公共科学图书馆一号。2009; 4（4）：e5105。
HD-PTP是一种催化失活的酪氨酸磷酸酶，因为其磷酸酶结构域的保守差异
,1 ,1 ,1 ,2 ,2 ,1和1,*
玛丽·克劳德·金格斯
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学古德曼癌症中心和生物化学系
张玉玲
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学古德曼癌症中心和生物化学系
德米特里·卡里蒂迪
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学古德曼癌症中心和生物化学系
阿拉斯泰尔·巴尔
2英国牛津大学纳菲尔德医学系结构基因组学联合会
斯特凡·纳普
2英国牛津大学纳菲尔德医学系结构基因组学联合会
米歇尔·特伦布雷
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学古德曼癌症中心和生物化学系
Arnim暂停
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学古德曼癌症中心和生物化学系
卡尔·威廉·科赫，编辑器
1加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学古德曼癌症中心和生物化学系
2英国牛津大学纳菲尔德医学系结构基因组学联合会
德国奥尔登堡大学
构思并设计了实验：MCG MLT AP。进行实验：MCG YLZ DK。分析数据：MCG Y-LZ DK-AJB-SK MLT AP。贡献的试剂/材料/分析工具：AJB SK。撰写论文：MCG AP。提供的结构模型：AJB SK。
2009年1月19日收到；2009年3月4日验收。
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- 补充资料
图S1：引物序列：含有EcoR1位点（下划线）的正义引物和含有Xho1位点（下线）的反义引物，仅用于扩增HD-PTP全长或催化结构域。用于HD-PTP全长和催化结构域定点突变的正、反义引物。核苷酸替换用粗体表示。（7.62 MB畅通节能法）
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摘要
背景
HD-PTP蛋白被描述为肿瘤抑制候选物，根据其氨基酸序列被归类为经典的非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）。迄今为止，还没有发现HD-PTP磷酸化底物，最近报道了关于其催化活性的有争议的结果。
方法和结果
在这里，我们报告了一项严格的酶分析，证明HD-PTP蛋白不含酪氨酸磷酸酶或脂类磷酸酶活性，使用高度敏感的DiFMUP底物和一组不同的磷脂酰肌醇磷酸盐。我们发现，HD-PTP酪氨酸磷酸酶失活是由位于HD-PTP磷酸酶结构域中的一个关键残基的进化保守氨基酸分歧引起的，因为其后突变足以恢复HD-PTP的酪氨酸磷酸酯活性。此外，HD-PTP的表达与肿瘤抑制活性一致，导致人类癌细胞株中的集落生长减少，与其催化PTP活性状态无关。
结论
总之，我们证明HD-PTP是一种无催化活性的蛋白酪氨酸磷酸酶。因此，我们确定了一个参与其灭活的残基，并表明其集落生长抑制活性与其在人类肿瘤细胞系中的PTP活性状态无关。
介绍
经典的蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族以包含10个保守基序的～280氨基酸结构域为特征，分为跨膜受体样和细胞内非受体PTP，[1],[2].PTP基序9（VHC类SXGXGR[T/S]G）是最保守的序列之一，对应于酶的活性位点。该基序中的半胱氨酸残基（C）对催化活性至关重要，而被丝氨酸残基取代（S）会消除活性（C/S突变）[1]–[3].
HD-PTP蛋白被描述为肿瘤抑制候选物，因为它由PTPN23型基因，位于3p21.3抑癌基因簇上，在人类肾、肺、乳腺和宫颈肿瘤中经常缺失[4]–[8]与肿瘤抑制功能一致，HD-PTP表达抑制ras（拉斯维加斯）-介导NIH-3T3细胞转化；这种作用通过删除其PTP结构域以及加入C/S突变而被消除，这表明HD-PTP催化活性调节这一功能[4]HD-PTP在细胞迁移和胞内运输中的功能最近也有报道，但其确切的细胞活性尚未确定[9]–[12]根据其氨基酸序列，HD-PTP被归类为非跨膜PTP[1],[2],[8]重要的是，它具有291个氨基酸的PTP结构域，该结构域由定义该酶家族的10个PTP基序组成。虽然最近有报道称细菌表达的HD-PTP具有催化惰性，但另一组研究表明哺乳动物表达的HD-PTP酪氨酸磷酸酶活性[11],[13].
