箭头，绿色信号）。在帽状期，顶体生长为帽状结构（图A、 箭头）。PICK1仍然靠近顶体，但开始迁移到细胞核周围的其他区域（图A、 箭头）。随着精子发生的进行，PICK1进一步与顶体分离。在顶体阶段，顶体形成钩状结构，并向细胞核的一端移动（图A、 箭头），PICK1移动到另一端（图A、 箭头）。在成熟期，PICK1完全移动到顶体对面的末端，在精子发生结束时，PICK2与大多数其他细胞溶质成分一起在残体中被移除，并且在成熟精子中不存在（图A和数据未显示）。
顶体形成在选取1–/–老鼠。睾丸切片免疫染色。PICK1（红色）和顶体（绿色）由抗PICK1的豚鼠抗体和抗sp56的小鼠抗体标记。细胞核用DAPI（蓝色）标记。精子发生的四个阶段按进行顺序显示。(A类)野生型老鼠的图片。在高尔基体阶段和帽状阶段，PICK1信号（箭头）靠近顶体（箭头），但在顶体和成熟阶段，信号会移动到细胞核的两端。顶体从高尔基体阶段的单个颗粒生长到盖帽阶段覆盖细胞核头部的盖帽，再到顶体和成熟阶段细胞核一极的新月形结构。(B类)来自的图像选取1-击倒老鼠。PICK1信号在来自选取1–/–老鼠。精子细胞中存在多个sp56阳性结构选取1–/–小鼠整个精子发生过程。精子细胞细胞核的形态选取1+/+和选取1–/–小鼠高尔基体和帽状体阶段相似。然而，虽然选取1+/+小鼠在顶体和成熟期变长选取1–/–小鼠保持圆形。比例尺：10μm。右侧面板显示左侧面板中装箱区域的更高分辨率视图。
我们早在精子发生的高尔基体阶段就观察到顶体形成缺陷选取1–/–老鼠。在高尔基阶段，野生型小鼠中，来自高尔基体的前顶体颗粒融合成单个顶体结构，附着在细胞核的一端（图A、 箭头）。相比之下，我们在高尔基期精子细胞中发现了许多sp56阳性结构选取1–/–鼠标（图B、 箭头）。在帽状期，顶体扩张并形成帽状结构，覆盖正常精子细胞细胞核的一端。然而，帽状顶体结构在选取1–/–老鼠。相反，如sp56阳性染色所示，形成了几个大聚集体（图B） ●●●●。精子细胞中的多种sp56阳性结构选取1–/–小鼠在顶体和成熟阶段持续存在，而野生型小鼠的顶体变成新月形，并向伸长细胞核的一端移动（图、A和B）。在高尔基和帽状期，观察到的异常主要局限于顶体，细胞核没有明显异常（图B） ●●●●。然而，在精子发生的后期并非如此。精子细胞的细胞核选取1–/–小鼠在顶体和成熟期未能适当伸长，精子呈圆头状（图B） ●●●●。
TEM分析证实了顶体形成中的缺陷。在野生型小鼠中，顶体形成的4个阶段可以通过顶体生长的进展和相应的核膜增厚很容易区分（图A） ●●●●。虽然野生型小鼠精子细胞的细胞核一端存在单个顶体结构，但在选取1–/–高尔基阶段的精子细胞（图，A和B，箭头）。中没有明显的盖层结构选取1–/–以下帽状期的精子细胞（图B） ●●●●。相反，几个大的顶体颗粒在不同位置直接附着在核膜上（图B、 箭头）。肢端体碎片在精子发生的所有后续阶段持续存在（图B、 箭头）。同样明显的是，精子细胞核的伸长选取1–/–小鼠在精子发生的后期受损，导致细胞核呈圆形（图B） ●●●●。我们还检查了附睾中的精子。在野生型小鼠精子中，线粒体正确地包裹着轴丝，而在选取1–/–鼠标（图C） ●●●●。
顶体形成的TEM研究选取1–/–老鼠。精子细胞TEM图像显示精子发生的4个阶段。(A类)在野生型小鼠中，高尔基体阶段存在大量高尔基体衍生的前顶体颗粒，此时可以看到单个顶体颗粒附着在核膜上。顶体扁平并生长，在帽状期的细胞核一端形成帽状体。在随后的顶体和成熟阶段，顶体沿着核膜延伸。细胞核在顶体期开始伸长，在成熟期变为钩状。(B类)在选取1–/–箭头所示，在小鼠精子细胞的所有阶段都可以看到多个顶体泡状结构。精子细胞的细胞核选取1–/–小鼠在成熟期未能伸长并保持圆润。右侧面板显示左侧面板中装箱区域的更高放大视图。(C类)附睾头精子选取1+/+和选取1–/–老鼠。线粒体包裹着精子中段的轴丝选取1+/+小鼠，它们聚集在变形的细胞核周围选取1–/–老鼠。变形的顶体也显示出来。比例尺：1μm。ms，线粒体鞘。
