体外和体内急性酒精暴露模型

摘要

简介

酒精滥用在全球广泛传播[1–9]. 酒精是美国可预防死亡的第三大原因，也是发达国家健康年死亡和残疾的第三主要原因[9]. 当饮酒频繁且产生依赖性时，人类会急性或慢性使用和滥用酒精[10]. 尽管在过去几十年里，酒精研究领域取得了重大进展，但酒精使用和滥用的发病机制尚未完全了解。此外，大多数研究都集中于酒精中毒，这是酒精滥用的晚期阶段，涉及慢性酒精消费、酒精依赖以及严重的健康和社会后果[1–13]. 因此，为了详细说明是什么驱动了人们饮酒的欲望，身体对酒精的反应，以及最重要的是，急性饮酒对人体的有益和有害影响，研究模型应运而生。

急性酒精滥用（AAA）：问题到底有多严重？

在美国，“饮料”的定义是相当于14克酒精，约等于1杯[1.25盎司40%（80度）烈性酒]、1（12盎司）啤酒（4.2毫升/升，乙醇）或1（4盎司）杯葡萄酒（12毫升/升（乙醇）[14]. 在其他国家，一份酒的酒精含量以“单位”计量。一个单位（约25 mL 40%80度酒精溶液）含有7.9 g纯乙醇[8,15]. 然而，在许多国家，“标准饮料”被用来量化酒精摄入量。更重要的是，各国的标准饮料差异很大，从英国的10毫升（7.9克）酒精到日本的25毫升（19.75克）[16]. 当前使用包括过去30天内至少一杯饮料；狂饮是指在过去30天内，在2小时内至少一次在同一场合喝五杯或五杯以上；重度饮酒是指在过去30天中至少5天内，在同一场合喝5杯或更多的酒[11–13]. 0.08%的血液酒精浓度（BAL）是美国大多数州的法定限值，成年男性饮酒五杯或以上，成年女性饮酒四杯或以上即可达到此限值[11–13].

传统医学研究关注慢性酒精滥用的机制；这是因为社会主要面临慢性酒精滥用者带来的巨大经济负担[1–13]. 然而，最近严重的酒精滥用已成为一个社会问题[17]. 国家药物使用与健康调查（NSDUH）估计，2004年美国约有440万人首次饮酒，每天约有12000名“新兵”；这一数字明显高于2002年（390万）和2003年（410万）。在440万新近开始饮酒的人中，大多数（86.9%）在见面时年龄小于21岁。在2004年调查之前的30天内，超过五分之一（22.%）的12岁或以上的人至少参与过一次狂饮[12]. 与其他年龄组相比，2004年18至25岁年龄组以暴饮形式摄入的急性酒精最高，峰值发生在21岁[1,5–7,11–13]. 统计数据还显示，年轻人的疾病和死亡主要是由生活方式选择和行为造成的，包括过度饮酒[18,19].

AAA：生物医学影响

AAA的已知生物效应包括中枢神经系统（CNS）和非CNS来源的生物效应。饮酒的特征是中枢神经系统中毒、大脑活动受损、运动协调性差和行为改变[20,21]. 由于酒精对合成的影响，AAA导致中枢神经系统活动受损[22]，释放[23]和信号[23,24]神经递质，包括血清素[25,26]，谷氨酸[27]、GABA[28]，内源性大麻素类[29,30]及其受体。AAA导致胃肠道（GI）损伤和功能损害，包括胃肠道[31–38]，肝脏[39–55]和胰腺[56,57–62]; 它还影响蛋白质、碳水化合物和脂肪代谢[58,63–66]. AAA导致免疫系统对感染的反应不足；这种缺陷在器官特异性[67–69]和全身感染[70–72]. 急性酒精中毒损害宿主抵抗出血性休克的能力[73]，增加皮质类固醇的释放[74]延迟伤口愈合[75–78]从而导致更高的发病率和死亡率[79]以及长期的创伤恢复[80]. AAA对人类健康影响的发病机制尚不完全清楚。

AAA模型

对急性酒精消费/滥用的研究完全基于模型，因为它们具有可控环境的优势。目前有在体外和体内AAA模型；其特性如表所示​表1。1与慢性酒精滥用相反，由于回忆偏见，AAA的研究没有从人群研究中受益[81–84].