在这里，我们报告了一个详细而严格的酶分析，清楚地证明哺乳动物表达的HD-PTP催化域和全长蛋白对DiFMUP或磷脂酰肌醇磷酸酯没有任何PTP活性在体外这种活性的缺乏是由位于其PTP基序9中的关键非感觉残基的进化保守序列分歧引起的，因为其后突变特别激活了HD-PTP酪氨酸磷酸酶对DiFMUP的活性。我们还报告，HD-PTP酪氨酸磷酸酶活性状态并不影响其在人类肿瘤细胞系中的集落生长抑制活性。
材料和方法
DNA构建、克隆和定点突变
人类HD-PTP cDNA由Mamoru Ouchida博士（日本冈山冈山大学）善意提供[8]编码全长蛋白质（人类氨基酸1至1636）或HD-PTP催化结构域（人类氨基酸1169至1460）的cDNA使用5′端含有EcoR1位点和3′端含有Xho1位点的引物，通过PCR扩增，并在带有两个Flag表位的框架中克隆到pcDNA3载体中，该表位使用EcoR1和Xho1酶（之前描述了2XFlag pcDNA3-载体[14]). 通过测序验证了cDNA的完整性和正确插入。C1392S、S1394A和C1392S/S1394A突变体是根据制造商的指示，使用Quick Change site-directed mutagenesis kit（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫内），以Flag-HD-PTP全长结构域和催化结构域作为模板，并使用中描述的改良正向和反向引物，通过定点突变产生的图S1DNA测序证实了这些突变。GST-PTP1B催化结构域和GST-PTEN野生型和C/S结构体已经过描述[15],[16].
蛋白质表达和纯化
HEK 293T细胞保存在37°C、5%CO、添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM高糖）中2增湿的大气。根据制造商的说明，使用HD-PTP构建物或使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）的空载体转染细胞。使用Flag纯化系统（EZview Red ANTI-Flag M2亲和凝胶、Sigma-Aldrich、St-Louis、MO）纯化表达蛋白（HD-PTP全长或催化域）：转染后24小时，收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗并用HNMETG缓冲液（50 mM Hepes，150 mM NaCl，1.5 mM MgCl）在冰上溶解15分钟2、1 mM EGTA、10%甘油、1%Triton X-100、5 mM DTT和1×ROCHE蛋白酶抑制剂混合物）。通过13000×g离心清除细胞裂解物，并在4°C下用Flag珠培养2小时。用仅含0.1%Triton X-100的HNMETG清洗珠子3次，用150 ng/ml Flag肽在磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）中洗脱Flag-HD-PTP蛋白3次。使用Microcon离心过滤装置（Millipore，Bedford，MA）浓缩洗脱后的蛋白质，并使用RC/DC蛋白质分析试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA）定量。将等量的蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上，通过考马斯染色和使用抗标记M2抗体（Sigma-Aldrich、St-Louis、MO）的western blot分析评估洗脱蛋白质的存在和纯度。如前所述，纯化了PTP1B和GST-PTEN全长的GST标记催化结构域，并使用N.Sonenberg博士善意提供的抗GST抗体通过考马斯染色和western blot分析评估了它们的表达[15],[16].
