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自然。作者手稿；PMC 2009年7月15日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然。2009年1月15日；457（7227）：277–280。
2008年12月21日在线发布。 数字对象标识：10.1038/性质07677
预防性维修识别码：项目经理2659408
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院92558
PMID：19098894

脊髓性肌萎缩症患者诱导的多能干细胞

艾利森·艾伯特,1,三 于俊英,4中，5 小费里尔·F·罗斯。,6 弗吉尼亚·B·马蒂斯,6 克里斯蒂安·洛森,6 詹姆斯·汤姆森,2,三，4中，5和克莱夫·斯文森1,2,三
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关联数据

补充资料

摘要

脊髓性肌萎缩（SMA）是导致婴儿死亡的最常见的遗传性神经疾病之一。患者表现出选择性丧失下部运动神经元，导致肌肉无力、瘫痪，并且经常死亡。虽然患者成纤维细胞已被广泛用于研究SMA，但运动神经元具有独特的解剖和生理功能，这可能是其易受疾病过程影响的基础。在这里，我们报告了从SMA儿童的皮肤成纤维细胞样本中生成诱导多能干细胞（iPS）。这些细胞在培养过程中迅速扩张，保持了疾病基因型，并产生了运动神经元，与未受影响的母亲相比，这些神经元表现出选择性缺陷。这是首次研究表明人类iPS细胞可以用于模拟遗传性疾病中的特定病理学。因此，它是研究疾病机制、筛选新药物化合物和开发新疗法的一种有希望的资源。

脊髓性肌萎缩（SMA）是一种常染色体隐性遗传病，由存活运动神经元1基因突变引起(SMN1型)显著降低SMN蛋白表达1,2导致低α运动神经元选择性变性三临床上，SMA 1患者通常在6个月大时出现症状，2岁时死亡4. TheSMN2型基因几乎是SMN1型除了那个SMN2型有一个单核苷酸差异，导致只有10%的全长蛋白质产生，并且高水平的截短的不稳定蛋白质缺乏外显子7（SMNΔ7）5然而，具有多拷贝SMN2的患者产生更多全长蛋白，且表型不太严重6虽然目前使用蠕虫、苍蝇或小鼠的模型系统提供了有关SMA遗传原因、运动神经元死亡机制和潜在药物治疗的宝贵数据7，它们有重要的局限性。例如，老鼠、苍蝇和蠕虫缺乏SMN2型因此在动物模型中需要复杂的基因敲除和过度表达策略8-12.由于一些疗法旨在激活内源性SMN2型作为潜在的疾病调节剂，需要基于人类细胞的检测系统。虽然SMA患者的成纤维细胞可用，但成纤维细胞不像运动神经元那样脆弱，SMN蛋白的加工和功能可能在神经环境中具有独特的特征。

诱导多能干细胞（iPS）与胚胎干细胞具有惊人的相似性，现在可以从人类成年体细胞组织中获得13-17最近的研究已经成功地从各种疾病（包括肌萎缩侧索硬化症、肌营养不良和亨廷顿氏病）中生成患者特异性iPS细胞18,19然而，这些研究均未显示细胞存活或功能的任何疾病特异性变化。在目前的研究中，我们成功地从1型SMA患者及其未受影响的母亲身上建立了iPS细胞，并表明这些细胞保留了产生分化神经组织和运动神经元的能力，同时保持了SMN1表达的缺乏和选择性运动神经元死亡的疾病表型。这些细胞对已知增加SMN蛋白的化合物也有反应。总之，这些结果将使SMA的疾病建模和药物筛选在一个更加相关的系统中得以实现20.

iPS细胞的特性

我们从1型SMA患者及其未受影响的母亲感染慢病毒构建体后的原代成纤维细胞中产生了iPS细胞10月4日，SOX 2，NANOG、和LIN 28（局域互联网络28） 16(补充图1). 两个SMA克隆（3.5和3.6）和一个WT克隆（4.2）在小鼠胚胎成纤维细胞上生长旺盛。定量RT-PCR、畸胎瘤形成、DNA指纹图谱和微阵列分析均表明WT和SMA成纤维细胞发生了多能状态的重编程，以及外源基因的抑制(图1 f-j,补充表1-3和补充图2-4). 只有3.6克隆（iPS-SMA）和4.2克隆（iPS-WT；图1 a-c)用于本研究的进一步评估。iPS-SMA和iPS-WT细胞以相似的速度生长，并在至少12周内保持正常的核型(图1 d，e).

