介绍
T淋巴细胞在与同源抗原呈递细胞结合时被激活。这些细胞接触区的多个受体-配体相互作用，即免疫突触，决定了这一遭遇的结果(哈帕和戴维斯，2003年). 关键激活信号由T细胞抗原受体（TCR）与抗原呈递细胞表面表达的同源肽-主要组织相容性复合体连接后提供。TCR信号通过信号蛋白复合物传递到T细胞内部，该复合物聚集在T细胞质膜中(Harder，2004年).
已经确定了许多蛋白质，它们驱动TCR信号组件的形成和维持。细胞溶胶信号酶和衔接蛋白，如PLCγ和Grb2，与跨膜蛋白连接子相互作用，以激活T细胞（LAT）和TCR复合物的亚单位(陈等, 1992；张等, 1998；Harder和Kuhn，2000年). 单分子显微镜显示，TCR的激活诱导膜域的形成，膜域是由蛋白质-蛋白质相互作用网络构建的，该网络排除或捕获特定的信号蛋白(道格拉斯和维尔，2005年；铃木等2007年a).
参与TCR信号转导的质膜域被认为是脂筏的特性，导致胆固醇、鞘脂和饱和甘油磷脂的功能分离。在模型膜研究的基础上，建议脂筏采用浓缩液相有序（Lo）状态，与非脂筏液相双层共存(布朗和伦敦，1997年；韦奇和凯勒，2003年；Simons和Vaz，2004年). 在Lo期，平面胆固醇环系统与磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM）的饱和脂肪酸部分对齐。从生物物理的角度来看，TCR信号位点的raft结构域的概念得到了实验支持：Laurdan双光子荧光显微镜显示，与其他质膜区域相比，参与TCR激活的T细胞质膜结构域更加浓缩(高斯等, 2005).
尽管膜组织的筏式概念一直存在争议(蒙罗，2003年；Shaw，2006年)通过应用新方法的研究，该模型现在得到了越来越多的接受。目前，脂筏被认为是动态的、纳米大小的固醇、鞘脂、饱和甘油磷脂丰富的膜域(汉考克，2006). 这些亚稳态膜组件可以通过脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用局部稳定，结合形成细胞表面受体信号转导的功能域(西蒙斯和图姆，2000年). 事实上，图像分析和单分子追踪显示，细胞溶质脂肪酸锚定的raft标记物在T细胞激活域积聚或限制(艾克等, 2003；塔瓦诺等, 2006). 然而，缺乏支持在TCR信号质膜结构域形成有序膜相的不同分子脂质种类积累的直接证据，因此TCR活化位点的脂筏聚结问题仍有争议(蒙罗，2003；Shaw，2006年).
在这里，我们采用了一种直接的方法来研究质膜中的TCR激活域是否表现出特征性的分子脂质组成。为此，我们采用质谱法对免疫隔离天然TCR激活域的分子脂质组成进行了全面分析，并将其与富含转铁蛋白受体（TfRs）的对照质膜片段进行了比较。我们首次提供了胆固醇、SM和不同甘油磷脂物种在TCR激活域的功能分离的直接证据，从而强调了脂质组成对定义这些质膜域的重要性。
结果
免疫分离制备的独特质膜组分
我们使用一种已建立的免疫分离程序来分离携带TCR激活机制的天然T细胞质膜片段(Harder和Kuhn，2001年). 涂有TCR-活化αCD3抗体的磁珠在0°C下与Jurkat细胞结合，并在转移至37°C 3和10分钟后发生活化。通过氮气空化使磁珠-细胞结合物机械均质。分离与磁珠结合的质膜片段，并进行蛋白质印迹分析和定量质谱脂质分析。考虑到αCD3免疫分离物中TCR信号蛋白组合的特异性和时间依赖性浓度，它们可以作为TCR活化质膜域的替代物(Harder和Kuhn，2000年,2001). 作为对照，我们建立了一种类似的Jurkat质膜片段的α-TfR免疫分离，其富含TfR，但缺乏TCR信号机制(Harder和Kuhn，2000年).
为了确定免疫隔离方法的使用，以表征和比较不同免疫隔离质膜域的分子脂质组成，我们试图确定细胞内隔间的相对污染：使用LICOR Odyse™western blot系统测量αCD3和αTfR免疫分离物中不同膜标记物的数量，该系统可量化免疫反应带的信号强度。免疫分离物由5×10制成7Jurkat细胞和western blot信号强度与1.25×10的裂解物的信号强度相关5Jurkat电池相当于Jurkat起始材料的0.25%(). 如前所述，LAT质膜适配器蛋白集中在αCD3免疫隔离Jurkat质膜结构域中，反映了TCR信号机制的组装，并且TfR在αTfR免疫隔离物中积累(Harder和Kuhn，2000年).