酶分析
根据制造商的说明，使用EnzCheck磷脂酶检测试剂盒（加利福尼亚州卡尔斯巴德市分子探针）在37°的黑色聚苯乙烯96-well板中进行酪氨酸磷酸酶检测。简言之，将DiFMUP底物（最终浓度100µM）添加到最终体积为100µl的含有100至200 nM Flag-HD-PTP蛋白质或2 nM纯化GST-PTP1B的分析缓冲液（50 mM Hepes，0.1 mg/ml BSA，3 mM DTT，pH 6.5）中。使用Thermo VARIOSKAN荧光板阅读器每分钟监测一次水解DiFMU荧光产物在450 nm处发出的荧光，持续30分钟（358 nm激发，450 nm发射），并与标准曲线进行比较。反应速率是通过除以每次（分钟）产生的氟化DiFMU（pmole）得到的。如有指示，向缓冲液中添加10 mM PTP抑制剂原钒酸钠（Fisher Scientific，渥太华，ON）[17]对于pH分析研究，在含有50 mM Tris、50 mM Bis-Tris和100 mM醋酸钠的缓冲液中，在指示的pH值（范围为4到8.5）下进行酶反应，以保持之前建议的恒定离子强度[18]为了进行动力学分析，将恒定浓度的Flag-HD-PTP添加到不同浓度的DiFMUP底物中（最终浓度在0至300µM之间）。将反应速率与DiFMUP浓度作图，以获得Michaelis-Menten矩形双曲线和动力学常数(K（K）M（M），千猫,和k个猫/K（K）M（M）)使用GraphPad Prism软件从该双曲线导出，并与已知的PTP1B、SHP2和TC-PTP酪氨酸磷酸酶的DiFMUP酶参数进行比较[19]
[20]根据制造商的指示，使用孔雀石绿磷酸酶检测试剂盒（Echelon）进行脂质磷酸酶检测。简言之，通过在37°C下将1µg HD-PTP催化结构域与120µM总体积为25µl的磷脂酰肌醇磷酸盐底物在检测缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.4，140 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM DTT）中孵育15分钟来进行检测。PTEN（250 ng）作为阳性对照。通过添加100µl孔雀石绿溶液终止反应，并在室温下培养15分钟以允许显色。使用Thermo VARIOSKAN荧光板读取器在620nm处读取吸光度。
菌落形成分析
按照HEK 293T细胞的描述维持肾癌细胞系ACHN和786-0，并用含有新霉素耐药基因的空pcDNA3载体或如上所述的Flag-HD-PTP构建物进行转染。转染后24小时，对细胞进行胰蛋白酶处理，将其置于60 mm培养皿中，并使用G418筛选2周。将获得的菌落固定，用Giemsa染色并按规定计数[21]使用抗Flag（M2）抗体和抗肌动蛋白（AC74，Sigma-Aldrich，St-Louis，MO）作为负荷控制，通过western blot分析保存等分细胞的蛋白质表达水平。
结果
HD-PTP酪氨酸磷酸酶活性
重组全长PTP以及分离的PTP结构域表现出酪氨酸磷酸酶活性在体外用于表征PTP活性[19],[20],22然而，由于PTP活性可以通过翻译后修饰来调节，而翻译后修饰不存在于细菌中表达的蛋白质中，因此结果取决于所使用的表达系统[23]为了澄清关于HD-PTP催化活性的相互矛盾的结果，我们评估了哺乳动物表达的Flag-HD-PTP全长（HD:人类氨基酸1至1636）或催化结构域（CD:人类氨基酸1169–1460）野生型版本的磷酸酶活性并将其与潜在的催化失活突变型（C1392S:C/S）进行了比较(). 这些蛋白在HEK 293T细胞中表达，经过纯化，并通过考马斯染色和抗Flag抗体的western blot分析确认其存在和纯度(). 使用高度敏感的非选择性荧光底物6、8测定HD-PTP酶活性-迪夫氟-4-M（M）乙基u个mbiliferyl公司P（P）如上所述的磷酸盐（DiFMUP）[19],[20].每分钟监测一次底物脱磷过程中发出的荧光，持续30分钟()并推导出反应速率（DiFMU/min的pmole）(). 重要的是，尽管观察到空载体（EV）和野生型结构体（CD-WT和HD-WT）的反应速率略有不同，但催化失活突变体（CD-C/S和HD-C/S）的背景活性与野生型结构物相似。这表明HD-PTP具有催化活性，这些结构体检测到的弱活性是由于存在少量与HD-PTP共同纯化的PTP。这些数据与最近报道的使用含有38个磷酸肽和DiFMUP底物的细菌表达HD-PTP的活性缺失相一致[13].