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新生成的iPS细胞被完全重新编程。a-c、，iPS-WT和iPS-SMA细胞形成紧密堆积的集落，而成纤维细胞呈纺锤形。d、 e、，未观察到核型异常。移植后，所有iPS细胞生成的畸胎瘤显示f、，神经组织（外胚层），克，原始肠道（内胚层），h时，软骨（中胚层），以及我，骨骼（中胚层）。j中，定量RT-PCR显示OCT 4、SOX 2、NANOG和LIN 28内源性转录物的诱导。“内源性”指识别3′非翻译区的引物，而“Total”指内源性和外源性表达的转基因。数据表示为平均值±s.e.m.比例尺=50μm

SMA患者的细胞中含有所有9个外显子（全长（FL）转录物）的SMN转录物水平显著降低，这是因为SMA患者细胞中的SMN1型基因1,2为了测试iPS细胞的衍生是否影响SMN的产生，分析了iPS和成纤维细胞SMN RNA。RT-PCR分析显示，iPS-WT的SMN水平与Fib-WT相当，而iPS-SMA的SMN含量与Fib-SMA细胞相似(图2 a). 由于维护SMN2型这种疾病的功能1,2在所有样本中都鉴定出一些FL SMN的转录本和缺失外显子7（Δ7）的选择性剪接产物(图2 a). 此外，FL带的特异性消化在所有样品中产生了预期的SMN2裂解产物，证实SMN2型在WT和SMA细胞中产生FL SMN(图2b). 仅在WT细胞中检测到完整的SMN1，从而验证了SMN1型SMA细胞中的SMA和载体转录模式21(图2b). 定量RT-PCR进一步证实SMA细胞中FL-SMN转录水平显著降低（与WT相比降低32-39%，图2c). 这些数据与SMA外周血单个核细胞中观察到的FL SMN mRNA水平一致22综上所述，这些数据表明iPS细胞的产生不会改变关键基因表达谱或选择性剪接事件SMN1型和SMN2型在未受影响或特定疾病的情况下。

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iPS-SMA显示SMN转录物减少且缺少宝石。a、，iPS-WT和iPS-SMA细胞的全长（FL）和截短的外显子7缺失（Δ7）SMN转录物水平与其各自的成纤维细胞系（分别为Fib-WT和Fib-SMA）相似。b中，此外，尽管所有样本中仍存在SMN2-FL和□7转录物，但Fib-SMA和iPS-SMA细胞均显示出SMN1的特异性缺失。c、，与WT培养物相比，定量RT-PCR显示成纤维细胞（61.1%±0.6减少）和iPS细胞（67.4%±0.8减少）的FL-SMA转录物减少（Student’s t检验*p<0.001）。数据以平均值±标准误差表示。

iPS细胞的神经分化

为了确定SMN1缺乏是否会影响这种新模型中的神经元分化或存活，我们接下来从iPS-SMA和iPS-WT细胞中生成神经元和星形胶质细胞(补充图1). 人们发现，传统的类胚体形成对iPS培养物的神经分化效率很低，因此开发了一种替代的分化方案。首先将iPS培养物从其饲养层中取出，并在定义的培养基中作为iPS球体生长至少两周。这些细胞可以通过一种新的切割方法持续传代，这种方法可以避免失去细胞/细胞接触，因为这种接触对于维持神经和胚胎干细胞的增殖都很重要23,24然后将这些培养物解离并铺板到层粘连蛋白包被的盖玻片上。iPS-SMA和iPS-WT球体产生巢蛋白阳性细胞，表明神经干细胞表型25(图3 a、b). 进一步分化后，还发现Tuj1阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞(图3 c，d). iPS球体易于膨胀，随时间推移非常稳定，并能在20多代中保持产生神经后代的能力。

