B细胞易位基因2提高HeLa细胞对阿霉素诱导氧化剂损坏^*

摘要

TIS21型(12-O（运行）-t吨十四烷基佛波醇-13-乙酸酯-我可导电的秒顺序21)首先被确定为早期基因(1)小鼠3T3成纤维细胞用12-O（运行）-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯(2). 从那时起，PC3(第页嗜酸性细胞瘤c（c）厄尔三)被隔离为神经生长因子激活的即刻早期反应基因大鼠PC12细胞神经元分化的开始(三). 人类同源物TIS21，命名为BTG2（B细胞易位基因2），是从一个cDNA中克隆的与DNA损伤相关的人类淋巴母细胞基因文库反应，在其5′-侧翼含有p53反应元件（-74至-112）区域(4).

我们之前报道过TIS21在胸腺癌中的表达较低在SV40大T抗原转基因小鼠中发育，但在正常小鼠中较高胸腺，提示胸腺中TIS21的抗癌活性(5). TIS21的表达肾癌中肾近端小管和前列腺腺泡也丢失前列腺癌变的早期阶段(6,7)分别是。一致有了这些发现，博伊科等。(8)最近确定的BTG2作为一种肿瘤抑制因子，表明BTG2是p53依赖性抑制小鼠和人成纤维细胞的增殖BTG2的阻遏调节cyclin D1和cyclin E以及pRB的磷酸化，从而诱导肿瘤原代人成纤维细胞的转化。已知TIS21也起作用在癌细胞中独立于pRB和p53调节G₁/S逮捕和G₂/通过抑制细胞周期蛋白E和cdk4的合成来阻止M(9)以及交互与细胞周期蛋白B1和cdk1复合物(10)分别是。此外，TIS21持续表达诱导线粒体膜丢失U937细胞的潜在差异(11)和转染TIS21基因对Huh7肝癌细胞的作用显著降低体内和在体外通过抑制反馈调节细胞周期蛋白B1和FoxM1转录因子(11)，以及的表达式人肝癌组织中BTG2的含量远低于周围组织。总的来说，这些发现表明TIS21控制细胞过程一种细胞分裂周期抑制剂和肿瘤抑制剂，从而逃避独立于p53的癌症发展。

活性氧水平（ROS）²受控制通过多个相互作用的组件。其中超氧化物歧化酶（SOD）、，谷胱甘肽过氧化物酶1（GPx）和过氧化氢酶是主要的抗氧化剂哺乳动物组织中的酶(12,13). SOD催化歧化将超氧阴离子转化为过氧化氢，过氧化氢通过过氧化氢酶和GPx。在哺乳动物中，SOD至少有三种形式：细胞溶质CuZnSOD、细胞外ECSOD和线粒体MnSOD。MnSOD敲除小鼠出生后18天内死亡，表明MnSOD是一种必需的酶(14). 另一方面，它是据报道，MnSOD具有相反的作用，例如，过度表达SOD含量大肠杆菌导致对百草枯与高氧(15),以及由明显增加的H（H）₂O（运行）₂(16). 此外，人前列腺中MnSOD的过度表达表明其对ROS的敏感性更高癌细胞(17).

虽然已经知道BTG2的表达^{/TIS21/PC3型}在化疗期间诱导多种癌细胞凋亡(18–20),BTG2的作用^{/TIS21/PC3型}细胞内死亡尚待阐明。尽管大量研究始终表明BTG2起到抑癌作用，BTG2^–/–胚胎干细胞与BTG2相比，对DOXO更敏感^+/+胚胎干细胞(4). 据我们所知，目前还没有关于TIS21如何^/基站2诱发癌症细胞对化疗反应的凋亡。因此，我们在本研究中，研究了BTG2在DOXO诱导癌细胞凋亡并发现BTG2增强DOXO通过抗氧化酶失衡诱导氧化损伤作为细胞死亡过程中的促凋亡基因。

实验程序

细胞培养-HeLa细胞在Dulbecco改良的添加热灭活10%（v/v）胎牛血清的Eagle's培养基在含有5%CO的增湿大气中₂37°C时。这个培养基每隔一天更换一次。所有阿霉素治疗均为在培养基中进行（Dulbecco改良的Eagle培养基）含10%（v/v）胎牛血清。治疗前取出培养基并用新鲜培养基替换。

试剂—N个-乙酰-我-半胱氨酸，PEG-过氧化氢酶和邻苯三酚购自Sigma-Aldrich。阿霉素来自Tocris Bioscience。

Hoechst染料核染色-染色是按照描述(21). 简言之，对照组和处理过的细胞（1μg/ml阿霉素，24小时）用3.7%（v/v）多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水中放置10分钟室温下，用0.1%Triton X-100渗透10分钟温度。固定细胞用Hoechst 33258染色5分钟，清洗，然后通过荧光显微镜检查（340-nm激发和510-nm屏障过滤器）。凋亡细胞通过存在高度浓缩或碎裂的核。