(A类)αCD3和αTfR免疫分离的质膜片段中LAT、TfR、ER膜标记物calnexin和线粒体标记物细胞色素c氧化酶复合物1（MTCO1）的相对回收率。使用LICOR Odyse™western blot系统分析各个Jurkat细胞组分的蛋白质，该系统可以评估western blot信号的相对强度。使用5×10的相同免疫隔离制剂的信号7Jurkat细胞与1.25×10细胞裂解物的信号强度相关5Jurkat细胞（JCL，相当于免疫隔离所用细胞数量的0.25%）。这些印迹显示，在珠细胞偶联物37°C孵育3分钟和10分钟后，在两种免疫分离物中，ER和线粒体标记物在质膜相关的LAT和TfR上至少减少了5倍。免疫分离物中ER和线粒体没有选择性污染。(B)通过从免疫分离物中提取的PC和SM总量估算Jurkat类脂膜的回收率。通过PIS对PC和SM物种进行量化米/z184.1使用材料和方法中概述的内部标准进行分析。PC和SM的总含量计算为来自各个脂质类别的单个物种的总和。PC和SM的回收率随着珠-细胞结合物在37°C孵育的时间而逐渐增加。在右纵坐标上，脂质产量表示为PC在Jurkat细胞总数中的摩尔百分比(n个=3个独立实验，平均估计值±标准差）。
与之前的分析一致，在37°C孵育后，α-TfR免疫分离物中的LAT也被恢复，其量约为0.25%Jurkat细胞起始材料中LAT量的10-15倍(). 非活性LAT存在于静止Jurkat细胞的质膜中。因此，该值表明α-TfR免疫分离物的质膜回收率略高于之前估计的两种免疫分离物Jurkat细胞表面的1-2%回收率(Harder和Kuhn，2000年). 反之亦然，αCD3免疫分离物中的TfR被恢复，尽管与αTfR免疫分离物的LAT相比，这在相对于总细胞池的较低比例中发生(). 这可能反映了αCD3免疫分离物中细胞内体TfR池的丢失以及参与TCR信号传递的质膜域中TfR的耗竭。
我们接下来验证了αCD3和αTfR免疫分离物确实含有少量相似数量的细胞膜。我们使用各自的calnexin和MTCO1标记，通过这些蛋白印迹测定免疫分离物中ER膜和线粒体的恢复。结果使我们得出结论，在37°C孵育后，免疫分离株中回收的ER和线粒体标记物的数量不到总数量的0.04%(). 因此，免疫分离物强烈耗竭了相对于质膜的这些细胞内膜室，而质膜在整个质膜的1–2%范围内被回收(Harder和Kuhn，2000年). 该分析还表明，这两种免疫分离物中这些次要污染物的含量相似。额外的western blot分析显示，Jurkat细胞裂解液中ER标记物sec61和内质体GTPase Rab7的信号很强，尽管从200倍以上的Jurkat淋巴细胞制备的α-TfR和αCD3免疫分离物中几乎检测不到它们(补充图S1). 在进行脂质体分析之前，免疫分离物中TCR信号机制的积累、TfR浓度和质膜碎片的相对均一性通常通过这种蛋白印迹进行验证。
我们监测了αCD3和αTfR免疫分离物中膜脂的回收。我们通过前体离子扫描（PIS）对特征性磷酰胆碱片段离子定量免疫分离物脂质提取物中PC和SM的回收量米/z184.1 (). αCD3和αTfR免疫分离物均显示PC和SM的产量随时间增加，3到10分钟后相当于从同等数量的Jurkat细胞中提取的PC的0.1–0.3%(). 对照实验中，磁珠涂有IgG抗体并与Jurkat细胞孵育10分钟，回收的PC量最高，从未超过αCD3免疫分离物回收PC量的20%（数据未显示）。
总之，免疫隔离程序产生了两个不同的质膜片段，它们具有不同的蛋白质组成，细胞内的蛋白质和脂质也同样耗尽，脂质恢复的动力学也相似。值得注意的是，αCD3免疫分离物含有一部分非信号质膜，如某些TfR的存在所示().