AAA模型的一个重要特征是定义具有生物学意义的酒精水平在体外或体内以及它们与人类血液酒精水平（BAL）的关系。这是AAA研究模型的一个重要要求，因为只要摄入少量酒精，就可以检测到BAL[85]然而，酒精对生理和/或行为的可测量影响确定为0.08%或以上，个体差异取决于物种、代谢特性、年龄、性别和遗传背景[86–97]. 同样重要的是，确认AAA模型在实现酒精中毒的酒精输送途径上有所不同，其中一些是生理性的，如口服，而另一些是非生理性的。然而，目前的研究表明，BAL水平，而不是饮酒途径，在确立酒精的生物效应方面起着主要作用[97].

因此，最佳的AAA模型应满足以下几个标准：（1）确定饮酒时间。体外急性酒精治疗的时间长短在不同的已发表实验设置中是可变的，从几秒到几小时不等；目前公认，酒精治疗长达24小时被视为急性发作[98–106].体内一次性饮酒意味着一次性摄入足量的酒精，而NIAAA将“狂欢”定义为过度饮酒，在2小时内产生的BAL大于0.08%，可能与依赖性有关，也可能与依赖无关[11,12,17,18]. 因此，任何使用2小时内生物活性酒精消耗量的模型都被视为AAA的可接受模型[81,107–121]. （2） 确保接触到准确浓度的乙醇。对于在体外研究表明，10-100 mmol/L的乙醇范围被视为生理范围，25 mmol/L的乙醇接近0.08%的BAL体内在4-5杯当量的饮料后[7,11,12,98–106]. 对于体内研究表明，0.08%BAL或高于此水平会产生中毒症状，并且在大多数生物医学研究中使用[107–121]. （3） 招募目前没有或从未酗酒的人体内研究和使用醇-核酸原代细胞或细胞系在体外研究。研究参与者的饮酒习惯通常通过问卷调查确定[122]. 最常用的问卷包括审计和CAGE测试问卷[123–125]; 研究参数通常允许男性每周饮酒少于9杯，女性每周饮酒少于6杯。

体外试验AAA模型

这个在体外酒精处理模型是基于在培养基中补充纯酒精，通常是200度乙醇。目前，生物医药文献中报道了用各种酒精浓度（从1到500 mmol/L）补充细胞培养物。主要关注点之一是在体外浓度超过100 mmol/L的酒精处理是酒精对细胞的直接细胞毒性作用[40,100]. 在较低浓度（<100 mmol/L）下，酒精改变细胞的氧化还原状态并改变细胞间连接[33,126]，增加细胞膜流动性[127–129]并影响脂筏的组成[106,130,131]所有这些都可能导致酒精介导的细胞间和细胞旁通透性增加[132,133]从而影响细胞功能[106,130–134]. 酒精也会影响粘附分子的表达[135]，这可能是使用粘附细胞类型时的一个问题，因为可能会发生细胞分离。修改的可能性引起了其他关注体外一些原代细胞的功能，包括肝细胞、星状细胞及其前体，由于受到限制体外环境与体内条件[136–138].

从技术角度来看，细胞急性酒精暴露在体外酒精蒸发可能会阻碍。为了避免酒精浓度因蒸发而波动，研究人员使用的设置是，将乙醇添加到培养基中，并在37°C的小气候室中用混合气体和酒精气氛在整个刺激期间保持细胞培养板[139]. 例如，如果细胞培养物中所需的乙醇浓度为25 mmol/L，则在培养箱底部放置一个2倍乙醇量（50 mmol/L.）的培养皿，以确保培养箱中气体的饱和）；在这种条件下，24小时内保持初始酒精浓度±15%[139]. 然而，根据研究的科学问题，酒精水平下降在体外可能需要模拟酒精消除体内; 在这些情况下在体外酒精代谢的缺乏/限制使实验处于不利地位[76,134].

这个在体外AAA模型提供了初级的可能性在体外酒精活性细胞单独暴露于酒精或其与多种药理或天然衍生物质的组合[24,28,31,35,36,42,55,68,71,72,96,103]，而且还调查了体内接触酒精后体外接触其他兴奋剂[110,113,115]或反之亦然。的另一个主要特征在体外AAA模型简单，根据研究目标，通常被视为优缺点。大多数在体外研究涉及单个细胞类型的培养[134,139–142]或多种细胞类型的共培养[143]; 虽然这种方法提出了酒精对纯细胞群体和/或细胞间相互作用的不同影响；它缺乏系统的酒精代谢和细胞间的相互作用。最近，在建立更复杂的基础设施方面投入了大量精力在体外系统，如三维系统中的细胞培养[100]，器官切片[144]或器官移植[145]; 尽管迄今为止，这些系统在慢性酒精暴露的背景下提供了信息，但没有报告将其用作AAA模型。

