适配器Aly和联合适配器Thoc5在Tap-p15介导的核输出中的作用热休克蛋白70信使核糖核酸

摘要

介绍

真核细胞组织在不同的亚细胞室中，每个亚细胞室都被特定的细胞器膜包围。核膜将细胞核与细胞质分开，但核孔复合体（NPC）穿透核膜，使核质在这两个隔室之间进行转运。大量货物（蛋白质、RNA、RNP）通过与特定的核质转运受体结合而通过NPC转运，这些受体解码各种运输货物中的靶向信号（NLS或NES）。其中许多受体属于转运因子的importin-β/核蛋白家族，需要小GTPase Ran来实现核质转运的方向性（有关最近的综述，请参阅Kohler和Hurt，2007年；Terry和Wente，2007年).

mRNA的核输出是独特的，因为穿梭输出受体不是importin-β家族的成员，也不直接依赖于RanGTP。然而，mRNA输出受体在进化上是保守的，在芽殖酵母中称为Mex67-Mtr2酿酒酵母后生动物中的Tap-p15（或NXF1-NXT1）(塞格雷夫等, 1997；格吕泰等, 1998；桑托斯-罗萨等, 1998；Kang和Cullen，1999年；卡塔希拉等, 1999；赫罗德等, 2000). 尽管转运蛋白自身表现出RNA-结合活性在体外(桑托斯-罗萨等, 1998；卡塔希拉等, 1999；Liker公司等, 2000)它们主要通过与适配器RNA-结合蛋白的相互作用来选择其mRNA载体。Tap呈现模块化结构域组织，其中包括氨基末端（N-）和富含亮氨酸重复（LRR-）结构域以及中间（M-）和羧基末端（C-）结构区的区域分别被指定为适配器RNA-结合蛋白和FG-nucleoporins的结合位点（参见图1A) (卡塔希拉等, 1999；巴希等, 2000；斯特拉瑟等, 2000；斯图茨等, 2000；弗里堡等2001年；黄等, 2003).

在单独的窗口中打开

图1

Thoc5是Tap的一种新型交互对应物。(A类)Tap-p15异二聚体的结构域组织和已知的相互作用对应物。每个矩形上的数字表示人类Tap的氨基酸位置（有关详细信息，请参阅塞格雷夫等, 1997；Liker公司等, 2000；罗德里格斯岛等2001年；里德和赫特，2002年). (B)粗裂解物大肠杆菌将带有（以+表示）或不带有（以−表示）Thoc5–FLAG表达添加到预先吸附到GST或融合到Tap不同片段的GST的GSH珠中。结合蛋白通过SDS-PAGE进行分析，然后进行CBB染色（上面板）和使用抗FLAG抗体的western blot（下面板）。在13号和14号车道上，装载了10%的输入。箭头指示Thoc5–FLAG的位置。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。注意，在这种特殊的凝胶中，p15迁移到染料前沿。(C)将纯化的Thoc5–FLAG添加到预先吸附到GST（泳道1）或GST融合到Tap的各种片段（泳道2-6）的GSH珠中。用SDS-PAGE分离25%结合组分的等分样品，并用CBB染色（上面板）和使用抗FLAG抗体的western blot（下面板）检测蛋白带。在通道7中，总共加载了10%的输入。箭头表示p15和Thoc5–FLAG的位置，而星号表示每个GST融合蛋白的位置。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。(D类)表面表征显示Tap（蓝色）与p15（品红色）和含FG肽（橙色）络合的Ntf2样结构域(弗里堡等2001年). 从最上面的图中箭头指示的方向也可以看到不同的表面。对Thoc5结合至关重要的Tap区域用黄色表示。箭头表示Tap的短回路（aa 505–507）。丙氨酸扫描突变的位置在图的底部以单字母代码表示。序列顶部的数字表示Tap的氨基酸位置。黄色阴影的残留物对应于3D模型中黄色区域。(E类)与（C）中相同，但使用了含有与p15复合的丙氨酸扫描突变的Tap（188–619）。箭头显示凝胶上p15和Thoc5–FLAG的位置。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。(F类)Thoc5全长和不同结构域（aa 1–251和251–683）在大肠杆菌作为他的₆-和FLAG双标记蛋白质。纯化的蛋白质（输入的5%，通道7-9）被GST（通道1-3）或GST-Tap（188-619）-p15（通道4-6）拉下。结合组分（25%）中的蛋白质通过SDS–PAGE进行分析，然后进行CBB染色（上部）和使用抗FLAG抗体的western blot（下部）。Thoc5–FLAG及其衍生物的位置用星号表示，而Tap（188–619）、GST和p15的位置用箭头表示。分子量标记的位置以kDa为单位显示在左侧。