为了表征免疫隔离质膜片段的分子脂质组成，我们使用了质谱法，该方法是为全面定量表征膜脂质体而开发的(弹出等, 2006). 将αCD3、αTfR免疫分离物和Jurkat细胞加入内部脂质标准并进行脂质提取。PC和SM物种由PIS确定米/z184.1分析(埃克鲁斯等, 2002；利比施等, 2004). 分子二酰甘油（DAG）、磷脂酸（PA）、磷脂酰甘油（PG）、磷脂乙醇胺（PE）、磷脂酰基丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）的种类由定量多重PIS测定(Ejsing公司等, 2006). 采用多重反应监测法分析神经酰胺（Cer）、己糖神经酰胺（HexCer）和二羟乙酰胺（Hex2Cer）的种类和胆固醇(弹出等, 2006；利比施等, 2006).
αCD3免疫分离物中SM、胆固醇和饱和PC的积累
对PC和SM物种的分析首次证明TCR激活域包含独特的分子脂质组成(补充图S2). 3分钟和10分钟后获得的αCD3免疫分离物显示SM物种显著富集（SM 34:1；2，米/z703.6，是最丰富的物种），与α-TfR免疫分离的质膜碎片和Jurkat细胞相比(和补充图S3). 此外，定量分析表明，αCD3免疫分离物在含有饱和脂肪酸部分的PC物种中系统地富集，而在含有多个双键的PC物种中将耗尽(). 相比之下，饱和PC物种的比例从αCD3免疫分离物中的30%下降到αTfR免疫分离物的20%和Jurkat细胞中的15%。在珠-细胞结合物孵育3分钟后，获得了αCD3免疫分离物独特的PC和SM物种组成(补充图S2A和B). 与α-TfR免疫分离物和Jurkat细胞相比，αCD3免疫分离物中含有36个或更多碳原子的PC物种数量减少，而含有32个碳原子的PC物种数量随之增加().
(A类)在αCD3和αTfR免疫分离物的脂质提取物和Jurkat细胞中检测到PC和SM物种的组成。通过PIS对PC和SM物种进行量化米/z184.1分析（代表性PIS米/z184.1光谱如所示补充图S2). 共鉴定和量化了39种PC和6种SM。为了清楚起见，我们只显示了26种最丰富的PC和SM物种的相对丰度（所有物种都在补充图S3). (B)免疫分离物和Jurkat细胞中检测到的PC物种的双键（db）组成的比较。(C)免疫分离物和Jurkat细胞中PC类总烃链长度的比较(n个=3个独立实验，平均估计值±标准差）。
通过比较αCD3和αTfR免疫分离物的脂质类组成，我们进一步表征了TCR活化质膜域的脂质体(). 3分钟和10分钟后，与Jurkat细胞相比，αCD3和αTfR免疫分离物富含胆固醇和SM(). 相比之下，αCD3免疫分离物的胆固醇含量比αTfR免疫分离物高约1.3倍。这些结果表明，TCR激活域的组成是独特的，其特征是胆固醇含量增加()SM和饱和PC物种，尽管具有多个双键的PC物种耗尽().
3分钟和10分钟37°C免疫分离物和Jurkat细胞的脂质类成分。与α-TfR免疫分离物相比，3分钟和10分钟αCD3免疫分离物显示出明显的脂质类组成，胆固醇和PS浓度较高，PI和PC显著降低。对于低丰度脂类（<1 mol%，插图）之间的差异，没有得出任何结论。质谱脂质分析可以识别和量化101种不同的脂质种类。脂质类别的摩尔%计算为相应脂质类别的所有检测到的脂质种类的摩尔%的总和。插图显示了低丰度脂质类的组成。在所有重复实验中，PA、DAG、PG、Cer、HexCer和Hex2Cer物种均检测到低水平(n个=3个独立实验，平均估计值±标准差）。
CD3-免疫隔离TCR信号结构域中PS、PI和PE物种的特征组成
接下来，我们评估了据信主要存在于细胞质膜小叶中的甘油磷脂PS、PI和PE的组成() (扎乔夫斯基，1993年；范·米尔等, 2008). 我们观察到，与α-TfR免疫分离物相比，αCD3免疫分离物中PS的含量高约1.5倍，而PI的含量低约3倍。两种免疫分离物中PE的丰度相似(和); 然而，αCD3免疫分离物显示，在锡-1个位置(,补充图S4A).