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iPS-WT和iPS-SMA细胞可以在神经谱系中生成细胞。a、 b中，iPS-WT和iPS-SMA细胞产生巢蛋白阳性神经前体细胞（绿色）；c、 日期：，Tuj1阳性神经元（绿色）和GFAP阳性星形胶质细胞（红色）；e、 f中，HB9（绿色）/ChAT（红色）双阳性运动神经元，以及g、 小时，分化4-6周时SMI-32（红色）阳性运动神经元我，第8周，在iPS-WT细胞上发现SMI-32阳性运动神经元（红色）上的点状突触蛋白染色（绿色）。j中，然而，在iPS-SMA细胞的SMI-32阳性运动神经元（红色）上只观察到弥漫性突触蛋白染色（绿色）。i和j中的箭头显示SMI-32阴性细胞上的点状突触蛋白染色。Nuclei用Hoechst核染料（蓝色）标记。k、 我，与iPS-WT细胞相比，iPS-SMA衍生运动神经元在6周时的数量和大小显著减少（n=3 ANOVA，*p<0.05）。所有数据均表示为平均值±标准误差。比例尺=50μm（a-h），25μm（i，j）。

由于SMA对运动神经元产生不利影响，我们接下来询问iPS细胞是否会受到运动神经元命运的谱系限制(补充图1). 基于我们之前发表的一篇使用人类胚胎干细胞的报告的分化范式26在含有维甲酸（RA）的神经诱导培养基中培养iPS球1周，然后再培养一周RA和声波刺猬（SHH）。然后将球体接种到层粘连蛋白涂层的盖玻片上，再进行2-6周（总共4-8周的分化），并在RA、SHH、环AMP、抗坏血酸（AA）、胶质细胞系衍生神经营养因子（GDNF）和脑源神经营养因子的存在下生长。电镀一周后，观察到类似神经元轴突的长而细的突起，并观察到神经样细胞从球体向外迁移。iPS-SMA和iPS-WT球均产生表达运动神经元转录因子HoxB4、Olig 2、Islet 1和HB9的细胞27,28在分化过程中(图3 e，f和补充图5). 然后用SMI-32和胆碱乙酰转移酶（ChAT）对推测的运动神经元进行免疫染色，这是成熟运动神经元的标记物29SMI-32和ChAT染色均在分化4周后的所有培养物中发现阳性神经元(图3 e-h). 此时，iPS-SMA和iPS-WT培养的运动神经元数量（分别为12.6%±2.2和9.5%±2.4）或大小（641.0μm2±81.3和669.8μm2分别为±59.1，图3 k，l)这表明iPS-SMA细胞能够产生运动神经元，这与人类条件和小鼠模型相似，其中功能性运动神经元是在发育早期生成的30.

为了进一步开发该系统，我们将细胞再培养2周，然后再次分析运动神经元的数量和大小。重要的是，此时iPS-SMA培养物的运动神经元数量显著减少（4.3%±2.0），体积缩小（383.1μm2±38.6）与iPS-WT培养基相比（24.2%±4.0654.8μm2± 32.6,图3 k，l). 然而，在分化6周时，iPS WT或iPS SMA中的Tuj1阳性神经元总数没有差异（分别为15.78%±2.9和15.55%±2.8），这表明SMA表型对运动神经元有特异性影响。综上所述，这些数据表明，iPS-SMA细胞最初可以产生相同数量的神经元和运动神经元，但疾病表型选择性地阻碍运动神经元的产生和/或增加运动神经元在以后时间点的退化。尽管在分化6周后未观察到突触，但到8周时，通过iPS-WT SMI-32阳性运动神经元和非运动神经元上的点状突触蛋白染色鉴定出突触(图3i和补充图6)提示该系统中神经元突触前成熟。有趣的是，在iPS-SMA SMI-32阳性运动神经元上，突触蛋白染色仍呈弥漫性(图3j)尽管在SMI-32阴性细胞上观察到一些点状突触蛋白染色(图3j)再次表明SMA培养中存在特定的运动神经元缺陷。