细胞裂解液的制备和 西部印记分析-为了制备总细胞裂解物，将细胞冲洗入冰镇磷酸盐缓冲盐水，在50m内溶解米Tris，pH 7.4，含150m米氯化钠，1米米EDTA，1米米苯甲基磺酰氟、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮氨酸肽、1μg/ml胃蛋白酶抑制素，1米米氟化钠，1米米原钒酸钠，0.25%脱氧胆酸钠和1%诺奈德P-40。上清液为在10000×克持续10分钟。通过电泳对50μg等分蛋白质样品进行分级然后转移到硝化纤维素膜上。这些膜是用一级抗体和辣根过氧化物酶偶联物进行免疫印迹抗鼠IgG。免疫印迹蛋白通过化学发光ECL系统（Amersham Biosciences）。初级抗体从以下来源购买：抗层粘连A/C和抗HA细胞信号；Zymed Laboratories Inc.的抗PARP。；抗MnSOD、抗GPx、，来自实验室前沿的抗过氧化氢酶；圣克鲁斯抗α-微管蛋白生物技术。

慢病毒shRNA的产生和体外转导-PLKO.1系列表达针对BTG2的shRNA的慢病毒载体购自Open生物系统。对于BTG2，获得了五个预制结构，并对其进行了测试确定能够使用以下方法实现高效击倒的构造逆转录聚合酶链反应。293T细胞瞬时产生慢病毒载体库shRNA构建物与pHR8.2R和pCMV-VSV-G辅助物的共转染使用脂多糖胺构建。30小时后收集上清液通过0.22微米过滤器（Millipore）过滤，以去除任何非粘着物293T细胞。接下来是HeLa细胞（5×10⁴直径35mm培养皿）用1ml含病毒上清液转导补充8μg聚brene。培养基更换1天感染后，用新鲜培养基培养2天。

逆转录聚合酶链反应-按标准制备细胞总RNA基于三唑的方法。1μg总RNA被反转录oligo（dT），使用Superscript II逆转录酶试剂盒（Invitrogen），根据制造商的协议。应用RT产品（1/50体积）至PCR。BTG2（175 bp）和3-磷酸甘油醛的cDNA片段脱氢酶（195bp）用以下引物扩增：sense，5′-CGAGAGGCTTAAGGTCTTC-3′和反义，BTG2的5′-CTGGCTGTGCCGATCTGG-3′；和感觉，5′-CACATGGAGAAGGCTGGGG-3′和反义，3-磷酸甘油醛的5′-CAAAGTTGTCATGGACC-3′脱氢酶。

细胞内过氧化氢和超氧阴离子的测定浓度-细胞内H₂O（运行）₂通过荧光激活细胞分选仪分析测定浓度使用50μ米2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H）₂-DCFDA）（D-399；分子探针）在细胞培养系统中作为描述(22). 简而言之用H预处理细胞₂-细胞前10分钟DCFDA收获。H（H）₂O（运行）₂使用FACScan（BD）确定生成生物科学）通过测量二氯二氢荧光素的荧光H氧化引起的₂-DCFDA。硝基蓝四氮唑盐（NBT）与细胞内反应时形成不溶于水的蓝色甲霜超氧物，显示细胞内超氧物形成的程度。如前所述，使用NBT进行超氧化物的显色检测(23). 简言之，控制单元用50μ米邻苯三酚孵育3h在Hanks的平衡盐溶液中加入NBT（1.6 mg/ml）。清洗后甲醇、甲醛晶体用560μl 2萃取米KOH和480μl二甲基亚砜。在575 nm处测量吸光度。结果是表示为A类₅₇₅从10获得⁶细胞。

腺病毒载体的构建与应用-腺病毒载体如前所述制备表达TIS21（Ad-TIS21(24). 总之，TIS21的cDNA插入复制缺陷型E1和E3-腺病毒载体在293人肾上皮细胞中转染并扩增。携带细菌β-半乳糖苷酶（Ad-β-Gal）的腺病毒为对照实验做准备。

MnSOD活性测定-为了测量MnSOD活性，细胞用橡皮警察收集，并在20米的寒冷条件下发出声音米HEPES公司缓冲液，pH 7.2（EGTA 1 m米，210米米甘露醇和70米米蔗糖），然后在1500×克在4°C下保持5分钟。随后将上清液离心至10000×克在4°C下保持15分钟。得到的颗粒是用含有0.1%Triton X-100的HEPES缓冲液均质使用超氧化物歧化酶检测试剂盒（SOD-560；应用生物分析实验室）。的活动在2 m的浓度下测量MnSOD米氰化钾CuZnSOD抑制剂。