(A类)通过对αCD3和αTfR免疫分离物的脂质提取物和Jurkat细胞的定量多重PIS分析，检测到分子PE、PS、PG、PI、PA和DAG物种的相对丰度。(B)免疫分离物和Jurkat细胞中二酰基和浆烯基PE物种的概况。二酰基和浆烯基PE物种的比例计算为各自脂质亚类PE物种的摩尔百分比之和(n个=3个独立实验，平均估计值±标准差）。
Jurkat细胞、αCD3和αTfR免疫分离物的PS、PE和PI种的脂肪酸组成与PC种相比有显著差异。然而，相当大一部分PC物种仅包含饱和脂肪酸部分（例如，PC 32:0；)，我们只检测到具有至少一个双键的PE、PS和PI物种(). 此外，与α-TfR免疫分离物和Jurkat细胞相比，在αCD3免疫分离物中没有观察到具有更多饱和脂肪酸部分的PE、PS和PI物种的富集。然而，我们注意到，αCD3免疫分离物中PS的富集主要归因于单不饱和物种PS 18:0–18:1。
在小于1 mol%的浓度下检测到一些脂质(). 在这些脂质中，PA和DAG是由细胞质信号反应生成的，这些反应已被证明发生在T细胞激活位点((施皮塔勒等, 2006；莫尔等, 2007)). 这些低丰度脂质的相对丰度在免疫分离物之间没有显示出重大差异，在详细解释中忽略了观察到的微小波动。
掺入多不饱和脂肪酸后TCR激活域的膜凝结损伤
以前的研究表明，多不饱和脂肪酸在饮食中可以减弱T细胞反应并促进免疫抑制作用(斯图尔尼格等, 1998；谢赫和爱迪丁，2006年). 因此，为了进一步了解TCR激活域不同分子脂质组成的功能重要性，我们通过结合多不饱和二十碳五烯酸（C20:5）来调节Jurkat细胞脂质体。使用劳丹双光子荧光显微镜(高斯等, 2005,2006)，我们发现C20:5处理削弱了TCR激活位点的膜凝结(). 与未经处理的对照细胞相比，经C20:5处理的Jurkat细胞的TCR激活位点显示Laurdan荧光发射发生了变化，产生了较低的广义极化（GP）值()αTfR抗体包被的珠粒在掺入C20:5后的膜缩合中没有显示出显著差异(). 掺入C20:5后TCR活化部位的膜凝结损伤与之前的研究结果一致(斯图尔尼格等, 1998).
用多不饱和二十碳五烯酸处理Jurkat细胞后，TCR激活域质膜的结构和分子脂质组成。在TCR激活位点抑制质膜凝结。Laurdan-labelled Jurkat细胞(A类)使用和(B)在没有20:5多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸（C20:5）处理的情况下，将αCD3包被的聚苯乙烯珠在37°C下偶联10分钟。细胞粘附并固定，同时在两个通道（400–460 nm和470–530 nm）中对Laurdan强度进行成像。强度图像转换为GP图像，如材料和方法中所述。对于A-B，GP图像为假彩色（GP−0.5
1） 左侧面板显示相应的驾驶员信息中心（DIC）图像。棒材=5μm。绘制了珠子-细胞接触区的GP值，用于Jurkat细胞与(C)αCD3-和(D类)αTfR涂层聚苯乙烯珠，10分钟和37°C。平均值用水平线表示。对于αCD3珠–Jurkat接触区，经C20:5处理的GP值显著降低（⧫，n个=92）比对照共轭物（，n个=98) (P（P）<0.001). C20:5处理的α-TfR珠-Jurkat接触区没有检测到显著差异（⧫，n个=69）和控制（，n个=52）共轭(P（P）>0.05). C中的星号表示存在显著差异(P（P）<0.05）的平均GP值。脂质体的系统性变化：(E类)比较用20:5多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸（C20:5）处理的Jurkat细胞10分钟、37°CαCD3和αTfR免疫分离物的PC物种的双键（db）组成以及未处理对照组的总脂质。注意，在所有膜组分中，经C20:5处理后，PC的脂肪酸饱和度曲线发生了显著变化；多不饱和（db⩾5）PC物种的富集和所有不饱和PC物种的膜组分的相对损耗。面板(F类)描述了由C20:5处理和对照Jurkat细胞制备的膜组分的脂质类组成。脂质类别的mol%计算为各脂质类别中所有检测到的脂质种类的mol百分比之和(n个=3个独立实验，平均估计值±标准差）。对于低丰度脂类（<1 mol%，插图）之间的差异，没有得出任何结论。