PICK1与GOPC和CK2α′相互作用。
为了更全面地了解PICK1在顶体形成中的功能，以及PICK1缺乏如何导致球形精子症，我们搜索了与睾丸异常相似的敲除小鼠的文献选取1-击倒老鼠。我们发现，其他5种蛋白质缺乏的小鼠的表型与选取1-击倒老鼠。这些包括蛋白激酶2（CK2α′）的初级催化亚单位，一种调节细胞周期的丝氨酸/苏氨酸激酶和许多其他细胞功能(24); Hrb（也称为RAB或hRIP），一种参与病毒复制的HIV-1 Rev结合蛋白(25); GOPC，一种高尔基体相关PDZ和卷曲线圈基序的蛋白质，可能参与囊泡运输(26); 和透明带结合蛋白ZPBP1及其副产物ZPBP2(27). 为了研究这些基因之间的关系，我们进行了酵母双杂交分析，以测试这些基因的蛋白质相互作用。有趣的是，我们发现PICK1与GOPC和CK2α′结合（表). 我们没有观察到PICK1与Hrb、ZPBP1或ZPBP2之间的任何相互作用，也没有检测到GOPC、CK2α′、Hrb，ZPBC1和ZPBP2.之间的任何交互作用。在测定中还检测到GOPC和PICK1自身相互作用（表)，与先前关于GOPC和PICK1形成同源低聚物的报道一致(4,28–30). 我们使用液体β-半乳糖苷酶分析量化了相互作用强度，发现PICK1与GOPC和CK2α′的相互作用明显强于其与载体控制蛋白和其他非相互作用蛋白的相互作用（图A） ●●●●。哺乳动物细胞共免疫沉淀进一步证实了PICK1与GOPC以及PICK1和CK2α′的相互作用。在与GOPC、PICK1或CK2α′和PICK1共转染的HEK293T细胞中，GOPC和CK2α〃通过抗PICK1抗体与PICK1强烈共免疫沉淀（图、B和C）。
PICK1与GOPC和CK2α′相互作用，但不与Hrb、ZPBP1或ZPBP2相互作用。(A类)在液体选择性培养基上培养与PICK1和其他cDNA共转化的酵母，并以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活性。数据表示为平均值±SEM；n个= 4; **P（P）与Student’s确定的病媒控制相比<0.01t吨测试。(B类)GFP-GOPC与myc-PICK1或载体对照一起转染HEK293T细胞。PICK1由抗PICK1抗体免疫沉淀。Western blotting采用抗myc抗体（上部）或抗GFP抗体（下部）。GFP-GOPC和myc-PICK1在293T细胞中的表达显示在标记为“Input”的标记栏中。免疫沉淀产物表明，GFP-GOPC仅在PICK1存在时被拉下，而在载体控制中没有被拉下。(C类)GFP-CK2α′和myc-PICK1或空的myc载体共同转染到293T细胞中，并按所述进行免疫沉淀B类类似地，CK2α′与PICK1特异性共免疫沉淀。
PICK1和GOPC在高尔基体区域部分共定位，可能协调运输囊泡的形成。