进化上保守的TREX复合物是mRNA的偶联转录延伸和核输出所必需的，并提供了一个mRNA特异性适配器的例子(里德和赫特，2002年；阿奎莱拉，2005年；Reed和Cheng，2005年；科勒和赫特，2007年). 酵母复合物由THO转录延伸复合物（Hpr1、Tho2、Mft1和Thp2）、Tex1、Sub2和Yra1组成(斯特拉瑟等, 2002). 复合物以共转录方式加载到mRNAs上，便于将新生转录物组装成具有出口能力的mRNP。Yra1通过与DEAD-box型RNA解旋酶Sub2的相互作用被招募到mRNA上，它与Mex67-Mtr2发生物理相互作用，并起到适配器的作用(Strasser and Hurt，2000年,2001；阿布鲁齐等, 2004). 因此，酵母TREX突变体显示了散装聚（a）的核出口缺陷⁺与mRNA输出机制的许多突变相比，RNA和具有综合致死性(Strasser公司等, 2002).

后生动物中存在一种等效的复合体(里德和赫特，2002年；Reed和Cheng，2005年；科勒和赫特，2007年). 人类TREX复合体由hTHO亚复合体（hHpr1、Thoc2、Thoc5、Thoc6和Thoc7）、TEX1、UAP56和Aly组成。果蝇中也发现了一种相关的复合物黑腹果蝇(斯特拉瑟等, 2002；雷温克尔等, 2004；Masuda公司等, 2005；Reed和Cheng，2005年). Aly，类似于其酵母同源物Yra1(Strasser and Hurt，2000年)通过与UAP56（Sub2同源基因）的相互作用招募到mRNA，并直接与Tap-p15相互作用。在爪蟾卵母细胞，Aly被证明是mRNA核输出的限制因素(斯图茨等, 2000；周等, 2000；罗等2001年；罗德里格斯岛等2001年). 尽管存在这些结构和功能保守性，但对培养果蝇细胞进行的基因敲除实验表明，只有UAP56同源基因，而没有其他THO/TREX成分（包括果蝇属Aly），对于大块聚（A）是必不可少的⁺RNA输出(加特菲尔德等2001年；赫罗德等2001年；加特菲尔德和伊扎尔拉尔德，2002年；法尔尼等, 2008). 研究还表明，只有一部分mRNA的核输出受到TREX组分耗竭的影响(雷温克尔等, 2004；法尔尼等, 2008). 这些数据表明，高等真核生物中存在不同的核mRNA输出途径，这些途径可能由不同的适配器RNA-结合蛋白决定。

在本研究中，我们发现人类TREX组分Thoc5直接与Tap的中间结构域结合，该结构域呈现Ntf2样折叠。我们的数据进一步表明，Thoc5和其他THO成分虽然不需要批量mRNA输出，但对特定mRNA的核输出至关重要(热休克蛋白70)与适配器蛋白Aly结合。体外，Thoc5具有RNA-结合活性，可以在细胞核和细胞质之间穿梭。生化研究表明，Thoc5与Tap的Ntf2样结构域结合，而Aly被招募到Tap的N-和LRR-结构域。总之，这些发现表明Thoc5在热休克蛋白70mRNA作为一种共同适配器与总适配器蛋白Aly紧密重叠。因此，通过将衔接子（Aly）和共衔接子（Thoc5）募集到非重叠的结合位点，Tap-p15可以参与不同类别mRNA的核输出。