统计-结果表示为平均值±S.D.分别进行了三到四个实验。成对学生的t吨在指示的地方进行测试，以及第页<0.05是被认为是重要的。

结果

阿霉素诱导的细胞死亡基站2^/TIS21型 表达式-阿霉素是各种肿瘤中已知的化疗药物和凋亡诱导剂包括HeLa细胞的细胞(25). 据报道，当HeLa细胞用DOXO处理，染色质凝聚，Hoechst染色证明染色(图1A类),PARP（caspase-3和-7底物）和层粘连蛋白A/C（底物caspase 6）的表达呈剂量依赖性(图1B类). 收件人研究BTG2可能参与DOXO诱导的细胞死亡HeLa细胞暴露于DOXO 24小时，层粘连蛋白的时间依赖性裂解A/C公司(图1D类)带有在12小时内观察到BTG2表达的同时增加(图1C)，建议BTG2可能在DOXO诱导的细胞死亡过程中发挥作用。

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图1。

DOXO诱导的细胞死亡伴BTG2^/TIS21型表达式。 A类，免疫细胞化学显示染色质凝聚仅在DOXO处理的细胞中。HeLa细胞用DMSO或DOXO（1.0μg/ml）24小时，细胞核用Hoechst染料染色。B类，免疫印迹分析显示层粘连蛋白A/C和PARP降解通过DOXO治疗。用指示浓度的DOXO 24小时后，PARP和层粘连蛋白A/C（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3底物）的裂解以及caspase-7和caspase-6）以及更多的DOXO。α-管蛋白作为负荷对照进行检查。C，RT-PCR分析显示基站2^/TIS21型DOXO治疗12小时后的mRNA表达。HeLa细胞暴露至1.0μg/ml的DOXO，持续指定时间。D类，时间确认和浓度的DOXO处理诱导HeLa细胞死亡。HeLa细胞暴露于1.0μg/ml的DOXO达指定时间。椎板A/C断裂通过免疫印迹分析观察DOXO治疗12小时后的情况。数据表示四个独立实验的典型结果。水溶液。,蛋白质印迹。

基站2^/组织21DOXO增强诱导的人类癌症细胞死亡单元格行-为了研究BTG2在DOXO诱导的细胞死亡中的作用，HeLa细胞被HA标记的Ad-TIS21病毒或Ad-β-Gal感染控件。Ad-TIS21病毒感染细胞（10–100 m.o.i.）染色质凝集的细胞数量显著增加与对照组相比，对DOXO治疗的反应(图2A类). 基于中的数据图2A类,HeLa细胞感染病毒（50 m.o.i.），然后用DOXO治疗，通过Western blot分析检测TIS21的表达抗HA抗体。如所示图。2B类、Ad-TIS21增强了DOXO诱导的PARP和层粘连蛋白A/C与对照组比较。然而，TIS21本身并没有用DOXO处理细胞时诱导分裂。要确认TIS21在DOXO诱导的细胞死亡中的促凋亡活性，内源性基站2^/组织21通过使用sh-BTG2下调^/TIS21型RNA。因此，HeLa细胞被BTG2 shRNA（H4）慢病毒感染或H5）或空载体作为对照，击倒效率为通过RT-PCR测定。如所示图。2C，RT-PCR显示BTG2 mRNA在H4或H5感染细胞，而甘油醛-3-磷酸的表达脱氢酶不受影响。sh-BTG2或对照细胞感染慢病毒载体没有显示任何细胞死亡的迹象；然而，感染H4或H5显著降低了DOXO对层粘连蛋白A/C(图2C,右侧面板).图2(A类--C类)清楚地显示了在DOXO诱导HeLa细胞死亡期间的BTG2。调查结果是意外，因为BTG2^–/–显示ES细胞对DOXO诱导的细胞死亡的敏感性增加(4). 调查是否BTG2对DOXO诱导的细胞死亡的影响在HeLa中不是一种局限的现象细胞，人肝细胞癌细胞系Huh7、HepG2和Hep3B感染Ad-TIS21病毒，然后用IC治疗₅₀DOXO浓度(26)至诱导细胞凋亡。图。2D类表明TIS21增强了DOXO诱导的PARP和层粘连蛋白A/C与Ad-β-Gal的比较。这些发现明确证明TIS21不仅在HeLa细胞中具有促凋亡作用，而且在肝癌细胞系中。