据报道，GOPC定位于高尔基体(31,32). 我们用免疫荧光法检测了PICK1和GOPC在精子细胞中的定位。在圆形精子细胞中，PICK1信号与高尔基体区的GOPC信号部分重叠，以GM130标记（图A） ●●●●。为了评估PICK1、GOPC和高尔基体之间的关系，我们用brefeldin A（BFA）处理成年大鼠睾丸分离的生殖细胞，BFA是一种阻止高尔基体囊泡萌发的药物。用BFA短暂（5分钟）处理会破坏GM130的信号，但不会破坏TGN38的信号，TGN38是反式-高尔基网络（数据未显示）。这一结果与之前的观察结果一致，即短暂的BFA处理会破坏顺式-高尔基，但不是反式-高尔基网络(33). 有趣的是，5分钟的BFA处理导致PICK1和GOPC在反式-TGN38信号标志的高尔基网络，以及高尔基体外PICK1和GOPC颗粒的减少（图B） ●●●●。这可能是因为BFA阻止了囊泡萌发，并导致PICK1和GOPC在反式-高尔基网络。这一结果表明，PICK1和GOPC都参与了囊泡的萌发反式-高尔基网络。为了研究PICK1-GOPC相互作用的潜在功能意义，我们将PICK1和GOPC共转染到HEK293T细胞中。已知PICK1在HEK293T细胞中的表达形成小簇，可能代表贩运囊泡(11). 当GOPC与PICK1一起表达时，它们部分位于核周区域，PICK1簇的数量显著增加（图、C和D）。一些PICK1阳性簇也与GOPC信号共定位（图C、 箭头）。该观察结果表明GOPC与PICK1协同促进囊泡形成。
PICK1和GOPC在高尔基体周围部分共定位，GOPC增加PICK1簇。(A类)免疫荧光染色显示，PICK1（红色）和GOPC（绿色）均在圆形精子细胞的核周区表达，并与高尔基体标记物GM130（蓝色）部分共定位。(B类)如箭头所示，在大鼠睾丸涂片中，5 ng/μl BFA处理5分钟可使PICK1、GOPC和TGN38更好地共定位。(C类)GFP-PICK1和myc-GOPC或空myc载体共同转染293T细胞。GOPC增加了PICK1簇的数量，如箭头所示，其中一些簇与GOPC信号重叠。(D类)GOPC使携带PICK1自簇的HEK293T细胞百分比从载体对照组的55.0%±0.8%增加到76.1%±3.8%（平均值±SEM；n个=3个实验*P（P）< 0.05). (E类)将GST-GOPC与脂质体混合并进行高速离心。装载等量的颗粒和上清液，并通过SDS-PAGE进行溶解。GOPC与脂质体结合并出现在颗粒中（顶部）。在对照实验中，在不含脂质体的颗粒中未发现GOPC，GST本身也未与脂质体结合。比例尺：10μm。
PICK1通过其BAR域与脂质体结合，这种脂质结合能力与PICK1在HKE293T细胞中形成簇的能力相关(11). 与GOPC共表达后PICK1簇的数量增加促使我们检查GOPC是否也能与脂质体结合。纯化谷胱甘肽S公司-将转移酶融合（GST融合）GOPC蛋白与脂质体一起孵育，然后进行离心。与脂质体相关的蛋白质将与脂质体一起下降，并出现在颗粒中。我们发现GOPC确实与脂质体结合，因为GST-GOPC仅存在于脂质体存在的颗粒中（图E） ●●●●。这表明，通过与PICK1相互作用并与脂质体结合，GOPC可能促进PICK1与贩运囊泡的结合，并导致PICK1簇的形成增加（图C） ●●●●。
生精小管细胞凋亡增加选取1–/–老鼠。(A类)睾丸切片的TUNEL染色。只有少数凋亡的精原细胞，用红色荧光标记，可见于选取1+/+老鼠。相反，更多凋亡的生殖细胞，其中许多是精子细胞，可以在选取1–/–箭头所示的老鼠。比例尺：10μm。(B类)定量分析显示，睾丸生精小管中的凋亡细胞显著增加选取1–/–老鼠。数据表示为平均TUNEL阳性细胞/100细胞±SEM；n个=30个小管**P（P）< 0.01. (C类)PICK1在顶体形成中作用的模型。PICK1和GOPC促进从高尔基体到顶体的运输囊泡的形成。这两种蛋白都是从成熟顶体中提取出来的，可能会被回收用于多轮的囊泡运输。