结果

需要Thoc5和Aly热休克蛋白70哺乳动物细胞的mRNA输出

为了进一步表征哺乳动物细胞中的Thoc5，提出了一种针对人类Thoc5的多克隆抗体，该抗体在蛋白质印迹上识别Thoc5(补充图S3A和间接免疫荧光法检测HeLa细胞。正如预期的那样，Thoc5集中在含有SC35标记蛋白以及Aly和hHpr1的富含剪接因子的核室中(补充图S3B，上部面板）(周等, 2000；增田等, 2005).

为了确定Thoc5是否可以在细胞核和细胞质之间穿梭，我们使用稳定表达Thoc5–GFP的小鼠L929细胞系进行了特异性异核体分析(图2A，车道2）。以非转运蛋白hnRNP C和人类Tap作为对照，显示小鼠和小鼠之间的转运爪蟾原子核(图2B). 显然，Thoc5–GFP，类似于Tap或Aly(卡塔希拉等, 1999；周等, 2000；罗德里格斯岛等2001年)，可以在异核体分析中穿梭。如所示图2ChHpr1–GFP也穿梭，表明Thoc5可能作为THO–TREX复合物的一部分快速穿梭于细胞核内外。

在单独的窗口中打开

图2

Thoc5在细胞核和细胞质之间穿梭。(A类)使用抗GFP抗体对从稳定表达Thoc5–GFP（第2道）和hHpr1–GFP的亲本L929细胞（第1道）或L929肿瘤细胞系制备的总细胞提取物进行western blot。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。(B,C)异核体形成使用爪蟾A6细胞和L929细胞系在CHX存在下稳定表达Thoc5-GFP（B）或hHpr1-GFP（C）。在有CHX存在的30°C下培养3小时后，用抗Tap（穿梭；上面板）和抗hnRNP C（非穿梭；下面板）抗体对细胞进行固定和免疫染色。细胞核用Hoechst 33342染料染色。箭头表示爪蟾融合细胞中的细胞核，而箭头表示未融合细胞的细胞核。插图显示融合细胞中GFP信号的放大视图。

为了检测Thoc5在mRNA输出中是否具有重要功能，进行了siRNA敲除实验。siRNA转染可有效阻断Thoc5、Aly和Tap的表达(图3A-C). 然而，Thoc5的消耗并不影响poly（A）的核出口⁺RNA，由就地使用Cy-3标记的寡核苷酸探针进行杂交。相反，Tap-p15的耗尽导致poly（a）的强烈核积累⁺RNA。当Aly耗尽时，siRNA转染细胞的约70%（对于siAly-1）和约20%（对于siAlly-2）分别显示出poly（a）的强烈核积累⁺核糖核酸(图3D). 这些数据表明，在培养的哺乳动物细胞中，Tap-p15和Aly，而不是Thoc5，在聚（a）的核输出中起着关键作用⁺RNA。

在单独的窗口中打开

图3

Thoc5的耗尽不会影响大块聚（A）⁺哺乳动物细胞中的RNA输出。(A类)用指示的siRNAs处理HeLa细胞72小时。使用指示的抗体对总细胞提取物进行免疫印迹。作为阴性对照，使用抗DsRed蛋白的siRNA。分子量标记的位置以kDa表示在左边。(B)用指示的siRNAs处理HeLa细胞72小时。使用指示的抗体对总细胞提取物进行免疫印迹。作为阴性对照，使用抗DsRed蛋白的siRNA。分子量标记的位置以kDa表示在左边。(C)用指示的siRNAs处理HeLa细胞45小时。用指示的抗体对从细胞制备的总细胞提取物进行免疫印迹。对于阴性对照，使用针对DsRed蛋白的siRNA。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。(D类)在玻璃底培养皿上生长的HeLa细胞用指定的siRNA处理45小时（siRNA对抗Tap）或72小时（其他）。细胞被固定并接受就地Cy3-标记寡核苷酸杂交₅₀探查。