加入C20:5后Jurkat细胞脂质体的变化
接下来，我们确定了C20:5的掺入如何调节Jurkat细胞、αCD3和αTfR免疫分离物的分子脂质组成。首先，经C20:5处理的Jurkat细胞的脂质体显示出甘油磷脂种类的含量增加，包括具有多不饱和（db⩾5）脂肪酸部分的PC种类(,补充图S5). 我们观察到，多不饱和PC物种丰度的增加被具有一个、两个或三个双键的PC物种的减少所抵消，而不是被完全饱和PC物种所抵消。此外，我们注意到C20:5处理的Jurkat细胞合成了更多SM，特别是完全饱和的物种SM 34:0；与SM 34:1相比，2与胆固醇的相互作用更有利；2个(库伊卡等2001年). 我们还观察到，Jurkat细胞介导C20:5到C22:5的显著伸长，随后并入PS、PI和PE物种。因此，Jurkat细胞调节其脂质体以响应多不饱和脂肪酸的掺入。
用C20:5处理和不处理Jurkat细胞的αCD3和αTfR免疫分离物的比较脂质组学分析表明，在TCR激活位点分离胆固醇、SM和饱和PC物种的保守倾向(,补充图S5). 我们观察到，来自经C20:5处理的Jurkat细胞的αCD3免疫分离物的脂质类组成与来自未经处理的细胞的αCD3免疫隔离物相似，尽管SM丰度高1.9倍，但PS减少1.5倍抵消了SM丰度。对来自经C20:5处理的Jurkat细胞的αCD3免疫分离物的分子脂质组成的详细分析表明，完全饱和的PC物种持续富集，并且多不饱和PC物种的显著增加被具有一个和两个双键的PC物种的减少所抵消。此外，我们还发现来自C20:5处理的Jurkat细胞的αCD3免疫分离物中的PS和PE物种主要包含多不饱和（db⩾5）脂肪酸部分。因此，我们得出的结论是，多不饱和脂质种类的总体增加和脂质类组成的扰动产生了一个次优的质膜环境，似乎削弱了支持膜凝结的能力，而这反过来又阻碍了TCR的激活。
讨论
在本研究中，我们对T细胞质膜中TCR激活域的分子脂质组成进行了全面分析。该分析首次为TCR激活期间不同脂质物种向膜结构域的横向分离提供了直接证据。
TCR信号结构域Lo膜相脂质的积累
富含TCR信号结构域的αCD3免疫分离质膜片段的一个关键特征是胆固醇、SM和饱和PC物种的积累。这些脂类支持模型膜中浓缩Lo膜相的形成，细胞膜中的筏结构域被提议采用类似于Lo相的性质(布朗和伦敦，1998年；韦奇和凯勒，2003年；穆克吉和麦克斯菲尔德，2004年；Simons和Vaz，2004年). 生物物理数据表明，TCR激活的质膜域中脂筏的积累得到了这些位置质膜凝结的支持() (高斯等, 2005). 这些现象是否反映了动态纳米尺度静止状态筏的聚合或从头开始用这里使用的方法无法确定TCR信号位点筏域的形成。
αCD3免疫分离的质膜结构域包含大量不参与TCR信号传递的质膜蛋白(). 因此，αCD3免疫分离物的特征性脂质成分可能低估了筏形分子脂质物种的富集就地位于质膜中的TCR信号结构域。
斯图尔尼格等(1998)据报道，用C20:5脂肪酸处理Jurkat细胞会抑制TCR活化，并提出多不饱和脂肪物种会破坏TCR活化位点处筏结构域的凝聚。我们的脂质测定和劳丹数据支持这一模型。在一种相关的方法中，将氧甾醇7-酮胆固醇（7KC）并入T细胞被证明会损害TCR活化位点的凝聚。事实上，已知7KC会干扰模型膜中液相畴的形成(Massey和Pownall，2005年). 对于多不饱和C20:5处理，7KC掺入导致抑制T细胞活化(伦特罗等, 2008). 这些结果表明TCR激活和TCR激活位点的质膜脂质有序性之间存在功能联系。TCR信号位点的膜筏结合可以通过调节相互作用信号蛋白的速率和特异性，和/或通过排除不需要的相互作用物来控制信号转导。然而，这仍然是未来实验的模型。还应考虑另一种解释，即膜的厚度由占据不同膜域的跨膜蛋白定义(蒙罗，2003).