Pick1生精小管中的凋亡增加–/–老鼠。
睾丸变小，精子数量减少，生精小管变小选取1–/–小鼠指出这些小鼠的生殖细胞可能会丢失。为了评估这种可能性，我们对睾丸进行了TUNEL染色，发现睾丸生精小管的凋亡显著增加选取1–/–鼠标（图A） ●●●●。生精小管中TUNEL阳性细胞的百分比从野生型小鼠的0.4%增加到选取1–/–鼠标（图B） ●●●●。更重要的是，虽然野生型小鼠的凋亡细胞主要是精原细胞，但在选取1–/–小鼠似乎是精子细胞（图A、 箭头所示），表明在精子发生的后期，细胞凋亡增加。细胞凋亡的增加与CK2α′缺陷小鼠相似(24)提示PICK1和CK2α′可能同时起作用。这一结果，再加上我们发现PICK1与CK2α′相互作用，支持了PICK1和CK2α'在精子发生中协同作用的观点。
讨论
顶体是由来源于反式-高尔基网络(21–23). 前顶体颗粒出芽、运输和融合最终形成顶体的分子机制基本上尚不清楚。在这项研究中，我们发现小鼠体内缺乏PICK1会导致男性不育，原因是精子数量减少，精子活力严重受损。精子的主要缺陷是顶体畸形、细胞核圆形和线粒体鞘排列异常，这也是人类疾病球形精子症的显著特征(20). PICK1蛋白在圆形精子细胞中高度表达，定位于高尔基体和顶体之间的小泡。此外，BFA阻断高尔基体囊泡出芽导致PICK1在反式-高尔基网络。这表明PICK1可能参与来自反式-高尔基体到顶体的网络，如前顶体颗粒的出芽、货物蛋白的分类或运输前顶体粒形成成熟顶体（图C） ●●●●。成熟顶体中不存在PICK1这一事实表明，PICK1可能在某一阶段从顶体前体颗粒中去除，并循环用于多轮囊泡运输。
虽然是选取1-敲除小鼠是顶体的碎片，PICK1不太可能直接参与前顶体颗粒的融合。PICK1的两个主要结构域PDZ结构域和BAR结构域均未参与膜融合。事实上，BAR结构域被认为通过主动弯曲脂质膜或感知膜弯曲而参与囊泡的出芽(17,34). 这表明PICK1可能参与了顶体前体颗粒的出芽反式-高尔基体网络。未能芽出前体颗粒可能会将顶体基质蛋白（如sp56）转移到其他细胞区室，这可能导致顶体碎裂。另一种解释是，缺乏PICK1可能间接导致前顶体颗粒融合不足。囊泡融合需要在囊泡和靶膜上正确组装融合机械(35). 已知PICK1的PDZ结构域结合膜蛋白并调节其运输(2). 因此，PICK1的缺失可能导致膜蛋白向顶体前体颗粒的错误排序。其中一些膜蛋白可能是融合机制的一部分，例如Hrb或某些可溶性NSF连接蛋白受体（SNARE）蛋白。这些融合成分的缺乏最终导致前顶体颗粒和顶体碎片的异常融合。
PICK1与GOPC相互作用，PICK1或GOPC缺乏均可导致球形精子症，这表明它们可能共同发挥作用。PICK1和GOPC均富集于高尔基地区，这一事实进一步支持了这一观点。GOPC与脂质体结合并增强PICK1在细胞内形成簇的能力，而BFA治疗在反式-高尔基体网络表明GOPC可能与PICK1协同作用，形成前顶体颗粒反式-高尔基网络（图C） ●●●●。有趣的是，据报道PICK1和GOPC都能调节神经元中AMPA受体的运输(2,36)这表明PICK1和GOPC也可能在神经元细胞的相同贩运机制中协同工作。还应注意的是，虽然PICK1和GOPC在高尔基体区域周围重叠，但当远离高尔基体装置时，它们往往会分离。这表明，虽然PICK1和GOPC可能在高尔基衍生小泡的早期形成中协调，但它们在随后的小泡运输中的作用可能不同。这可能解释了选取1-和墨西哥政府-击倒老鼠。例如选取1-敲除小鼠（图A） ，但在墨西哥政府-基因敲除小鼠(26).