药物诱导SMN蛋白增加

最后，我们评估了SMN诱导化合物是否可以提高iPS-SMA细胞环境中的SMN水平，因为这将是进一步开发药物筛选的重要原理证明。SMN蛋白存在于细胞质和称为gems的核聚集体结构中，且存在的gems数量与疾病严重程度呈负相关2因此，我们评估了在存在或不存在1mM丙戊酸或320μM妥布霉素的情况下，iPS-SMA和iPS-WT衍生的神经元和星形胶质细胞中的核宝石定位，这两种化合物可增加SMN蛋白水平31-33使用针对SMN的抗体，未经处理的Fib-WT和iPS-WT显示出丰富的核宝石，其特征是该蛋白的正常分布(图4 a、c). 未经处理的Fib-SMA和iPS-SMA细胞均显示出预期的核宝石缺乏(图4 b、d)为使用iPS-SMA细胞进行可靠的疾病建模提供进一步支持。药物治疗2天后，治疗后iPS-WT的宝石定位没有显著增加(图4 e、g、i)与未经处理的iPS-WT相比(图4 c，i). 然而，与未经处理的iPS-SMA细胞相比，丙戊酸和妥布霉素显著增加了经处理的细胞中gems的数量(图4 d、f、h、i). 我们通过western blot分析检测SMN蛋白进一步验证了这种增加。药物治疗两天后，iPS-WT细胞中的总SMN蛋白远远高于iPS-SMA细胞中的SMN蛋白(图4 j，k)由于后者缺乏SMN1的表达(图2b). 与未经处理的iPS-SMA细胞相比，用丙戊酸或妥布霉素处理的iPS SMA细胞的SMN蛋白水平分别显著增加2至3倍(图4 j，k). 我们目前正在评估运动神经元分化中的gem形成，并表明它们确实可以被检测到(补充图7). 总之，这些数据表明，iPS-SMA细胞对药物治疗的反应与Fib-SMA相似，并可能在未来的研究中用于针对运动神经元的新药筛选。

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iPS WT和iPS SMA细胞增加SMN蛋白以响应药物治疗。a、 c、，未经处理的Fib-WT和iPS-WT细胞显示核宝石定位，而b、 日期：，未经处理的Fib-SMA和iPS-SMA缺乏核宝石。f、 h、i、，丙戊酸钠或妥布霉素处理后，iPS-SMA细胞的gems数量显著增加（方差分析，p<0.05）。宝石用箭头表示。j、 k、，丙戊酸钠或妥布霉素治疗后的Western blot分析显示，与iPS-SMA细胞相比，iPS-SMB细胞中的SMN蛋白显著增加2-3倍（n=3 ANOVA，*p<0.05；**p<0.01）。数据以平均值±标准误差表示，比例尺=50μm。

讨论

以前研究SMA在人体组织中的机制依赖于患者的成纤维细胞或永生化非运动神经元细胞系。然而，该病最吸引人的一个方面是，SMN1蛋白在体内所有细胞中普遍缺失，导致运动神经元的特异性退化。SMN1已被证明形成复合物，参与小核RNA蛋白的产生，这些小核RNA蛋白质构成剪接体34-36最近，SMN1也被证明与运动神经元的神经元过程有关，并且可能在运动轴突中具有其他重要作用，但尚未完全阐明37,38使用携带SMA表型的人类运动神经元，该表型由这里描述的几乎无限来源的iPS细胞产生，这将有助于进一步阐明SMN1在疾病发生和发展中的新作用。

这是第一份观察到疾病对人类运动神经元存活和药物诱导的保护蛋白增加的特定影响的报告，从而验证了iPS模型至少可以重现这种遗传性疾病的某些方面。虽然当前研究中产生的运动神经元显示出适当的形态、特定标记和突触蛋白染色，但目前正在进行实验，以更全面地评估其功能，包括电生理学和与肌肉纤维的共培养。来自这个和其他患者来源的更多克隆也需要研究。这些是重要的下一步，以确保重新编程不会微妙地影响运动神经元正常工作的能力。然而，这一新模型应为旨在了解导致运动神经元功能障碍和死亡的SMA疾病机制的研究提供一个独特的平台，并有可能发现治疗这种破坏性疾病的新化合物。它还指出了使用iPS技术来更好地理解和开发其他一些遗传性疾病的治疗方法的未来。