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图2。

基站2^/TIS21型增强DOXO诱导的人类肿瘤细胞死亡细胞系。 A类HeLa细胞染色质凝集增加用DOXO和Ad-TIS21病毒治疗后。HeLa细胞被感染表达HA标记BTG2的腺病毒载体^/TIS21型（Ad-TIS21-HA）或β-半乳糖苷酶（Ad-β-Gal）36小时，然后用DMSO或DOXO（1.0μg/ml）12 h。进行Hoechst染色对染色质凝集的细胞进行计数，第页< 0.05与DOXO和Ad-β-Gal处理的细胞；#，第页< 0.05与DOXO和Ad-BTG2^/TIS21型（10 m.o.i.）-处理细胞。数据表示四个独立变量的平均值和标准偏差实验。B类，Western blot分析显示卵裂增加感染Ad-TIS21病毒（50与单独使用DOXO或DMSO处理12小时的细胞相比。抗-HA显示TIS21的表达水平。C，抑制短发夹-BTG2慢病毒感染诱导DOXO细胞死亡序列。HeLa细胞被空载体感染(反对的论点)或sh-BTG2病毒(H4型和H5型)，以及BTG2表达的敲除然后通过RT-PCR和Western blot分析。BTG2 mRNA水平的RT-PCR分析归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA水平，数据底部显示了水平。注意BTG2的抑制sh-RNA（H5）表达超过60%。D类，通过增强细胞死亡肝癌细胞中Ad-TIS21感染。Huh7、HepG2和Hep3B细胞感染Ad-TIS21病毒，然后用DMSO或DOXO（1.0μg/ml）持续36 h蛋白质印迹。注意PARP和层粘连A/C裂解增加。数据代表了四个独立实验的典型结果。

基站2^/TIS21型上调发电量H（H）₂O（运行）₂DOXO诱发-根据报告DOXO在细胞内产生ROS(27)，我们首先检查了DOXO是否确实参与HeLa细胞的凋亡过程产生ROS。正如预期的那样，DOXO处理的HeLa细胞中的ROS增加与对照组相比(图。三A类). 进一步确认ROS参与过程中，用NAC（0–10 m）预处理HeLa细胞米)，一个众所周知的H₂O（运行）₂清道夫，然后细胞凋亡由DOXO诱导。图。三B类表明细胞的预处理NAC剂量依赖性地抑制DOXO诱导的层粘连蛋白A/C的裂解，表明活性氧确实与细胞死亡有关。NAC预处理也导致染色质浓缩细胞数量的剂量依赖性减少（未显示数据）。调查ROS可能参与BTG2在DOXO诱导的细胞死亡过程中的促凋亡功能，我们首先研究了TIS21的作用^/基站2超氧化物过表达阴离子发生器诱导的细胞死亡(28). HeLa细胞用邻苯三酚（PYRO；超氧阴离子发生器）培养，然后NBT检测了产生的超氧阴离子的还原作用。如所示图3C，NBT减少取决于PYRO的浓度(上部面板)、和超氧阴离子发生器介导的PARP裂解显著减少通过NAC预处理(下部面板)，建议体内PYRO诱导的超氧阴离子转化为H₂O（运行）₂.当HeLa细胞首次感染50 m.o.i Ad-TIS21或Ad-β-Gal，然后用PYRO（50μ米)使用或不使用NAC 48小时（5米米)预处理后，TIS21增强了PYRO诱导的细胞死亡，而NAC预处理对增强的抑制作用。这一发现非常有力支持TIS21使用H₂O（运行）₂调节PYRO诱导的细胞死亡(图3D类).因此，采用BTG2 shRNA（H4和H5）和空载体作为对照(反对的论点)然后我们检查了BTG2对DOXO诱导的细胞死亡与H₂O（运行）₂生成。如所示图。三电子，DOXO诱导的H₂O（运行）₂生产与对照组相比，H4和H5感染减少，表明H上调₂O（运行）₂由BTG2生成。收件人确认BTG2的效果^/TIS21型细胞内的生成H（H）₂O（运行）₂，细胞被Ad-TIS21或Ad-β-Gal感染然后用DOXO处理诱导细胞凋亡。治疗具有DOXO的细胞显著增加了H（H）₂O（运行）₂，并且TIS21的过度表达进一步增强H₂O（运行）₂与Ad-β-Gal的水平相比表达式(图3F类).TIS21本身并不影响H的生成₂O（运行）₂但是显著增强DOXO诱导的H₂O（运行）₂生成。NAC预处理Ad-TIS21或Ad-β-Gal感染细胞抑制DOXO诱导的H₂O（运行）₂生成，表示TIS21上调DOXO诱导的H₂O（运行）₂生产。