在VIVO中AAA车型

这个体内与在体外模型由于酒精对所有身体器官和系统的复杂生理影响，也由于酒精可用于全身代谢。目前有人类和非人类AAA模型，后来包括无脊椎动物的使用[146,147]和脊椎动物[21,25,37,44,46,47,53,65,72,86,93,94,98,104,110,111]. 无脊椎动物模型（黑腹果蝇[146,147]，秀丽隐杆线虫[105])以及那些使用低等脊椎动物的鱼类（斑马鱼Danio rerio）[98]对于研究酒精对行为、记忆发育和维持以及基本信号机制的影响是非常宝贵的。这些模型的优点是具有明确的遗传背景，由于生命周期短，实验周转率高，成本相对较低；鉴于这些优势，它们构成了研究信号通路的优秀资源，并对其药物筛选能力非常理想。缺点是，与人类相比，器官和系统的结构和功能的显著差异限制了无脊椎动物和低等脊椎动物AAA模型的信息价值。

由于脊椎动物的身体结构、功能和新陈代谢与人类相似，因此脊椎动物模型比使用无脊椎动物模型更受欢迎。然而，由于人类与其他脊椎动物之间的内在差异，没有一个单独的非人类模型是完美的，因为没有一个模型能够代表复杂人类特征的所有特征，例如社交偶尔或狂欢饮酒的动机、酒精依赖的发展以及对健康影响的确立。此外，研究模型的受控设置对于心理学和社会研究可能并不完全令人满意，因为它们可能无法完全再现酗酒的社会成分、动机和自发性。然而，研究模型对于理解酒精的影响及其对身体硬连线系统（包括大脑和所有其他器官和系统）的作用机制是非常宝贵的。

AAA人体模型

实验环境中的人体酒精摄入是AAA的最佳可用模型，因为它提供了酒精摄入的生理途径、研究人体病理生物学的可能性以及用于研究的相对大量生理体液的可用性的优势。AAA人体模型的缺点包括与过度或反复中毒潜在有害健康影响相关的伦理问题，以及即使在一次性饮酒后仍可能发展依赖性或耐受性的理论可能性。人类AAA的已发表模型基于饮用含有蒸馏乙醇或葡萄酒的酒精饮料；这些模型是生理学的，因为它们涉及饮酒，并实现了具有生物学意义的BAL[87,92,107,110–113,115]. 大多数报告体内人类AAA模型根据每公斤体重的酒精恒定量严格控制酒精含量，包括安慰剂治疗的年龄和性别匹配对照。然而，大多数研究都设计了在2小时内饮用酒精饮料[92,107,110–113]根据NIAAA和NSDUH的最新分类，这属于狂欢饮酒[11–13,17]. 因此，AAA人体模型的主要缺点是：（1）无法明确区分一次性饮酒模式和狂欢饮酒模式，以及（2）出于道德原因，不允许长时间狂欢，这在现实生活中经常出现，并且是年轻人大量饮酒的主要原因[5,7,11–13,17–19].

为了满足AAA模型的要求，人类研究通常包括不饮酒的人，他们在研究前至少24小时没有饮酒。根据研究设计，一些AAA人体模型要求研究参与者不服用任何药物，而其他人接受个人服用中等剂量的抗高血压药物和口服避孕药[107,110]. 研究参与者通常被要求在饮酒前至少6小时禁食，并允许在研究前或研究后不久免费饮用水和便餐[107]. AAA人体模型目前用于生理学研究[86,92,111,122]，血液学[107,128]和免疫学[110,113,115].

蒸馏乙醇消耗模型

在该模型中，研究人员饮用蒸馏酒精（通常为80度伏特加），其量约为0.5-0.6 g/kg体重，相当于标准总体积液体（300-450 mL水或橙汁）中约2 mL伏特加/kg体重[92,107,110–113].

非蒸馏乙醇消耗模型

在这个模型中，研究人员饮用的葡萄酒相当于预先确定的每公斤体重的乙醇量（例如，Fehr等人[107]报告称，每公斤体重使用4.36毫升红酒，相当于每公斤体重0.5克乙醇，在前2小时内，BAL峰值约为15 mmol/L），而对照个体则以随机方式通过口接触到相同体积的液体（通常是水）。该模型的主要缺点是使用了与热量摄入或成分不匹配的受控液体体积，这在技术上很难实现，因为等效无醇化合物的可用性有限。为了绕过偏见，一些研究采用了交叉方法，每个受试者作为自己的对照，并根据交叉设计，在第一次实验后至少2周内用酒精或安慰剂重复研究[107].