方法总结

详细方法包含在“方法”部分中。SMA和WT成纤维细胞系来自Coriell医学研究所（新泽西州卡姆登）。如前所述进行成纤维细胞和iPS细胞培养的慢病毒感染16根据标准程序，使用特定引物进行PCR10月4日,SOX 2标准,NANOG公司,林28,霍克斯B4,SMN公司、和GAPDH公司如之前发布的16,22和显示在补充材料基因表达谱分析、DNA指纹分析和微阵列分析按照标准协议进行。神经诱导是根据以前发表的方法修改的26使用标准方案对巢蛋白（Chemicon，1:10000）、Tuj1（Sigma，1:5000）、GFAP（Dako，1:1000）、Olig2（Santa Cruz，1:100033，1:10）和突触素（钙生物化学，1:250）。使用尼康Eclipse E600显微镜和Spot图像软件获取荧光图像。使用Metamorph软件分析神经元计数和测量，并使用Prizm软件进行统计计算。

方法

iPS细胞培养与慢病毒感染

如前所述，iPS细胞保存在辐照小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）上16成纤维细胞（GM03813和GM03814，Coriell Inst.）在补充有10%热灭活胎牛血清的最低必需培养基（Eagle）（Invitrogen）中培养（HyClone实验室）。成纤维细胞的慢病毒转导如前所述进行16.

神经分化

胶原酶处理（1mg/ml，Gibco）后，将完整的iPS菌落从饲养层中取出，直接放入添加2%B27（Gibco，100 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，bFGF，Chemicon）的人类神经祖细胞生长培养基（Stemline，Sigma）中，生成iPS球，100ng/ml表皮生长因子（EGF，Chemicon）和5μg/ml肝素（Sigma）放在多血涂布的烧瓶中，以防止附着，并使用切碎技术每周传代一次24为了诱导神经元和星形胶质细胞分化，用accutase（Chemicon）将球体分离，并将其镀在Stemline/2%B27中不含bFGF、EGF和肝素的聚鸟氨酸/层粘连蛋白（Sigma）涂层盖玻片上1周。为了诱导运动神经元分化，将球体置于神经诱导培养基（1:1 DMEM/F12和1%N2补充剂（Gibco）中，加入维甲酸（RA，0.1μM）1周，然后再加入声波刺猬（SHH，100ng/ml，R&D）一周。然后将球体镀在添加了cAMP（1μM）、抗坏血酸（200 ng/ml）、BDNF和GDNF（均为10 ng/ml，PeproTech Inc.）的RA/SHH培养基中的聚鸟氨酸/层粘连蛋白涂层盖玻片上，再持续2-6周。

RNA分离和PCR分析

使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）和柱上DNase I消化或Tri-Reagent（Sigma）分离总RNA。cDNA是使用SuperScript III（Invitrogen）从1-4μg总RNA中生成的。使用特定引物序列进行RT-PCR和/或qRT-PCR(补充表3). FL和Δ7SMN公司产品经过凝胶纯化，并用Dde1特异性裂解进行消化SMN2型给出预期带宽大小：713nt（未消化FL）、436nt和277nt(SMN2型FL）、382nt和277nt(SMN2型Δ7).

核型分析和DNA指纹分析

WiCell研究所（威斯康星州麦迪逊）的细胞遗传学实验室进行了标准G带染色体分析。为了确认iPS-SMA和iPS-WT细胞的成纤维细胞来源，Cell Line Genetics（威斯康星州麦迪逊）进行了短串联重复序列（STR）分析。

畸胎瘤形成

将辐照MEF上生长的iPS-WT克隆4.2、iPS-SMA克隆3.5和克隆3.6（～50%融合）的两个10厘米培养皿注射到两只小鼠的后肢肌肉中。所有iPS克隆都会引起畸胎瘤。对照小鼠注射～8.5×106光纤-WT和11×106Fib SMA不能形成畸胎瘤。7-10周后对畸胎瘤切片进行苏木精和伊红染色。