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图3。

基站2^/TIS21型由阿霉素治疗。 A类，荧光激活细胞分选机分析显示DOXO在HeLa细胞中诱导ROS。用DOXO（1.0μg/ml）12 h，ROS产生的DCFDA荧光为通过流式细胞术测量。B类，Western blot分析显示NAC预处理抑制DOXO诱导的细胞死亡。HeLa细胞用或不用指定浓度的NAC和随后用DOXO（1.0μg/ml）处理24小时。注意NAC降低层粘连蛋白A/C的断裂。C，抑制邻苯三酚通过NAC诱导细胞死亡。上部面板，HeLa细胞与指示浓度的PYRO、超氧化物发生器、NBT持续3 h，然后通过以下方法检测被超氧阴离子还原的NBT测量A类₅₇₅. ⋆,第页< 0.05与PYRO（0μ米); #,第页< 0.05与PYRO（50μ米).下部面板、HeLa细胞用PYRO（50μ米)或NAC（5米米)持续48小时，然后通过Western检测PARP的切割印迹分析。注意通过以下方法显著抑制PYRO诱导的细胞死亡NAC公司。D类，TIS21增强PYRO诱导的细胞死亡，而NAC抑制细胞死亡。HeLa细胞感染50 m.o.i Ad-TIS21或以Ad-β-Gal为对照，然后用带有PYRO（50μ米)使用或不使用NAC（5米米)预处理。上部面板，Western印迹至测定PARP的裂解。下部面板，活细胞台盼蓝染色法测定。数据表明抑制了NAC引起的PYRO诱导的变化，表明体内的转换PYRO诱导的超氧化物转化为H₂O（运行）₂.⋆，第页<0.05与PYRO处理，Ad-β-Gal感染；#，第页<0.05与PYRO治疗的Ad-TIS21感染。电子，抑制DOXO诱导sh-BTG2 RNA产生ROS。感染shRNA、H4的HeLa细胞和H5、病毒或空载体(反对的论点)暴露于1.0μg/mlDOXO持续12 h，通过流量测量ROS产生的DCFDA荧光细胞术，第页< 0.05与与DOXO对抗治疗。F类，通过Ad-TIS21增强DOXO诱导的ROS生成NAC预处理的感染和有效抑制。HeLa细胞感染50 m.o.i Ad-TIS21或Ad-β-Gal作为对照，以及然后用二甲基亚砜或DOXO（1.0μg/ml），使用或不使用NAC（5 m米)预处理。DCFDA公司用流式细胞术测定ROS产生的荧光，第页< 0.05与DOXO治疗和Ad-β-Gal感染细胞。数据代表典型实验的结果或平均值与四个独立实验的标准偏差。

NAC废除BTG2的影响^/TIS21型关于DOXO诱导的细胞 死亡-接下来，我们研究了BTG2是否增加了细胞死亡由细胞内H调节₂O（运行）₂因此，HeLa细胞感染Ad-β-Gal或Ad-TIS21的患者在有DOXO存在的情况下暴露于DOXO通过染色质凝集监测细胞死亡。NAC公司预处理消除了细胞感染Ad-β-Gal或Ad-TIS21，尽管Ad-TIS21-感染与Ad-β-Gal感染相比，染色质凝集增加(图4A类).同时，Ad-TIS21后层粘连A/C的断裂增强感染，与Ad-β-Gal和NAC预处理相比显著消除了Ad-TIS21的作用(图4B类). 数据强烈建议H₂O（运行）₂一代人可能是主要的BTG2下游介体^/TIS21型当它起到促凋亡作用时DOXO诱导细胞死亡的分子。

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图4。

NAC废除了BTG2的作用^/TIS21型关于DOXO诱导的细胞死亡。 A类，NAC抑制DOXO诱导的染色质凝聚。希拉牌手表感染50 m.o.i Ad-TIS21或Ad-β-Gal的细胞暴露于DOXO（1.0μg/ml），加或不加NAC（5 m）12 h米)预处理。Hoechst后计数染色质凝集的细胞染色，第页< 0.05与Ad-TIS21感染只有DOXO。B类Western blot分析显示层粘连蛋白抑制用NAC预处理A/C裂解。数据代表平均值具有标准偏差和三个独立的典型结果实验。

基站2^/TIS21型MnSOD的上调表达，而非其他抗氧化酶-为了研究H显著增加₂O（运行）₂在DOXO处理的HeLa中我们首先检测了DOXO对抗氧化剂表达的影响酶。用DOXO（0–1.0μg/ml）处理HeLa细胞12小时MnSOD和CuZnSOD的表达呈剂量依赖性上调，而GPx、过氧化氢酶和α-微管蛋白的水平则没有完全改变了(图。5A类)，强烈表明H（H）₂O（运行）₂DOXO治疗可能是由于抗氧化酶的协同表达。调查DOXO处理后MnSOD和CuZnSOD的上调是由于BTG2增加^/TIS21型在细胞中，HeLa细胞被感染Ad-TIS21和抗氧化酶的表达由Western印迹分析。如所示图。5B类Ad-TIS21本身的感染增加了MnSODTIS21增强了DOXO对表达增加的影响MnSOD，其他酶无任何变化。尽管表达了DOXO处理也上调了CuZnSOD的表达，但没有由TIS21规定。同时，MnSOD的活性与蛋白质水平(图。5C). 所有数据都强烈表明H的上调₂O（运行）₂在DOXO处理的HeLa细胞中可能由BTG2引起^/组织21-介导的抗氧化剂失衡酶表达。此外，H4和H5 sh-BTG2阻止了TIS21对DOXO诱导MnSOD表达的影响(图5D类)，表示DOXO诱导的MnSOD表达可能通过基站2^/TIS21型.验证以下假设：H（H）₂O（运行）₂在DOXO处理的细胞中可能是由于抗氧化酶协调表达失衡，我们研究PEG-过氧化氢酶，膜渗透形式(29)，可以保护细胞免受DOXO诱导的细胞凋亡。因此，用PEG-过氧化氢酶预处理HeLa细胞（0–1000单位/ml）在DOXO治疗前12小时，以平衡然后通过以下方法检测MnSOD的表达和DOXO诱导的细胞死亡免疫印迹分析。PEG-过氧化氢酶抑制层粘连蛋白A/C诱导的断裂通过DOXO处理(图。5电子). 这些数据表明BTG2^/TIS21型可以通过上调MnSOD增加DOXO诱导的细胞死亡，从而导致抗氧化酶与H增加₂O（运行）₂因此，增加了MnSOD/过氧化氢酶似乎增强了DOXO诱导的细胞死亡。