非人类AAA模型

灵长类动物是参与酒精研究的非人类脊椎动物[90,91,148]，头猪[104,120]，只狗[114,121]，只老鼠[70,72,74,86,89,96,109,118,119,141]，只大鼠[88,94,108,149,150]和兔子[132]. 啮齿动物AAA模型（小鼠和大鼠）因其相对明确的遗传背景和多种遗传特征的可用性而最常用，包括那些编码高或低酒精摄入的遗传特征[88,89,96,109]. 目前使用的大多数非人类AAA模型[93,95]检查含酒精瓶子与含酒精瓶子的相对口服自我给药情况[86,94,108]或多瓶[119]含有水（偏爱饮用）或违心饮酒，或通过生理途径（通过口灌）[54,71,72]或非生理性（肠外）[67,68]路由。由于饮酒的生理途径和模式，自愿饮酒可能是AAA的最佳动物模型。然而，在自我给药模型中，尚不清楚动物何时或是否饮酒达到药理学显著水平，因为饮酒是间歇性的，通常会持续24小时。然而，这些模型对于研究急性酒精中毒的神经生物学和建立成瘾机制是非常宝贵的。AAA模型使用酒精管理，这将绕过AAA模型自愿消费的所有上述不便。通过生理途径（经口灌胃）或非生理途径（肠外）给药的酒精对中枢神经系统和不受酒精给药途径直接影响的器官/系统（如肌肉和大脑）产生类似的生理效应[97]. 然而，与肠外途径给药相比，经口给药更符合生理学，产生有意义的BAL水平，并显示急性酒精中毒迹象[54,71,72,132,149]. 一次性饮酒的缺点包括技术挑战、时间消耗和手术费用高。相比之下，通过肠外途径给药在技术上相对容易执行，并提供受控设置（时间、量）；另一方面，它们可能不太适合研究酒精对直接受酒精给药途径影响的器官/系统的影响。在这种情况下，与其他给药途径（如静脉或肠内给药）相比，通过腹腔途径给药酒精可能不太适合使用腹腔巨噬细胞，甚至肝脏和肠道进行研究。此外，由于操作技术难度的不同以及酒精对不同细胞类型的影响，一些注射外酒精给药方法优于其他方法。例如，已知静脉注射酒精在高浓度时会影响红细胞[128]. 因此，静脉注射酒精目前仅限于在戒酒症状治疗期间产生急性酒精暴露[151]，而在研究环境中，腹腔注射给药被广泛接受。

与人类AAA模型类似，非人类体内模型使用蒸馏酒精[53,67–72,74,89,90,96,109,116,119,121,132,135,141,152]或含酒精饮料，如葡萄酒[152,153]还有啤酒[46]; 对照组通常使用无酒精热量和成分当量进行治疗。脊椎动物AAA模型广泛用于研究AAA的生物医学效应，包括大脑[23–30,116]，胃肠道[38–44,46–48,64–66,154]，血管[73,153]，肌肉[97]和免疫[68–72,74]系统。

胃肠病学研究中AAA模型的特殊性

与大量有关慢性酒精滥用对胃肠系统影响的文献相比，对急性酒精滥用对消化道（GI）影响的研究仅限于某些细胞类型，如表所示​表22.

目前，科学知识的状态表明器官和系统之间存在紧密的相互作用。胃肠系统依赖于血液循环和代谢物的系统可用性，受到中枢和自主神经系统的密切控制[155,156]含有常驻和招募免疫细胞的特征[157,158]. 因此，可以想象，酒精对这两个系统的直接影响将间接影响胃肠系统的功能；这个地区目前基本上还没有开发。

从技术角度来看，GI研究可以利用这两个优势在体外和体内AAA型号；然而有些体内由于高浓度酒精与胃肠组织之间存在非生理性直接接触，因此模型可能不太适合，例如那些通过腹腔途径进行静脉注射酒精的模型。

酒精使用/滥用与急性危及生命的疾病有关，包括急性酒精性肝炎[45]或急性胰腺炎[159]. 大多数患者报告急性酒精滥用，这通常与戒除甚至停止慢性酒精滥用重叠，或者是在狂饮之后[45,159]. 因此，很难将这些疾病与单次AAA联系起来，但它们并不符合经典的慢性酒精滥用画面。这类酒精滥用被定义为“急性-慢性”，需要为胃肠道研究建模。

展望未来，我们目前缺乏关于急性酒精滥用对胃肠道不同部分、肝功能和胰腺（包括内分泌和外分泌功能）的影响的深入知识。此外，我们不知道急性饮酒是否会影响胃肠道干细胞和/或参与胃肠道衍生肿瘤的发展。

脚注

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