微阵列分析

使用携带54675个探针组（Affymetrix）的人类基因组U133 Plus 2.0基因芯片阵列进行微阵列杂交，以检测全球基因表达。按照制造商的说明，使用MessageAmp™Biotin II增强IVT试剂盒（Ambion）标记每个样品中约3μg的RNA。所有阵列在45°C下杂交16小时，并使用AFX GC3000 G7扫描仪进行扫描。

使用AFX expression Console软件提取基因表达原始数据。根据Affymetrix质量控制指标进行质量控制。然后在R统计环境中分析合格的数据集，该环境根据GNU通用公共许可证免费提供(http://www.r-project.org)使用生物导体库(http://www.bioconductor.org). 通过分位数方法对所有芯片进行归一化39并使用稳健的多阵列分析（RMA）校正背景40然后使用中值抛光进行总结40以获得探头组水平测量。通过取代表共同登录号的探针集的平均对数强度值，54675个探针集被折叠为51337个转录物。以1-PCC（皮尔逊相关系数）作为距离测度进行层次聚类分析。集群成员之间的最大距离被用作将低级别集群（完整链接）合并为高级别集群的基础。将多尺度自举重采样（10000个自举）应用于分层聚类，计算假设的p值，并确定每个聚类的自举概率41.

热图生成与数据可视化

对于每个基因，计算五个正常人ES细胞系和两个SMA/WT成纤维细胞系的平均表达水平。计算SMA/WT成纤维细胞系中所有基因相对于人类ES细胞中相应平均值的折叠变化。选择SMA/WT成纤维细胞中最特异表达的前25个基因和已知在人类ES细胞中富集的30个基因进行热映射生成。这55个基因的对数强度是标准化的，因此它们在所有样本中的表达值的平均值为0，标准偏差为1。标准化值被重新排序并显示在热图中，光谱范围从绿色（低水平）到红色（高水平）。

免疫细胞化学

细胞在4%多聚甲醛或1:1丙酮/甲醇中室温固定20分钟，用PBS冲洗。非特异性标记被阻断，细胞在室温下用5%正常山羊血清和/或5%正常驴血清和0.2%Triton X-100在PBS中渗透30分钟。用PBS冲洗细胞，然后在室温下与一级抗体孵育1小时或在4°C下过夜。然后用适当的荧光标记二级抗体标记细胞。Hoechst核染料用于标记细胞核。使用Metamorph软件对100个细胞核中的宝石进行计数，并对3张盖玻片中每个盖玻片上5个区域的阳性染色神经元进行计数和测量。所有数据均使用Prizm统计软件进行分析。

蛋白质分离和蛋白质印迹分析

分离细胞，将其悬浮在添加有1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）的1%Triton X-100裂解缓冲液中，研磨并在4°C下以13000 rpm离心10 min。在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离10至20μg蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，用针对SMN（小鼠单克隆）的一级抗体进行探测，然后用辣根过氧化物酶结合二级抗体（Promega）进行探测，再用ECL化学发光（Amersham）进行可视化。作为对照，剥离细胞膜并重新分泌β-肌动蛋白。对于半定量分析，分析SMN信号强度，并针对β-肌动蛋白进行校正。

补充材料

补充图_ Ta

单击此处查看。（270万，pdf）

致谢

作者感谢Jason Meyer的有益讨论，以及Brandon Shelley、Brittany Heins和Erin McMillan的技术援助。我们还感谢威斯康星州麦迪逊WiCell研究所的核型分析；细胞系遗传学，威斯康星州麦迪逊，用于DNA指纹；威斯康星州麦迪逊Morgridge研究所的Ron Stewart、Shulan Tian和Victor Ruotti负责微阵列分析；以及位于威斯康星州麦迪逊的Promega Corp.进行qRT-PCR分析。MNR2/HB9（81.5C10）和Islet-1（40.2D6）单克隆抗体（均由Thomas Jessell博士开发）来自发育研究杂交瘤库。ALS协会和NIH/NINDS提供了资金支持（PO1NS057778至CNS）。

脚注

贡献：ADE参与了所有方面并准备了手稿；JY生成并协助鉴定iPS-SMA和iPS-WT克隆；FR、VBM和CLL进行SMN分析和手稿准备；JAT参与了iPS克隆的产生；CNS构思了该项目，并参与了规划、数据分析和手稿准备。作者声明没有竞争性的经济利益。

补充信息附在纸上www.nature.com/nature（自然）概述主要结果的示意图如下补充图1.