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图5。

基站2^/TIS21型MnSOD的表达及其活性增强，但不是其他抗氧化酶。 A类，Western blot分析显示抗氧化酶在HeLa细胞中的表达DOXO的指示浓度持续12小时。注意MnSOD和CuZnSOD对DOXO处理有反应，但对GPx和过氧化氢酶无反应。B类,Ad-TIS21在不使用其他抗氧化剂的情况下增强DOXO诱导的MnSOD表达酶。除此之外，Ad-TIS21单独诱导MnSOD，但不诱导CuZnSOD，表达式。50 m.o.i.Ad-TIS21或Ad-β-Gal感染HeLa细胞暴露于DOXO（1.0μg/ml）12h后用Western blotting检测抗氧化酶。C，增加了经或未经DOXO处理的Ad-TIS21的MnSOD活性。HeLa细胞感染Ad-TIS21（50m.o.i.）病毒，然后使用DOXO（1.0μg/ml）12小时。注意符合随着MnSOD表达水平的增加，MnSOD活性增加，第页< 0.05与没有Ad-TIS21。D类，抑制通过sh-BTG2感染，MnSOD表达减少，但GPx和过氧化氢酶不增加。HeLa细胞感染sh-BTG2 H4和H5或空载体(反对的论点)然后用DOXO（1.0μg/ml）处理12小时。抗氧化酶的表达经Western blotting检测。注意MnSOD在H4、H5感染细胞。电子，对DOXO诱导的薄层A/C的抑制作用被膜透性过氧化氢酶（PEG-过氧化氢酶）分解。HeLa细胞用指示浓度的PEG-过氧化氢酶预处理12 h，然后用DOXO（1.0μg/ml）处理24小时通过Western blotting测定。注意抑制DOXO诱导的细胞死亡通过增加PEG-过氧化氢酶的浓度。这些数据代表了一个典型的三个独立实验的结果。

NAC对DOXO诱导的MEF细胞无保护作用死亡-虽然目前的研究结果表明BTG2增加DOXO诱导HeLa细胞BTG2细胞死亡^{/PC3/TIS21号机组}淘汰赛ES已知细胞对DOXO诱导的细胞死亡比野生型(4). 要确认BTG2在DOXO诱导ES细胞死亡中的作用TIS21型^–/–MEF公司(24,30,31). 与之相反组织21^+/+MEF，TIS21暴露^–/–MEF至DOXO显示活细胞数量较少，表明TIS21基因在MEF中的抗凋亡作用(图6A类). 收件人研究BTG2的抗凋亡作用是否与抗氧化酶、MnSOD和过氧化氢酶的表达在TIS21型^–/–MEF公司(图。6B类). MnSOD表达较低，但过氧化氢酶不表达TIS21型^–/–MEF比野生型MEF高。此外，TIS21感染后TIS21基因的重组^–/–含Ad-TIS21病毒的MEF，MnSOD，但不含过氧化氢酶，表达受到调节根据Ad-TIS21的水平（0–10 m.o.i.）。这种现象出现了与我们之前的数据完全一致(图5，B–D类)TIS21本身上调了MnSOD的表达及其活性。当评估了TIS21对ROS的影响，用DOXO处理野生型MEF生成更多H₂O（运行）₂比TIS21型^–/–MEF公司(图。6C). 然而，NAC显著降低了预处理。当我们比较H的生成₂O（运行）₂DOXO治疗后，H的量₂O（运行）₂在中生成野生型MEF不低于HeLa细胞(图6D类). 这些研究结果表明，尽管TIS21表现出促凋亡和TIS21增强了HeLa和MEF的抗凋亡活性H（H）₂O（运行）₂对DOXO治疗的反应HeLa和MEF细胞通过MnSOD的调节。