此前，据报道果蝇属THO–TREX复合物对于热休克mRNA的核出口是必需的，但对于散装聚（A）的核出口则是不可或缺的⁺核糖核酸(雷温克尔等, 2004). 因此，我们测试了出口是否需要Thoc5热休克蛋白70mRNA。热休克蛋白70mRNA在热休克时在细胞中被诱导，并在少数核病灶中被检测到就地杂交，显示为与热休克基因相邻的转录位点(乔利等, 1997,1999). 我们的FITC-标记的寡核苷酸探针允许特异性检测热休克蛋白70热休克后核病灶中的mRNA(补充图S4A和B). 值得注意的是，在Thoc5耗尽后，核信号强度显著增加热休克蛋白70观察到含有mRNA的病灶(图4A，另请参见补充图S5; 分别用siThoc5-1和siThoc5-2处理的94%和87%的细胞显示出较大的核病灶）。当Tap的表达被RNAi抑制时，观察到核病灶的信号强度也有类似的增加。用两种不同的siRNAs耗尽Aly也导致细胞核增大热休克蛋白70几乎所有细胞都含有mRNA病灶(图4A; 分别有89%和94%的细胞经siAly-1和siAly-2处理后，核病灶增大）。这与Aly耗尽对本体聚（A）的影响形成对比⁺RNA输出。未受应力条件下，在siRNA处理的细胞中未观察到核病灶(补充图S4C). 这排除了核病灶由RNAi治疗引起的可能性。此外，我们没有观察到siRNA处理后β-肌动蛋白转录物的核点状积累(补充图S4D和E). 如northern blot分析所示热休克蛋白70在热应激下，每个siRNA转染细胞的mRNA表达相似，而Aly缺失细胞的β-actin mRNA表达严重受损(图4B，中间面板）。这些发现表明，Thoc5和Aly在转录热休克蛋白70mRNA和热休克蛋白70保留在基因位点附近的mRNA不会发生显著降解。核能的强劲增长热休克蛋白70mRNA水平也通过细胞分馏进行观察（另见图4C当Thoc5或Aly的表达受到抑制时，进行RT-PCR(图4D上部），而β-actin mRNA的分布受到的影响较小(图4D较低）就地杂交。总之，这些数据表明，Thoc5和Aly是高效核出口所必需的热休克蛋白70哺乳动物细胞中的mRNA。

在单独的窗口中打开

图4

热休克蛋白70mRNA输出需要Thoc5和Aly。(A类)将抗DsRed（siDsRed:阴性对照）、Aly（siAly-1和-2）、Thoc5（siThoc5-1和-2）或Tap（siTap-1和-2。在转染后48小时（对于siTap-1和-2）或72小时（对于其他siRNAs），细胞受到43°C的热休克1小时，并且就地用FITC-标记的人进行杂交热休克蛋白70进行寡核苷酸探针检测。(B)用指示的siRNAs处理72小时的HeLa细胞未经处理（用−表示）或温度在43°C下变化1小时（用+表示）。从细胞中制备的总RNA（每车道5μg）通过northern blot分析[³²P] -已标记热休克蛋白70β-肌动蛋白cDNA探针。溴化乙锭染色检测28S rRNA作为负荷对照。(C)HeLa细胞被分为核（左）和细胞质（右）部分。对每个组分进行SDS-PAGE，然后使用抗RCC1和抗hHpr1（核标记）或抗G3BP和抗α-微管蛋白（细胞质标记）抗体进行western blot。(D类)用指示的siRNAs处理HeLa细胞72小时，在43°C温度下移动1小时。从核（N）和细胞质（C）部分分离出总RNA，如（C）所示。热休克蛋白70用特异性引物RT-PCR检测各组分中的β-肌动蛋白mRNA。面板底部显示了相对核信号（N/C）。