用C20:5多不饱和脂肪酸直接加载Jurkat细胞改变了所有主要甘油磷脂物种的脂肪酰基特征(补充图S5)并破坏TCR活化位点的质膜凝结(). 这与饮食中T细胞质膜的生化和生物物理变化形成对比n个-3 PUFA-暴露小鼠(风扇等, 2003；基姆等, 2008). PUFA-fed小鼠的T细胞表现出PS和PE的酰基链饱和改变，而PC和PI酰基链的饱和曲线没有改变。与急性多不饱和脂肪酸负荷后减少的膜凝结作用相比，模拟饮食中多不饱和脂酸暴露的实验方案在T细胞活化位点保持了特定的凝结作用(基姆等, 2008). T细胞筏上PUFA负载的这些不同结果可能反映了在呈现富含PUFA的饮食后保持T细胞膜功能的代偿机制。
TCR信号质膜结构域的脂质双层
抗体交叉连接的外叶GPI锚定蛋白片断限制内叶脂肪酸锚定筏蛋白的运动/分布(更努力等, 1998；铃木等2007年b). 这些观察结果表明，细胞质和细胞质小叶中的脂质组织与质膜上聚集的筏结构域之间存在相互关系。这种联系的性质是膜生物学中一个重要的开放性问题。
富含内质膜小叶的Jurkat细胞PE、PS和PI物种分析(扎乔夫斯基，1993年；范·米尔等, 2008)表明αCD3免疫分离物中的这些脂质物种()主要是不饱和的。然而，与αTfR免疫分离的质膜片段相比，αCD3免疫分离的质膜片段的独特分子组成也反映在这些甘油磷脂中。我们观察到与总PE相比，血浆烯基PE物种（具有乙烯基-乙二醇连接的碳氢化合物部分）的富集，以及所有PS物种的富集。我们还检测到αCD3免疫分离物中PI减少了3倍。目前，αCD3分离物中PI缺失和血浆烯基PE物种富集的原因尚不清楚。以前在用无洗涤剂方法从粗质膜组分中分离出的筏组分中观察到了Plasmenyl PE积累和PI缺失(派克等, 2002).
αCD3免疫分离物中PS的分子丰度显著高于αTfR免疫分离物。有趣的是，C20:5处理导致αCD3免疫分离物中PS部分的减少。一些研究报告了富含PS-的膜与TCR–CD3复合物和TCR信号机制的特定相互作用。TCRζ链亚单位在与富含PS的膜结合时改变其构象，可能代表T细胞激活级联中的调节事件(Aivazian和Stern，2000年). 最近研究表明，与阴离子磷脂的类似基于电荷的相互作用可以确定细胞质片段CD3ɛ与T细胞质膜内叶的紧密接触和构象(徐等, 2008). 人工脂膜上LAT核信号复合物的磷酪氨酸依赖性重建在体外容易出现在由PS组成的膜上，但不出现在磷酸化LAT上，磷酸化LAt被固定在由PC或PE组成的脂质体中(桑加尼等, 2009). 此外，蛋白激酶C亚型PKCθ的特异性募集及其在富含PS的膜表面的活化被显示出来(梅洛维奇等, 2007). PKCθ被募集到免疫突触中，在T细胞激活过程中发挥重要作用(奥特曼和维拉尔巴，2003年). 这些报告表明，在TCR信号结构域的PS积累最有可能代表T细胞激活级联中的一个关键元素。
本文观察到的TCR激活域中不同脂质物种的特异性积累表明，可以直接分析其他信号结构域的脂质体。艾滋病毒脂质体的αCD3分离物的分子脂质组成具有类似的特征。相对于MT-4宿主细胞脂质体，HIV颗粒表现出SM、饱和PC、纤溶酶基PE和PS物种浓度增加(布鲁格等, 2006). 然而，这项研究将HIV脂质体与MT-4宿主细胞的脂质体进行了比较。因此，这种方法未能解决病毒与宿主细胞质膜的区别。最近的一项研究陈等(2008)证实了Lo相形成脂质在HIV膜中的富集，但还允许将HIV脂质体与从宿主细胞分离的质膜脂质体联系起来。脂质分析表明，与HIV包膜来源的膜相比，病毒中的胆固醇、神经酰胺和神经节苷脂GM3更高。这些研究代表了脂质研究新阶段的开始。直到最近，还不可能从微量样品中对单个分子脂质物种进行脂质全定量。有了新的质谱方法，我们可以开始确定生物膜及其亚结构域中脂质复杂性的功能含义。
材料和方法
细胞培养
Jurkat细胞保存在含有10%FCS（BioSera）、青霉素（100μg/ml）、链霉素（100 U/ml）和2 mM谷氨酰胺（均为Gibco/BRL）的RPMI培养基中。前面描述了在50μM无血清培养基中加入C20:5多不饱和脂肪酸(斯图尔尼格等, 1998).