HD-PTP无催化活性。A） 在HEK 293T细胞中表达Flag-HD-PTP催化域（CD）或全长蛋白（HD）野生型（WT）或C1392S（C/S）或相应的空载体（EV），并通过考马斯染色和抗Flag抗体的western blot分析进行纯化和可视化。B） 使用DiFMUP底物进行HD-PTP磷酸酶活性测定，并显示了水解DiFMU荧光发射的典型时程动力学曲线。C） 反应的平均速度（速率）由动力学曲线导出，表示为每分钟DiFMU的pmole（pmole/min）。结果表示三个独立实验的平均值（+/-SD）。
HD-PTP催化结构域与其他经典PTP序列的比对强调了在极保守残基中存在许多分歧[1]虽然HD-PTP含有半胱氨酸（人类HD-PTP序列中的C1392），半胱氨酸对位于基序9的催化活性至关重要，但位于磷酸结合环（人类HD_PTP序列中残基1394）的丙氨酸（在一致基序中缺失，但在其他PTP中高度保守）被丝氨酸（S）取代(). 这种序列差异在不同的HD-PTP同源序列中得到了很好的保留，可能会抑制酶的活性。事实上，保守的磷酸结合环丝氨酸残基已被认为在稳定酶-底物复合物中发挥重要作用()[24]此外，该残基在两个已知的非活性受体PTP（PTP IA2和PTP IA1β）中被天冬氨酸（D）取代。据报道，该残基的反向突变可恢复PTP活性[24]–[26]为了解决这种可能性，通过定点突变产生该残基的反向突变（S1394A:S/A），并评估其对HD-PTP催化活性的影响(). 与HD-WT和CD-WT相比，S1394A突变体（CD-S/A和HD-S/A）显示出显著的磷酸酶活性().
S1394A突变恢复HD-PTP催化活性。A） PTP基序9与HD-PTP序列的一致性比对显示了物种间保守的氨基酸差异（人类氨基酸1394是丝氨酸而不是丙氨酸；装箱）。指出了必需的催化半胱氨酸残基（C）。B） 考马斯染色和免疫印迹显示纯化的HD-PTP（CD）或全长蛋白（HD）、野生型（WT）或S1394A（S/A）催化结构域。C–F）磷酸酶分析在pH 6.5（C，D）或pH值为4至8.5（D，E）的条件下进行，如.C，E）水解DiFMU荧光发射的典型时间过程动力学曲线。D、 F）反应的平均速度（速率）由动力学曲线得出，结果代表三个独立实验的平均值（+/−SD）。
为了排除pH依赖性对野生型HD-PTP中PTP活性的影响，我们使用催化结构域在pH 4至8.5之间的pH范围内进行了酶分析，并将这种活性与S/A突变体进行了比较(). 虽然CD-S/A突变体在整个pH范围内都具有酶活性，在pH 6.5下具有最佳活性，但CD-WT在所有pH值下都不活跃，这表明磷酸结合环中保守的HD-PTP序列差异导致HD-PTP不活跃。我们还测试了HD-PTP WT和S/A对对硝基苯基磷酸盐的活性(第页NPP），一种常用于评估PTP活性的合成底物。不幸的是，该底物的灵敏度不足以检测HD-PTP催化活性（数据未显示）。
抑制HD-PTP S/A活性
为了证实HD-PTP S/A催化活性的酪氨酸磷酸酶特异性，我们评估了精心设计的PTP抑制剂硫钒酸钠（Van）抑制CD-S/A活性的能力(). 我们的结果表明，抑制剂有效地消除了HD-PTP S/A突变体的活性以及用作对照的蛋白酪氨酸磷酸酶1B分离的PTP结构域（PTP1B）。此外，我们评估了C1392S（C/S）突变对HD-PTP S1394A（S/a）活性的影响(). 正如预期的那样，位于PTP基序9中的催化必需半胱氨酸的突变消除了S/A突变体的PTP活性，证实了典型的酪氨酸磷酸酶活性。
抑制HD-PTP S/A活性。A） 用于C和D的PTP1B的GST标记催化域在细菌中表达并按所述进行纯化[15]通过考马斯染色和抗GST抗体的western blot分析显示重组蛋白的完整性和纯度。B） 如前所述，表达、纯化并可视化带有S1394A（S/A）的标记HD-PTP催化域（CD）或全长（HD）蛋白，或与C1392S（C/S）突变结合或不结合。C，D）酪氨酸磷酸酶抑制剂原钒酸钠（Van）的作用对HD-PTP催化域S1394A突变株（CD-S/A）进行了检测。PTP1B被用作抑制剂的对照。E、 F）C1392S突变对HD-PTP催化结构域或全长S1392A突变活性的影响使用DiFMUP磷酸酶分析进行分析，如显示了从三个独立实验（+/−SD）（D，F）得出的代表性动力学曲线（C，E）和平均反应速率。
HD-PTP S/A的酶参数
为了表征S/A突变体的PTP活性，进行了详细的酶动力学表征。通过增加DiFMUP底物的浓度（0至300µM）来测定S/A突变体（CD或HD）的PTP活性，并推导出动力学常数，并与之前为其他PTP催化域确定的参数进行比较(). 虽然动力学常数在很大程度上取决于实验条件，但我们的结果表明HD-PTP S/A与底物的亲和力(K（K）
M（M）)与其他PTP（PTP1B、SHP2、TC-PTP）相比类似，但其催化速率(k个
猫)催化效率较低(k个
猫/K（K）
M（M）).