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图6。

NAC和邻苯三酚诱导的DOXO诱导细胞联合治疗MEF细胞死亡。 A类，DOXO诱导的细胞死亡在TIS21型^–/–MEF比野生型多。TIS21型^+/+MEF公司和TIS21^–/–用0.5μg/ml处理MEF细胞24小时，然后用台盼蓝测定活细胞染色，第页< 0.05与DOXO处理TIS21型^+/+MEF公司。B类，TIS21表达的重组TIS21型^–/–MEF恢复了MnSOD的表达。TIS21型^+/+MEF和TIS21^–/–MEF细胞进行RT-PCR分析(上部面板).TIS21型^–/–MEF细胞感染指示将Ad-TIS21病毒浓缩48小时，然后将细胞裂解物进行蛋白质印迹分析(下部面板). 请注意Ad-TIS21感染后显著诱导MnSOD表达。C，TIS21增强DOXO诱导的H₂O（运行）₂一代在MEF细胞中。TIS21型^+/+MEF和TIS21^–/–MEF公司分别用DOXO（0.5μg/ml）和NAC（5米米)预处理。测量ROS产生的DCFDA荧光流式细胞术检测。野外荧光强度更强类型比TIS21^–/–MEF（⋆，第页<0.05），NAC进一步降低H₂O（运行）₂中的生成MEF细胞。D类，野生型(重量)MEF和HeLa细胞被处理使用DOXO（0.5μg/ml）12小时，ROS产生的DCFDA荧光为仔细斟酌的。MEF之间的ROS生成没有显著差异和HeLa细胞，支持TIS21增强DOXO诱导的可能性H（H）₂O（运行）₂在两个细胞中生成。电子，没有NAC对DOXO诱导TIS21细胞死亡的影响^+/+MEF细胞。当野生型MEF用DOXO（0.5μg/ml）处理24小时，或无NAC（5 m米)预处理，没有保护作用NAC对抗DOXO诱导的细胞死亡。此外，这些细胞对用PYRO（100μ米)，一个超氧阴离子和H（H）₂O（运行）₂发电机或NAC，a H₂O（运行）₂食腐动物。这些数据有力地支持了细胞对根据细胞和细胞上下文，ROS有很大不同。照片代表了三次重复实验的典型和平均结果。

进一步描述H的作用₂O（运行）₂在正常细胞中，接下来我们研究了氧化应激对DOXO诱导的MEF细胞的影响死亡。与NAC在DOXO诱导的HeLa细胞中的保护作用相反死亡(图3B类),NAC预处理MEF未能阻断DOXO诱导的MEF细胞死亡(图6电子). 此外，NAC、H治疗MEF₂O（运行）₂清道夫，或100μ米邻苯三酚（PYRO），一种特殊的超氧阴离子发生器和H₂O（运行）₂，未发现表型差异，特别是在细胞死亡方面，与二甲基亚砜治疗相比。这些发现强烈提示ROS可能在MEF中不起促凋亡作用，尽管TIS21型^/基站2增强型DOXO诱导H₂O（运行）₂在HeLa和MEF细胞中均产生。总之，BTG2^/TIS21型作为DOXO诱导HeLa细胞死亡的促进剂，但具有抗凋亡作用在MEF中。

讨论

我们在这里证明了BTG2的诱导^{/TIS21/PC3型}表达抗氧化剂失衡致敏HeLa细胞对DOXO介导的细胞死亡酶，例如诱导MnSOD，但不诱导过氧化氢酶和GPx，因此导致H₂O（运行）₂一代(图7). 这种现象是经Ad-TIS21病毒和携带sh-BTG2 RNA的慢病毒感染证实，除NAC和膜透性过氧化氢酶处理外。这个BTG2的显著诱导机制^{/TIS21/PC3型}表达DOXO治疗后(图。1C)四个人的存在可以很好地支持串联PuPuPuC（A/T）五聚体，一种潜在的p53识别元件(32)，在上BTG2基因5′-非翻译区(4). DOXO诱导的BTG2已知在MCF-7细胞中的表达是p53依赖性的(33)，而12-O（运行）-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯诱导U937中BTG2的表达细胞p53依赖性(10).此外，HeLa细胞感染Ad-TIS21病毒显著增强DOXO诱导的HeLa细胞死亡(图。2,A类和B类)而慢病毒中的sh-BTG2 RNA细胞凋亡减少(图。2C)，强烈支持促进细胞凋亡的作用基站2^/TIS21型/^PC3公司在癌细胞中，不仅HeLa细胞，而且也包括Huh7、HepG2和Hep3B细胞(图。2D类).