Thoc5和Aly与Tap-p15异二聚体同时结合

数据表明，核出口需要Tap-p15、Thoc5和Aly热休克蛋白70哺乳动物细胞中的mRNA。虽然Thoc5和Aly结合到Tap-p15内的不同域，但它们可能同时结合到mRNA输出受体。为了了解这些不同的因子是否可以组装成复合物，用越来越多的Tap-p15对Thoc5进行预培养，并将其添加到固定在GSH珠上的GST-Aly中。当等摩尔量的Tap-p15和Thoc5添加到GST–Aly时，Thoc5、Aly和Tap-p5之间形成化学计量络合物(图5A，泳道3和4）。在没有Tap-p15的情况下，观察到Thoc5与GST-Aly的结合较弱，但与GST-hHpr1或GST的结合较弱(图5A，车道2；图5B，车道3、5、7）。当化学计量量的Thoc5与缺失Tap N结构域部分（Tap188–619）的突变Tap-p15预孵育，然后添加到GST–Aly中时，Thoc5和Tap–p15均未与固定化GST–Ally结合(图5A，车道5）。在存在Tap突变体的情况下，Thoc5与GST-Aly的结合减少，可能是因为“自由”与Tap-p15-结合的Thoc5之间存在与GST-Ally结合的竞争。因此，Aly和Thoc5很可能在异四聚体复合物中没有直接接触。这些数据表明形成了异四聚体复合物，其中Thoc5与M结构域结合，Aly与Tap的N和LRR结构域结合。综上所述，这些生化数据表明Thoc5和Aly可以同时与Tap-p15出口受体结合。

在单独的窗口中打开

图5

Tap-p15、Thoc5和Aly构成异四聚体。(A类)纯化的Thoc5–FLAG（25μg）以及越来越多的全长Tap-p15（2–4道；0、8、16μg）与预先吸附到纯化的GST-Aly（10μg）中的GSH-珠培养。在通道5中，使用Tap（188–619）-p15（20μg）代替全长Tap-p15。清洗珠子，用SDS–PAGE分析结合组分（25%）的等分，然后用CBB染色。在通道1中，仅在结合反应中添加缓冲液进行比较。在6-8通道中，纯化的Thoc5-FLAG（1.5μg）、Tap-p15（2μg）和Tap（188-619）-p15（2.5μg）用作标记物。结合组分（10%）也使用所示抗体进行western blot。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。(B)纯化的Thoc5–FLAG（3、5、7道）或单独的缓冲液（2、4、6道）与预先吸附到GST（2道和3道）、GST–Aly（4道和5道）和GST–hHpr1（6道和7道）的GSH-珠培养。清洗珠子，用SDS–PAGE分析结合组分（25%）的等分，然后用CBB染色和使用抗FLAG抗体的western blot进行分析。在车道1中，加载了10%的输入。

Thoc5是一种新的适配器RNA结合蛋白，与热休克蛋白70最小RNP体内作为THO复合体的组成部分

为了了解Thoc5在被征募到Tap-p15 mRNA输出受体后是否可以作为一个适配器RNA-结合蛋白发挥作用，我们进行了RNA带移位分析。该分析表明，与Aly相似的Thoc5在分析中引起了强大的RNA转移，表明Thoc5表现出在体外RNA-结合活性(图6A，泳道5-8）。利用核糖高分子的竞争实验表明，Thoc5对不同RNA的相对亲和力。结果表明，Thoc5对不同的RNA序列（即poly（rG）、poly（U）、polyrA（rC））具有一定的偏好性。此外，Thoc5与RNA探针的结合被双链DNA抑制，尽管效率较低(图6B).