表1
使用DiFMUP底物的HD-PTP S/A和其他PTP的动力学常数。
| |
K（K）
M（M）（µM） |
k个
猫（个）−1) |
k个
猫/K（K）
M（M）
|
| HD-PTP（HD-PTP） | CD-S/A光盘 | 18 | 0.1 | 0.3×104
|
| HD-S/A（HD-S/A） | 28 | 0.2 | 0.6×104
|
| PTP1B型 | 韦尔特等。
| 20 | 17 | 84×104
|
| 蒙塔利贝特等。
| 5.5 | 28 | 509×104
|
| 上海第二大酒店 | 韦尔特等。
| 104 | 1.3 | 1.3×104
|
| 蒙塔利贝特等。
| 27 | 12 | 44×104
|
| TC-PTP公司 | 韦尔特等。
| 26 | 21 | 79×104
|
| 蒙塔利贝特等。
| 11 | 65 | 591×104
|
脂质磷酸酶活性
HD-PTP根据其氨基酸序列被归类为酪氨酸特异性PTP，但我们的结果清楚地表明，它对合成底物DiFMUP和第页NPP或38个磷酸肽库[13]PTEN和肌管蛋白家族的一些PTP成员已进化为特异性去磷酸化磷脂酰肌醇磷酸酯[2],[27]例如，纯化的PTEN专门催化PI（3,4,5）P底物的脱磷酸化[16]HD-PTP序列与基于PTEN中明确描述的必需残基的脂类磷酸酶不相似，但PTPRQ中已鉴定出其他关键残基[28]事实上，PTPRQ的脂质磷酸酶活性似乎取决于其PTP基序8中的WPE序列，该序列不同于保守的WPD共有序列。由于HD-PTP也具有WPE序列，我们使用孔雀石绿基分析评估了其去磷酸化磷脂酰肌醇磷酸酯的能力()然而，我们的结果表明，与野生型PTEN（WT）不同，HD-PTP对PI（3,4,5）P底物不起作用(). 其他磷脂酰肌醇磷酸盐（包括PI（3,4）P、PI（3,15）P或PI（3）P）也缺乏HD-PTP脂质磷酸酶活性().
HD-PTP没有脂质磷酸酶活性。HD-PTP磷酸酶对合成磷脂酰肌醇磷酸盐底物的活性通过孔雀石绿基分析进行评估。将HD-PTP野生型（WT）、C1392S（C/S）或S1394A（S/A）的催化结构域（CD）与PI（3，4，5）P（A）、PI（3，4）P（B）、PI（3，5）P（C）和PI（3）P（D）孵育，并如材料和方法以PTEN野生型（WT）和C132S（C/S）纯化蛋白为对照。结果表示三个独立实验的平均值（+/-SD）。
HD-PTP对菌落生长减少的影响
先前的研究表明HD-PTP表达抑制ras（拉斯维加斯）-NIH 3T3细胞中介导的细胞转化，以及催化结构域的缺失和C/S突变消除了这一特性[4]该结果与这里描述的HD-PTP的催化活性不一致。使用类似的方法，我们研究了HD-PTP S/a突变的影响体内通过评估HD-PTP抑制人类肿瘤细胞系中菌落生长形成的能力。我们最近报道，小鼠HD-PTP在肾皮质肾小管上皮细胞（银杏等。印刷中）。我们选择了两个肾癌细胞系（ACHN和786-0），它们起源于肾脏中的这个位置，以解决HD-PTP的抑癌潜力。用含有新霉素选择基因的等量HD-PTP构建物转染细胞，并用新霉素类似物（G418）筛选2周。使用western blot分析比较所有蛋白的表达水平(). 将出现的菌落数与空载体（EV）控制获得的菌落数量进行比较。结果显示，HD-PTP的表达导致两种细胞系中集落生长形成的减少（ACHN中约70%，786-0中约40%）(). 然而，我们在WT、C/S和S/A突变体之间没有观察到任何差异，这表明HD-PTP酪氨酸磷酸酶活性的状态并不影响其对菌落生长形成的负面影响。引人注目的是，HD-PTP缺失突变体的表达（包含BRO结构域，但不包含HIS和PTP结构域）并不影响菌落生长形成。这表明PTP结构域显示出功能重要性，正如之前使用HD-PTP的大鼠直系同源物进行的NIH3T3实验所证明的那样[4].