抗体和试剂
所有常用化学品均购自西格玛化学品公司（密苏里州圣路易斯），具有最佳分析等级。溶剂：水、甲醇（均为LiChrosolv®等级）和氯仿（LC等级）来自默克公司（德国达姆施塔特）。合成脂质标准品购自Avanti Polar Lipids，Inc.（Alabaster，AL）。PI 17:0/17:0由Christoph Thiele（马克斯·普朗克分子细胞生物学和遗传学研究所）提供。
从组织培养上清液中纯化抗CD3（OKT-3）和TfR（B3/25）的小鼠单克隆抗体。我们还使用了来自eBioscience的OKT-3 Ab和OKT-9克隆来对抗CD71（TfR）。免疫印迹抗体和试剂从以下来源购买：LAT兔多克隆抗体来自Upstate Biotechnology；从Sigma中获得Calnexin多克隆兔抗体；MTCO1线粒体标记抗体[1D6]来自Abcam；从Zymed中获得TfR小鼠单克隆抗体。结合的α-小鼠IgG和α-兔IgG二级抗体以及结合的链霉亲和素是从Bio-Rad或LICOR Bioscience获得的。M450山羊α-小鼠Dynabeads是从Invitrogen（伦敦）获得的。
蛋白质印迹
预铸4–12%NuPAGE SDS凝胶购自Invitrogen，电泳后使用Bio-Rad Trans-blot仪器通过半干印迹将蛋白质转移至HybondC+膜（Amersham Bioscience）。免疫反应带可通过ECL化学发光（Amersham Bioscience）或使用LICOR Odyse检测系统进行红外荧光检测来显示。
免疫隔离
对T细胞信号结构域进行免疫分离，与之前报道的方案相比有微小改变(Harder和Kuhn，2001年). 用OKT-3（αCD3）和B3/25（αTfR）单克隆抗体包被山羊α小鼠动力珠（M450）。免疫分离物通过5×10培养制备72.5×10的Jurkat电池7在37°C下进行规定时间的动态珠粒，随后在50巴下进行10分钟的氮气空化(Harder和Kuhn，2001年). 免疫分离物在PBS中洗涤三次，然后再悬浮在110μl Millipore水中。取出10μl样品进行western blot分析，并立即将剩余样品冷冻在−80°C。
质谱脂质分析
Jurkat细胞和免疫分离物的总脂质提取是通过改良的Bligh和Dyer方法进行的(布莱和戴尔，1959年). 整个油脂提取过程在4°C下15分钟内完成，因为聚苯乙烯珠不耐氯仿。解冻样品（在100μl水中）并添加10μl内标混合物，提供总峰值量为15 pmol DAG 17:0–17:0、36 pmol PA 17:0-17:0，78 pmol PE 17:0-17:0、11 pmol PG 17:0-7:0、64 pmol PS 17:0-13:0、67 pmol PC 18:3–18:3、82 pmol PI 17:0-18:0、45 pmol SM 18:1；2/17:0;0.15 pmol Cer 18:1；2/17:0;0，30 pmol GalCer 18:1；2/12:0;0，30 pmol LacCer 18:1；2/12:0;0，61 pmol胆固醇-d7。随后，添加495μl氯仿/甲醇（2.5:1，v/v），并在Eppendorf热混合器（德国汉堡Eppendortf）上于1400 r.p.m.将样品剧烈摇晃15分钟。样品在500℃下离心2分钟克促进相分离。分离低有机相（总脂提取物），并在4°C的真空干燥器中蒸发。将总脂质提取物溶解在50μl氯仿/甲醇（1:2，v/v）中，并在混合QSTAR Pulsar上进行定量脂质分析我四极飞行时间质谱仪（MDS Sciex，Concord，Ontario，Canada），配备机器人纳米流离子源NanoMate HD系统，使用4.1μm喷嘴直径的ESI芯片（Advion Biosciences Inc.，Ithaca，NJ）。DAG、PA、PE、PS、PG和PI物种通过负离子模式多重PIS分析定量(弹出等, 2006)：将15μl总脂提取物装入聚丙烯96-well板（德国汉堡Eppendorf）中，在15μl 0.01%（v/v）甲胺（甲醇）的顶部，96-weall板上覆盖铝箔，样品以负离子模式注入，电离参数为0.5 psi和0.9 kV。