除GOPC外，PICK1还与CK2α′相互作用，CK2α’的缺失也导致顶体畸形和球形精子症(24,26). PICK1和CK2α′缺陷都会导致生殖细胞凋亡，这表明它们可能共同发挥作用。然而，它们如何一起发挥作用仍是一个悬而未决的问题。我们的初步数据表明，CK2α′不影响PICK1的定位或聚类（我们未发表的观察结果）。其他可能性，例如PICK1调节激酶活性或CK2α′的位置，需要在未来进行测试。PICK1不与Hrb、ZPBP1和ZPBP2相互作用，但其缺陷导致相似的表型，这一发现表明这些蛋白可能参与顶体形成的不同步骤。例如，Hrb和ZPBP可以通过PICK1介导的前顶体颗粒贩运作为货物运输。鉴定顶体形成所需的其他基因及其产物，并阐明它们的功能关系，可以为我们了解顶体形成的分子机制以及一般的囊泡运输提供更完整的图片。
方法
cDNA克隆和蛋白质纯化。
本研究中使用的所有PICK1结构均已在前面描述(11). GOPC cDNA克隆来自Z.Yue（美国纽约西奈山医学院）和I.G.Macara（美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔弗吉尼亚大学）(28,37). 使用BamHI将它们在框架内亚克隆到pEGFP-C1和pGEX4T2载体，并使用SalI/NotI位点将其亚克隆到p DBLeu和pPC86载体。CK2α′、Hrb、ZPBP1和ZPBP2 cDNA从RZPD德国基因组研究资源中心获得，并使用SalI/NotI位点在框架内亚克隆到pEGFP-C3、pPC97或pDBLeu和pPC86载体中。为了生产融合蛋白，将cDNA构建物转化为大肠杆菌BL21细胞并用异丙基-β诱导-d日-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。根据制造商的说明，GST融合蛋白通过谷胱甘肽Sepharose 4B（Amersham Biosciences；GE Healthcare）亲和纯化。融合蛋白浓度由考马斯分析法测定（皮尔斯；赛默科学公司）。
抗体。
如前所述，产生豚鼠抗PICK1多克隆抗体和兔抗GFP多克隆抗体(18). 小鼠抗myc抗体（9E10）和小鼠抗β-微管蛋白抗体（E7）购自发育研究杂交瘤库。小鼠抗GM130抗体和小鼠抗TGN38抗体购自BD Biosciences。小鼠抗p56抗体来自QED Bioscience Inc.。小鼠抗细胞色素氧化酶亚基I来自分子探针（Invitrogen）。兔抗GOPC抗体来自Abcam。罗丹明红X结合二级抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.。Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647结合二级抗原来自Molecular Probes（Invitrogen）。HRP标记的二级抗体购自Amersham Bioscience（GE Healthcare）。
附睾精子计数和形态分类。
附睾精子的数量通过参考文献中所述的方法进行测定。38简单地说，从成年小鼠上解剖附睾尾。让精子在37°C、5%CO的条件下从附睾尾切口渗出30分钟2.然后将孵化的精子提取液稀释至1:500，并转移至血细胞仪进行计数。将未固定的精子涂布在预涂载玻片上进行形态学观察或免疫染色。根据参考文献对畸形进行分类。38.动物的使用得到香港科技大学研究实践委员会动物研究小组的批准。
组织学。
成年雄性C57BL/6小鼠经左心室灌注10%中性缓冲福尔马林。对睾丸和附睾尾进行解剖，固定后，通过分级乙醇系列脱水，然后包埋在石蜡中。切片（5μm）在切片机上切割（Shandon Finesse；Thermo Fisher Scientific）。使用MetaMorph 7.0软件（Universal Imaging；Molecular Devices）从H&E染色睾丸石蜡切片测量生精小管圆形截面的直径。
睾丸涂片准备。
睾丸涂片根据参考文献制备。39简单地说，解剖成年雄性Sprague-Dawley大鼠或C57BL/6小鼠的睾丸，并在富含Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液（EKRB）中冲洗。切除睾丸，用1 mg/ml胶原酶IA（Sigma-Aldrich）孵育，然后用0.25 mg/ml胰蛋白酶和1μg/ml DNA酶I孵育。然后用500克在4°C下保持10分钟。将颗粒洗涤并重新悬浮在添加10%FBS的EKRB中。将悬浮液分散在聚乙烯上-我-赖氨酸涂层盖玻片并在EKRB中培养。未经处理或BFA处理（5 ng/μl，5分钟，37°C）的细胞进一步进行免疫标记。
免疫组织化学。
睾丸石蜡切片脱蜡并复水。然后，如参考文献所述进行抗原回收。40免疫染色如前所述(18). 简单地说，将样品封闭、透化，然后与一级抗体在3%正常驴血清中在4°C下孵育过夜。清洗后，在室温下应用次级抗体至少1小时。然后在室温下用0.5μg/ml DAPI处理载玻片15分钟，在PBS中清洗，安装在×40或×60平面Apochro油透镜（1.4 NA；尼康仪器公司）下观察。根据制造商推荐的方案（ABC试剂盒；Vector Laboratories）进行DAB染色。在×20和×40 LC平面F1透镜下观察DAB幻灯片。在所有的免疫染色方案中，非特异性染色水平是通过省略一级抗体的培养步骤来确定的。