HD-PTP可独立于其磷酸酶活性状态减少菌落生长形成。对肾细胞癌细胞系（ACHN和786-0）进行集落形成分析，转染含有新霉素耐药基因或表达Flag-HD-PTP构建物的空载体（EV）。蛋白表达水平通过western blot分析，使用抗Flag抗体和抗肌动蛋白抗体作为负荷对照（a）。B） G418选择2周后获得的菌落进行固定、染色和计数。结果表示为相对于EV条件的菌落数，并表示独立实验的平均值（+/-SD），（786-0:n=4，ACHN:n=5）。十： 未转染细胞。
讨论
虽然HD-PTP根据其氨基酸序列被描述为经典的非跨膜PTP，但我们的结果表明它是一种催化活性酪氨酸磷酸酶。使用类似的哺乳动物表达系统，最近的一项研究报告了与野生型HD-PTP相关的酪氨酸磷酸酶活性，该活性与我们在检测中检测到的背景活性类似[11]他们的结果得到了以下事实的支持：描述良好的PTP抑制剂原钒酸钠消除了60%的这种活性。然而，这些结果没有与灭活突变体（C/S）的活性进行比较，后者在我们的试验中用作对照。引人注目的是，我们发现催化失活的C/S突变体显示出与野生型蛋白相同的PTP活性水平。因此，我们确信，这两项研究中检测到的PTP活性低水平是由于污染磷酸酶的联合纯化。与本文报道的结果一致，最近发现细菌表达的HD-PTP催化域对38个磷酸肽和DiFMUP底物不起作用[13]我们的数据强烈表明，HD-PTP因其PTP基序9中保守的非感觉关键氨基酸差异而不具有催化活性，因为该残基（S/a）的反向突变重新激活了HD-PTP酪氨酸磷酸酶活性。该残基对酪氨酸磷酸酶活性的重要性也被报道用于其他两种类似受体的PTP[24],[29]因此，我们建议通过将C+2位的丙氨酸添加到一致序列（VHCS）中来修改PTP基序9一致序列A类GXGR[T/S]G）。
HD-PTP序列显示出与PTP共有基序的若干差异，因此HD-PTP可以在多个关键位置失活，评估PTP共有的基序的其他重组是否可以提高HD-PTP催化效率将是一件有趣的事情。例如，在PTP基序1中(N个XXKNR公司Y（Y）)被称为磷酸化酪氨酸识别环，限制酪氨酸磷酸化肽的底物特异性，HD-PTP(Y（Y）SLKNR公司H（H）)显示在两个非活性受体如PTP IA2和IA2β中观察到的差异[1]PTP共识的另一个重要改变位于基序8（WPD类XGXP），其中HD-PTP序列中的天冬氨酸（D）被谷氨酸（E）取代[1]这种残留物被称为通用酸催化剂，被丙氨酸残留物取代后，PTP1B中的PTP活性大大降低[30]这种改变也存在于受体PTP的许多非活性D2结构域中。然而，该残基的反向突变（E/D）不足以使HD-PTP具有催化活性（数据未显示）。
为了合理解释HD-PTP中保守残基变化的影响，我们建立了一个同源模型(). 与该位置的丙氨酸相反，HD-PTP中的Ser1394不能与结合的磷酸酪氨酸形成良好的底物相互作用。极性Ser残基也可能排斥底物磷酸基团，并影响相邻催化Cys残基的亲核性质。同样明显的是，HD-PTP磷酸化酪氨酸识别环中的酪氨酸/组氨酸（His1223）交换导致与底物的π-π堆叠相互作用丢失。此外，与两个磷酸酪氨酸残基相关的PTP1B活性位点的表面表征()已与与一种磷酸盐相关的HD-PTP预测模型进行了比较(). 表面表征表明，与PTP1B一样，HD-PTP在其活性部位有一个开放的结合囊，可以允许磷酸盐结合。