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图7。

显示BTG2促凋亡作用的模式^/TIS21型在里面DOXO诱导的细胞死亡。DOXO对HeLa细胞的治疗增加BTG2和MnSOD的表达，不含任何其他抗氧化酶。MnSOD的表达和活性受TIS21基因的调控，通过Ad-TIS21或sh-BTG2病毒感染癌细胞进行评估。此外，TIS21增强了DOXO或邻苯三酚诱导的ROS生成癌细胞和MEF，通过NAC预处理进一步证实H（H）₂O（运行）₂食腐动物。因此，H₂O（运行）₂MnSOD增加引起的积累导致癌细胞死亡，而通过膜透性过氧化氢酶（PEG-过氧化氢酶）缓解以及NAC治疗。另一方面，MEF对H（H）₂O（运行）₂由DOXO或邻苯三酚处理产生，以及TIS21表达进一步增强。总之，TIS21是一种增强剂通过积累H来控制化疗药物₂O（运行）₂在癌症中通过诱导MnSOD的表达及其活性，使细胞抗氧化系统的不平衡。

众所周知，DOXO通过利用细胞氧化还原酶(34,35)，例如NADH脱氢酶复合物，NADPH细胞色素p450还原酶(36)黄嘌呤氧化酶以及通过DOXO-铁络合物形成的非酶途径铁(37); 电子施主将DOXO中的苯蒽醌激活为半醌，一个单电子为转移到分子氧中，从而产生自由基，例如超氧阴离子H₂O（运行）₂、羟基自由基等反应性氮专一性(38). 的确，治疗含有DOXO生成ROS的HeLa细胞(图。三A类)和DOXO诱导的H₂O（运行）₂TIS21的表达显著调节了世代，例如因Ad-TIS21感染而增加(图。三电子)但减少了sh-BTG2^/TIS21型RNA和NAC处理(图3F类).因此，长期以来，氧化损伤被认为是一种重要的蒽环类药物在肿瘤细胞中的作用机制(27). 在本研究中，DOXO诱导的染色质浓缩和层粘连蛋白A/C的断裂加剧然而，通过将TIS21引入HeLa细胞，对细胞进行预处理NAC显著降低了DOXO造成的伤害(图4)，支持该想法TIS21作为促凋亡分子，通过增强活性氧的生成用DOXO治疗癌细胞。当我们雇佣PYRO、TIS21时增强PYRO诱导的HeLa细胞死亡；然而，它完全被NAC预处理(图。三D类). 数据强烈表明TIS21增强了PYRO诱导的超氧化物及其向H的转化₂O（运行）₂.

除了产生ROS外，MnSOD最近被确定为p53和ROS的潜在靶点已被确定为下游介质抑癌基因p53(39).因此，假设DOXO诱导p53激活是相当诱人的和BTG2^{/TIS21/PC3型}表达，进而上调活性氧生成并增强细胞死亡。事实上，HeLa细胞感染Ad-TIS21本身在DOXO治疗前上调了MnSOD的表达MnSOD的表达与过氧化氢酶、GPx和CuZnSOD无关内源性BTG2和外源性TIS21导致DOXO治疗后增加活动(图5，B类和C). 因此，一个问题出现了，为什么MnSOD增强了DOXO诱导的细胞死亡。尽管SOD的作用是抗氧化防御已被广泛记录，SOD活性高有时被报告有毒体内(40); 因此SOD水平越高H（H）₂O（运行）₂(41). 此外，MnSOD的上调被证明可以诱导和抑制凋亡效应同一细胞中的c-Rel(42,43).

在这项研究中，我们展示了BTG2在DOXO诱导的癌细胞死亡。然而，这与之前的报告相冲突关于BTG2的抗凋亡作用^{/PC3/TIS21号机组}在ES细胞中(4). 因此，我们雇佣了组织21^–/–MEF，并证实TIS21增强DOXO诱导的H₂O（运行）₂不仅在癌细胞中生成但也在MEF中；然而，细胞对H的反应₂O（运行）₂癌细胞和正常细胞有很大不同(图6). 这种冲突可能是ROS在细胞中的作用相当大，这一报告对此给予了很好的支持不同的细胞上下文；有丝分裂反应，生长停滞，衰老和细胞死亡(44). 我们现在不能解释为什么H₂O（运行）₂TIS21生产的产品表明癌细胞和胚胎细胞对细胞死亡的不同影响。然而，据我们所知，这是第一份显示BTG2通过上调MnSOD增强DOXO诱导的癌细胞死亡。因此，我们建议BTG2^TIS21/PC3型增强DOXO诱导的癌细胞通过解除抗氧化酶的调节导致死亡，导致对DOXO诱导的氧化损伤的敏感性。

笔记

^*这项工作得到了研究拨款的支持R01-2006-000-10311-0和M10756040001-07N5604-00110来自韩国科学与工程基金会。这个这篇文章的出版费用部分由下列款项支付页面费用。因此，必须在此标记此物品“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节只是为了表明这一事实。

脚注

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