在单独的窗口中打开

图6

Thoc5和Aly是热休克蛋白70最小RNP。(A类)RNA结合分析使用91 bp[³²P] -标记RNA编码pBluescript SK多连接子序列。将纯化的重组GST（通道2-4:160、320、480 pmol）、Thoc5-FLAG（通道5-8:2、4、12、20 pmol）和GST-Aly（通道9-12:0.3、0.6、2、3 pmol）蛋白添加到每个结合反应的总10μl中。仅探测器在1号通道运行。结合反应用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并用放射自显影术观察。括号表示蛋白质–RNA复合物的位置。(B)Thoc5的RNA-结合活性的竞争分析是使用越来越多（10、25、100、300 ng）的核糖-血红蛋白聚合物（3–18道）和dsDNA（19–22道）作为竞争物进行的。(C)热休克HeLa细胞进行RNA免疫共沉淀分析。然后使用指定的引物对共沉淀RNA进行PCR。从粗细胞提取物中分离出的RNA也进行了RT-PCR（1、2、10和11道；输入）。在RT指示的通道中，第一链合成反应中省略了逆转录酶。扩增的cDNA片段通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，并通过溴化乙锭染色进行可视化。DNA大小标记在9号通道上（用M表示），500 bp标记的位置显示在左侧。(D类)使用如（C）所示的抗体对热休克HeLa细胞进行RNA免疫共沉淀分析。(E类)用抗Thoc5抗体对热休克HeLa细胞进行RNA共免疫沉淀分析。使用所示抗体重新免疫沉淀从抗Thoc5珠释放的mRNP。共沉淀RNA的分析如（C）所示。

测试Thoc5与mRNA相关的可能性体内，我们分析了热休克蛋白70抗Thoc5抗体可协同免疫沉淀mRNA。要生成热休克蛋白70mRNA，对HeLa细胞培养物进行热休克，然后与甲醛交联，以稳定蛋白质和蛋白质与RNA的相互作用。然后用全细胞裂解物中的特异性抗体免疫沉淀Thoc5。阳性对照组和阴性对照组分别使用抗Aly抗体和一种无关抗原（小鼠IgG）。然后提取共同免疫沉淀RNA，并使用人类进行RT-PCR热休克蛋白70-特定底漆组。热休克蛋白70mRNA用抗Thoc5或抗Aly抗体特异性免疫沉淀，但不用对照抗体(图6C，泳道3、5、7、12、14、16）。这些数据表明，与Aly相似的Thoc5与热休克蛋白70信使核糖核酸。

为了进一步探索热休克蛋白70mRNP、抗不同因子抗体用于免疫沉淀。在热休克条件下，THO复合物保持稳定，不同的抗THO抗体可以有效地协同免疫沉淀这些成分(补充图S3C; 另请参见图S3A和B抗体的特异性）。热休克蛋白70mRNA也被这些抗体共同免疫沉淀(图6D第5、7、9车道）以及抗Tap抗体(图6D，车道15）。引人注目的是，含有Thoc5热休克蛋白70mRNP可被抗Tap、抗Thoc2和抗Thoc7抗体重新免疫沉淀(图6E，车道5、7、9）。这些数据强烈表明热休克蛋白70mRNA与新型适配器Thoc5和出口商Tap-p15形成复合物体内Thoc5在热休克蛋白70mRNP是稳定THO复合体的一部分。与后一结论完全一致的是，siRNA对THO复合体的另一种后生动物特异性成分Thoc6的缺失也诱导了少量但仍然显著的核聚积热休克蛋白70信使核糖核酸(图7C; 另请参见补充图S6)不影响其他THO成分的表达，包括Thoc5(图7A)和大块聚（A）的细胞定位⁺核糖核酸(图7B). 综上所述，这些数据支持一个模型，即Thoc5具有适配器功能，是稳定THO复合体的组成部分。