HD-PTP催化域模型。A） HD-PTP同源性模型基于PTP1B底物复合物的结构（pdb-code:1g1h）。HD-PTP残留物分别用黑色和PTP1B残留物用灰色标记。显示了已知在PTP底物识别和催化中起关键作用的保守残基，这些残基在HD-PTP中发生了改变。B–C）与两个磷酸残基相关的PTP1B活性位点的表面表征（B）和与一个磷酸相关的HD-PTP蛋白的预测（C）。
除了非活性磷酸酶IA2和IA2β外，还描述了许多其他具有非活性PTP结构域的蛋白质。许多经典受体样PTP的第二个PTP结构域（D2）和肌管蛋白家族的双特异性假磷酸酶的PTP结构区缺乏对其催化活性至关重要的关键残基[1],[27]然而，这些非活性域的功能作用仍然没有特征化。失活PTP突变体被证明能够保持其结合底物的能力，并被用于捕获和识别细胞中的特定底物[31],[32]因此，HD-PTP的非活性催化域可以作为磷酸-酪氨酸结合模块，也称为STYX域，它可以通过阻止其结合伙伴的去磷酸化或调节其细胞定位来控制细胞信号通路[27],[33].
与肿瘤抑制功能一致，我们观察到HD-PTP的表达可独立于其PTP活性减少集落生长形成。然而，缺乏HIS和PTP结构域的HD-PTP突变体的表达并不影响菌落形成，表明PTP结构区的功能重要性。这一点也在早些时候用HD-PTP的大鼠直系图证明ras（拉斯维加斯）转化NIH3T3细胞[4].
最近，研究表明，HD-PTP苍蝇直系同源性的破坏导致EGFR调节的光感受器分化缺陷[4],[12]引人注目的是，WT和C/S突变体的重新表达同样很好地修复了缺陷。这些数据进一步证实了我们的结果，即细胞信号中的HD-PTP功能独立于酪氨酸磷酸酶活性。
支持信息
图S1
引物序列：含有EcoR1位点（下划线）的正义引物和含有Xho1位点（下线）的反义引物，仅用于扩增HD-PTP全长或催化结构域。用于HD-PTP全长和催化结构域定点突变的正、反义引物。核苷酸替换用粗体表示。
（762百万TIF）
致谢
我们感谢M.Ouchida博士提供人类HD-PTP cDNA，J.E.Dixon博士提供GST-PTEN构建物，N.Sonenberg博士提供抗GST抗体。我们感谢Isabelle Aubry的技术支持，感谢Sarah Welbourn、Anders Bondo Dydensborg和Vanessa Panneton对这份手稿的批判性阅读。
脚注
竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。
基金：MCG得到了CIHR McGill大学癌症联合会奖学金和魁北克慈善基金会（FRSQ）奖学金的支持，并持有加拿大肾脏基金会奖学金。YLZ拥有麦吉尔坎德雷尔学生奖学金，DK拥有CIHR麦吉尔大学癌症联盟学生奖学金和梅西·麦克斯波伦研究生奖学金。MLT拥有Jeanne和Jean-Louis Levsque癌症研究主席、NCIC/CCS运营拨款和AP加拿大分子肿瘤学研究主席。结构基因组协会是一家注册慈善机构（编号1097737），通过安大略省基因组研究所、葛兰素史克公司、卡罗林斯卡研究所、克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会、安大略创新信托基金会、，安大略省研究与创新部、默克公司、诺华研究基金会、瑞典创新系统署、瑞典战略研究基金会和威康信托基金会。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。
工具书类
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