用正离子模式PIS定量PC和SM米/z184.1分析(埃克鲁斯等, 2002,2003)：在溶于2-丙醇的19.3μl 13.3 mM醋酸铵上加载15μl总脂提取物，以正离子模式注入样品，电离参数为1.25 psi和0.95 kV。PIS后分析中性鞘脂米/z184.1使用额外的多反应监测期和目标清单进行分析：米/z538.5（证书18:1；2/16:0；0），米/z552.5（内部标准Cer 18:1；2/17:0；0），米/z648.6（证书18:1；2/24:1；0），米/z650.6（证书18:1；2/24:0；0），米/z644.5（内部标准GalCer=HexCer 18:1；2/12:0；0），米/z700.6（HexCer 18:1；2/16:0；0），米/z810.7（HexCer 18:1；2/24:1；0），米/z812.7（HexCer 18:1；2/24:0；0），米/z806.6（内部标准LacCer=Hex2Cer 18:1；2/12:0；0），米/z862.6（Hex2Cer 18:1；2/16:0；0），972.7（Hex2Cer 18:1，2/24:1；0。如前所述，使用多重反应监测在化学乙酰化后定量胆固醇(利比施等, 2006). 如前所述，通过脂质档案器软件（MDS Sciex）对采集的光谱进行自动处理，对检测到的分子脂质进行鉴定和定量(弹出等, 2006).
脂质种类注释
根据分析模式，通过其分子组成或其总和公式对脂质种类进行注释。对于总和公式注释，应用了以下约定：脂肪类脂肪酸部分碳原子总数：脂肪酸部分双键总数（例如，PC 36:2）。多重PIS检测到的甘油磷脂物种的分子组成注释为：脂肪类第一FA部分的碳原子数：第一FA组的双键数-第二FA组中的碳原子数量（例如，PE 18:0–18:2）。以太物种用前缀注释O（运行）-（例如，PCO（运行）-34:2或PEO（运行）-16:1p–18:1）。
中性鞘磷脂通过分子组成进行注释：长链碱基部分的脂级碳原子数：长链碱部分的双键数长链碱基部分中的羟基数目〉/脂肪酸部分中的碳原子数目〈：脂肪酸部分的双键数目脂肪酸部分的羟基数量〉。例如，前体离子米/z538.5被鉴定为Cer 18:1；2/16:0;0，即含有C18鞘氨醇（具有两个羟基）和没有双键或羟基的C16酰胺连接的脂肪酸部分的Cer物种。检测到的SM物种用总和公式注释为PIS米/z184.1分析没有提供关于长链碱和酰胺连接脂肪酸部分的分子组成的结构信息。检测到的SM物种用总和公式注释：SM神经酰胺骨架中的碳原子数：神经酰胺骨架的双键数神经酰胺主链中的羟基数目〉。例如，前体离子米/z703.6被鉴定为SM 34:1；也就是说，SM物种在其神经酰胺骨架中总共包含34个碳原子、一个双键和两个羟基。
显微镜
Jurkat细胞用Laurdan标记(高斯等, 2005)将染料（最终浓度为5μM）添加到C20:5浓缩的无血清培养基中，并在37°C下培养细胞30分钟。细胞与微球结合，并使用聚苯乙烯微球（SpheroTech）进行免疫隔离。细胞-珠结合物可以沉淀在聚乙烯上-L（左）-赖氨酸涂层玻璃盖片并固定在4%多聚甲醛中。使用Verdi/Mira 900多光子激光系统在800 nm处激发Laurdan荧光。两个通道分别在400–460 nm和470–530 nm范围内同时记录Laurdan强度图像（徕卡IRE3显微镜和软件）。对于每个实验，用5μM二甲基亚砜中的Laurdan校准两个通道的相对灵敏度。所有图像均采用×100油物镜记录，N个A类室温下=1.4。
图像分析
通过计算两个强度通道的归一化比率，将Laurdan强度图像转换为GP图像，定义为
GP图像在Adobe Photoshop中是伪彩色的。为了确定接触部位的GP值，确定了与珠子相邻的感兴趣区域的平均GP面积。散点图中的每个数据点（或符号）代表一个接触点。在每次实验中，使用在DMSO中获得的Laurdan的G因子校正GP值(高斯等, 2003). 使用单向方差分析和Tukey多重比较检验进行统计比较。