透射电镜。
TEM按照之前的报告进行(41). 简单地说，成年小鼠的睾丸或附睾通过左心室灌注用2%戊二醛或0.25%戊二醛加1.5%多聚甲醛固定。这些组织被切成小块，脱水，然后包埋在Spurr树脂或Lowicryl树脂HM20（电子显微镜科学）中。超薄切片（70 nm）在Ultratome（徕卡，Reichert Ultracuts）上切割。用醋酸铀酰水溶液/柠檬酸铅直接对枝条切片进行后染色。HM20切片用兔抗PICK1抗体进行免疫标记，然后用10nm金粒子偶联二级抗体（电子显微镜科学）进行后染色。使用日立H-7650 TEM在80 kV电压下进行观察。照片由日立AMT XR-40 CCD相机拍摄。
酵母检测。
为了测试PICK1、GOPC、Hrb、CK2α′、ZPBP1和ZPBP2之间的相互作用，将相应的DNA构建体在框架中亚克隆到含有GAL4激活结构域（AD）的pPC86载体或含有GAL4 DNA结合结构域（BD）的pPC97载体和pDBLeu载体中。将构建物共转化为酵母细胞（HF7c或PJ69），并在双负板上生长（缺乏亮氨酸、色氨酸）。选择阳性克隆并在三分钟平板上进行生长测试（缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸或腺嘌呤），以测试蛋白质相互作用。根据参考文献进行β-半乳糖苷酶活性的定量测定。42简单地说，二倍体在中对数期被造粒和破碎。裂解物与o个-硝基苯β-d日-吡喃半乳糖苷（ONPG）。延时(T型)和外径420已记录。β-半乳糖苷酶活性(A类)用nmol/min/mg表示，根据以下公式计算：A类=1000×外径420/(T型×V（V）×外径600)，其中V（V）代表二倍体培养物的体积。
293T细胞培养、共免疫沉淀、染色和定量。
如前所述进行HEK293T细胞培养、共免疫沉淀和免疫染色(11). 简言之，通过磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞。转染后36–48小时，对细胞进行裂解，然后在4°C下用豚鼠抗PICK1多克隆抗体和蛋白A珠培养细胞。将树脂洗涤，用×1 SDS样品缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE分析，并用一级抗体免疫印迹，然后用HRP偶联的二级抗体免疫印迹（Amersham Bioscience；GE Healthcare）。为了进行免疫染色，HEK293T细胞在转染后36–48小时被固定，渗透、封闭，在室温下与一级抗体孵育1小时，然后与荧光二级抗体孵化1小时。在每次实验中，每组拍摄15张照片。研究人员在不了解该组的情况下记录了双转染HEK293T细胞的总数和带有PICK1簇的转染细胞的数量。
脂质结合试验。
如前所述进行脂质结合试验(11). 具体来说，融合蛋白与脑脂提取物孵育，然后在140000下旋转克在4°C下保持15分钟。上清液和颗粒蛋白进行SDS-PAGE，并通过考马斯染色法进行可视化。
TUNEL染色。
根据制造商推荐的方案（罗氏应用科学公司）进行TUNEL染色。简言之，睾丸石蜡切片脱蜡、复水和渗透。每个样品在37°C的温度下与TUNEL混合物在黑暗中孵育1小时。阳性对照组在TUNEL标记前用3 U/ml DNase I处理20分钟，而阴性对照组在标记期间不使用末端转移酶。照片是在相同的曝光时间下拍摄的。测定每100个生殖细胞中TUNEL阳性细胞的数量。
统计。
所有数据均以平均值±SEM表示。配对组之间的统计差异通过Student’s测量t吨用配对双尾分布进行测试。A类P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
致谢
我们感谢W.Tung、K.Lai和F.Kwok提供了出色的技术援助；Z.Mao、X.Cao和W.Chau帮助收集小鼠交配数据；和D.Banfield对手稿进行批判性阅读。本文所述的工作部分得到了中华人民共和国香港特别行政区研究资助委员会的资助（HKUST6429/06M、N_HKUST605/07、HKUST6/CRF/08和663107）。
脚注
利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。
使用的非标准缩写：AMPA，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸；BAR、Bin/两性激素/Rvs；BFA、布雷菲尔丁A；蛋白激酶2的初级催化亚基CK2α′；二氨基联苯胺四氯化氢；GOPC、Golgi相关PDZ和线圈-线圈基序蛋白；GST、谷胱甘肽S公司-转移酶；Hrb、HIV-1 Rev结合蛋白；ICA69、胰岛细胞自身抗原69kDa；PDZ，突触后密度95，椎间盘大，小带闭塞-1；PICK1，与C激酶1相互作用的蛋白；TEM、透射电子显微镜/显微镜；透明带结合蛋白。
本文引文： 临床杂志。投资。 119:802–812 (2009). doi:10.11172/JCI36230
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