工具书类

1Lefebvre S等人。一种脊髓肌肉萎缩决定基因的鉴定和特征。单元格。1995;80:155–165.[公共医学][谷歌学者]
2Coovert DD等。脊髓性肌萎缩中的存活运动神经元蛋白。人类分子遗传学。1997;6:1205–1214.[公共医学][谷歌学者]
三。Crawford TO，Pardo CA。儿童脊髓性肌萎缩症的神经生物学。神经生物学疾病。1996;三:97–110.[公共医学][谷歌学者]
4Munsat TL，Davies KE.神经肌肉疾病；国际SMA联合体会议；1992年6月26日至28日；德国波恩。1992年，第423–428页。[公共医学][谷歌学者]
5Lorson CL，Hahnen E，Androphy EJ，Wirth B。SMN基因中的一个单核苷酸调节剪接并导致脊髓性肌萎缩。美国国家科学院院刊。1999;96:6307–6311. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
6Lefebvre S等。脊髓性肌萎缩严重程度与SMN蛋白水平的相关性。自然遗传学。1997;16:265–269.[公共医学][谷歌学者]
7Schmid A，DiDonato CJ。脊髓性肌萎缩的动物模型。儿童神经学杂志。2007;22:1004–1012.[公共医学][谷歌学者]
8Schrank B等人。人类脊髓性肌萎缩症的候选基因运动神经元存活基因失活，导致早期小鼠胚胎中大量细胞死亡。美国国家科学院院刊。1997;94:9920–9925. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
9DiDonato CJ等。小鼠存活运动神经元基因的克隆、表征和拷贝数：脊髓肌萎缩决定基因的同源物。基因组研究。1997;7:339–352.[公共医学][谷歌学者]
10Xieh-Li HM等。脊髓性肌萎缩小鼠模型。自然遗传学。2000;24：66–70。[公共医学][谷歌学者]
11Monani UR等人。人类着丝粒存活运动神经元基因（SMN2）拯救了Smn（-/-）小鼠的胚胎致死性，并导致脊髓性肌萎缩小鼠。人类分子遗传学。2000;9:333–339.[公共医学][谷歌学者]
12Le TT等。SMN Delta 7是着丝粒存活运动神经元（SMN2）基因的主要产物，它延长了脊髓性肌萎缩小鼠的存活时间，并与全长SMN相关。人类分子遗传学。2005;14:845–857.[公共医学][谷歌学者]
13Park IH等。用特定因子将人体体细胞重新编程为多能性。自然。2008;451:141–146.[公共医学][谷歌学者]
14Jaenisch R，Young R.干细胞，多能性和核重编程的分子电路。单元格。2008;132：567–582。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
15Takahashi K等。通过特定因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。单元格。2007;131:861–872.[公共医学][谷歌学者]
16于杰，等。从人体体细胞诱导多能干细胞系。科学。2007;318:1917–1920.[公共医学][谷歌学者]
17Lowry WE等。从皮肤成纤维细胞中生成人诱导的多能干细胞。美国国家科学院院刊。2008;105:2883–2888. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Dimos JT等。ALS患者产生的诱导多能干细胞可以分化为运动神经元。科学。2008;321:1218–1221.[公共医学][谷歌学者]
19Park IH等。疾病特异性诱导多能干细胞。单元格。2008;134:877–886. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
20Jakel RJ、Schneider BL、Svendsen CN。使用人类神经干细胞模拟神经疾病。Nat Rev基因。2004;5:136–44.[公共医学][谷歌学者]
21Gavrilov DK、Shi XY、Das K、Gilliam TC、Wang CH。SMN2表达差异与SMA严重程度相关。自然遗传学。1998;20:230–231.[公共医学][谷歌学者]