在单独的窗口中打开

图7

Thoc6的耗尽也阻碍了热休克蛋白70mRNA。(A类)用指示的siRNAs处理HeLa细胞72小时。用指示的抗体对从细胞制备的总细胞提取物进行免疫印迹。作为阴性对照，使用抗DsRed蛋白的siRNA。分子量标记的位置在左侧以kDa表示。(B)用指示的siRNA处理在玻璃底培养皿上生长的HeLa细胞72小时。将细胞固定并进行就地Cy3-标记寡核苷酸杂交₅₀探查。(C)将生长在玻璃底培养皿上的HeLa细胞用指示的抗Thoc6的siRNAs处理72小时。将细胞固定，并用就地使用FITC标记的杂交热休克蛋白70寡核苷酸探针。显示用siThoc5-1处理的细胞（右上角），以比较核病灶的大小。

讨论

遗传和生化研究已将TREX复合体的亚单位与酵母和后生动物中的mRNA输出机制联系起来(斯图茨等, 2000；周等, 2000；罗等2001年；罗德里格斯岛等2001年；吉麦罗等, 2002；斯特拉瑟等, 2002；雷温克尔等, 2004；Masuda公司等, 2005). 然而，单个TREX组件的具体功能在很大程度上仍然未知。我们的结果表明，酵母中没有明显同源性的后生动物TREX复合物的亚单位Thoc5可以直接与核输出受体Tap-p15结合。值得注意的是，由于出口受体上存在非重叠的结合位点，即使存在另一个结合适配器蛋白Aly，Thoc5也可以与Tap-p15相互作用。体内，大量mRNA输出不需要Thoc5，但特定mRNP的核输出(HSP70）依赖于Thoc5，Thoc5还涉及总适配器蛋白Aly和出口商Tap。尽管Thoc5没有表现出已知的RNA结合基序，但它可以与RNA结合在体外。我们的数据还表明Thoc5参与热休克蛋白70核出口期间的mRNP作为稳定THO复合体的组成部分。因此，Thoc5是哺乳动物细胞中的一种新的适配器RNA结合蛋白，与其他适配器Aly一起，在Tap-p15介导的特定mRNA输出中发挥作用。

迄今为止，只有人类Tap的N-和LRR-结构域（残基1-371）被描述为参与mRNA输出的衔接蛋白的结合位点(斯图茨等, 2000；弗里堡等2001年；黄等, 2003). 然而，酵母mRNA输出受体Mex67-Mtr2可以通过Mex67的Ntf2样结构域上的环限制表面与前核糖体颗粒或核孔蛋白（Nup85）相互作用(姚明等, 2007,2008). 我们的研究在Tap-p15异二聚体上发现了一个相关的表面，尽管其环较短，与FG-repeat结合域相反(图1D)并参与与Thoc5和可能的其他靶点结合。如Mex67-Mtr2异二聚体对核糖体亚单位输出的建议(姚明等, 2007)，Tap-p15可以通过Ntf2样折叠上的不同表面同时与FG-nucleoporins和Thoc5结合，这可能对热休克蛋白70mRNA。已经表明，p15是维护M域结构所必需的(弗里堡等2001年). 我们的在体外使用Tap单体和与p15复合的Tap点突变体的结合数据也表明M结构域的结构完整性，但不存在p15本身，对Thoc5结合很重要，尽管我们不能排除p15也与Thoc5发生物理相互作用的可能性。

通过同源建模，我们注意到Thoc5的N末端结构域可能采用α螺线管折叠，该结构域预计富含α螺旋。之前有人提出，一个细长的Nup85分子，它也有一系列预测的反平行α-螺旋，可以形成α-螺线管(德沃斯等, 2006)，通过其纵轴与Mex67-Mtr2异二聚体上的延伸表面结合(姚明等, 2008). 因此，Thoc5可能以类似的方式与Tap-p15异二聚体上的表面结合，该表面可能对应于Mex67-Mtr2出口受体上的环定义表面。