22Sumner CJ等。外周血中SMN mRNA和蛋白水平：SMA临床试验的生物标记物。神经病学。2006;66:1067–1073.[公共医学][谷歌学者]
23Fox V等。通过NOTCH的细胞-细胞信号调节人类胚胎干细胞增殖。干细胞。2008;26:715–723.[公共医学][谷歌学者]
24Svendsen CN等人。一种快速长期生长人类神经前体细胞的新方法。神经科学方法杂志。1998;85:141–52.[公共医学][谷歌学者]
25Lendahl U、Zimmerman LB、McKay RDG。干细胞表达一类新的中间纤维蛋白。单元格。1990;60:585–595.[公共医学][谷歌学者]
26李晓杰，等。人类胚胎干细胞运动神经元的规范。国家生物技术。2005;23：215–221。[公共医学][谷歌学者]
27Jessell TM。脊髓中的神经规范：感应信号和转录代码。Nat Rev基因。2000;1:20–29.[公共医学][谷歌学者]
28Wichterle H、Lieberam I、Porter JA、Jessell TM。将胚胎干细胞定向分化为运动神经元。单元格。2002;110:385–397.[公共医学][谷歌学者]
29Carriedo SG、Yin HZ、Weiss JH。运动神经元在体外选择性地易受AMPA/红藻氨酸受体介导的损伤。神经科学杂志。1996;16:4069–4079. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30莫纳尼UR。脊髓性肌萎缩：普遍存在的蛋白质缺乏；运动神经元特异性疾病。神经元。2005;48:885–896.[公共医学][谷歌学者]
31Brichta L等。丙戊酸可提高SMN2蛋白水平：这是一种众所周知的治疗脊髓性肌萎缩的潜在药物。人类分子遗传学。2003;12:2481–2489.[公共医学][谷歌学者]
32Sumner CJ等。丙戊酸增加脊髓性肌萎缩患者细胞中的SMN水平。Ann Neurol公司。2003;54:647–654.[公共医学][谷歌学者]
33Wolstencroft EC、Mattis V、Bajer AA、Young PJ、Lorson CL。SMN蛋白活性的非序列特异性要求：氨基糖苷在诱导升高SMN蛋白水平中的作用。人类分子遗传学。2005;14:1199–1210.[公共医学][谷歌学者]
34Pellizzoni L，Yong J，Dreyfuss G。SMN复合体在snRNP组装特异性中的重要作用。科学。2002;298:1775–1779.[公共医学][谷歌学者]
35Fischer U，Liu Q，Dreyfuss G.SMN-SIP1复合物在剪接体snRNP生物发生中起着重要作用。单元格。1997;90:1023–1029.[公共医学][谷歌学者]
36Liu Q，Fischer U，Wang F，Dreyfuss G。脊髓性肌萎缩症基因产物SMN及其相关蛋白SIP1与剪接体snRNP蛋白复合。单元格。1997;90:1013–1021.[公共医学][谷歌学者]
37Carrel TL等。运动轴突中的存活运动神经元功能独立于小核核糖核蛋白生物生成所需的功能。神经科学杂志。2006;26:11014–11022. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
38Zhang HL，et al.运动神经元蛋白SMN的存活多蛋白复合物与运动神经元的神经元过程和生长锥的双子转运。神经科学杂志。2006;26:8622–8632. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
39Bolstad BM、Irizarry RA、Astrand M、Speed TP。基于方差和偏差的高密度寡核苷酸阵列数据归一化方法的比较。生物信息学。2003;19:185–193.[公共医学][谷歌学者]
40Irizarry RA等。高密度寡核苷酸阵列探针水平数据的探索、规范化和总结。生物统计学。2003;4:249–264.[公共医学][谷歌学者]
41铃木R、岛田英彦H.Pvclust：用于评估层次聚类中不确定性的R包。生物信息学。2006;22:1540–1542.[公共医学][谷歌学者]