在一些酵母菌菌株中，热休克快速诱导抑制体mRNA的核输出(萨维德拉等, 1996). 在后生动物中，热休克主要通过阻断非热休克基因的剪接和改变翻译模式来减弱其表达(斯托蒂等, 1980；Yost和Lindquist，1986年；债券，1988年；舒克拉等, 1990；乔希·巴维等, 1992). 与这一观察结果一致，大多数热休克mRNA缺乏内含子，这可以使它们绕过热休克时依赖于脾的mRNA输出抑制(Yost和Lindquist，1986年). 另一方面，据报道哺乳动物TREX复合体在剪接过程中被招募到前mRNA中(程等, 2006). 此外，TREX亚基位于剪接因子丰富的核斑点中，在纯化过程中与剪接体共富集(周等, 2000；Masuda公司等, 2005；陈等, 2007；默兹等, 2007). 然而，我们的数据表明，人类THO复合物和Aly都与天然无内含子相关热休克蛋白70mRNA，因此在mRNA输出机制向这些新生转录物的转录依赖性加载中具有重要作用(野岛等, 2007；哟等, 2007；Taniguchi和Ohno，2008年).

这项研究的另一个意外发现是热休克蛋白70哺乳动物细胞中的mRNA严格依赖于Aly，但它需要大量poly（A）⁺RNA不太明显。这一发现与早期在不同生物体中得出的结论类似(加特菲尔德和伊扎尔拉尔德，2002年；朗曼等, 2003)这可能表明在高等真核生物中，不同mRNA核输出对某些衔接蛋白的相对需求可能不同。除Aly和Yra1外，核质穿梭的Ser/Arg-rich（SR）蛋白，如哺乳动物9G8和SRP20以及酵母Npl3，已被证明与Tap-p15或Mex67-Mtr2相互作用，因此可以作为替代性适配器(黄等, 2003,2004；Gilbert和Guthrie，2004年). 虽然后生动物中SR蛋白和TREX复合物之间的关系尚不清楚，但在酵母中，SR样蛋白Gbp2和Hrb1通过与TREX复合体的物理相互作用被招募到新生的mRNA中(受伤了等2004年). 因此，分析Thoc5和SR蛋白之间的关系很有意思，它们与Tap上的N末端适配器结合位点相互作用(黄等, 2004)，用于不同类别的信使核糖核酸的核出口。

这项研究的另一个令人惊讶的发现是热休克蛋白70mRNA需要共同适配器Thoc5才能有效地进行核输出。对这一观察有几种解释。一种可能是由于缺少内含子，热休克蛋白70mRNA需要一种特异的适配器RNA-结合蛋白才能有效地输出，而这种蛋白质可以通过脾脏依赖性（例如转录依赖性）机制来招募。另一种情况可能是Aly的有效招募和稳定绑定热休克蛋白70mRNA需要第二个适配器蛋白，如Thoc5，在热休克下可以稳定输出受体-巨噬细胞复合物，这可能会破坏蛋白质复合物的稳定性（例如。，舒克拉等, 1990). 最后，根据最近的发现，转录和翻译可以在真核细胞中耦合(汉普西和金齐，2007年；马尔二世等。, 2007；Rother和Strasser，2007年)，很容易推测Thoc5和/或THO复合物的成分可能在热休克蛋白70基因表达。这个热休克蛋白70在高等真核生物中，由于5′-非翻译区的IRES（样）活性，mRNA由cap依赖机制翻译(克莱门茨等, 1985；McGarry和Lindquist，1985年；Hultmark公司等, 1986；Joshi和Nguyen，1995年；埃尔南德斯等, 2004). 因此，TREX复合物对mRNA 5′-部分的补充不仅可以用于核输出(程等, 2006)也适用于基因表达的后续步骤，包括翻译。通过TREX依赖途径在哺乳动物细胞中输出mRNA物种的全基因组鉴定将是未来研究的最重要课题之一，以进一步了解输出途径的生物学功能。

材料和方法

补充材料

致谢

工具书类