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神经化学杂志。作者手稿；PMC 2009年3月17日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经化学杂志。2007年4月；101(2): 555–565.
2007年1月24日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1471-4159.2006.04394.x
预防性维修识别码：项目经理2657050
NIHMSID公司：NIHMS88838号
PMID：17254017

分化胚胎神经前体细胞诱导血脑屏障特性

克里斯蒂安·韦登费勒,* 克莱夫·N·斯文森,**和埃里克·V·舒斯塔*†
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

血脑屏障（BBB）是一种多功能内皮细胞界面，将血流与大脑内部隔开。虽然成熟的BBB具有很好的特征，但对这个复杂系统的胚胎发育仍知之甚少。胚胎神经前体细胞（NPC）是发育中大脑中潜在的诱导细胞类型，因此对其影响BBB特性的能力进行了检测。当嘌呤霉素纯化的脑微血管内皮细胞（BMEC）与胚胎NPC在双室Transwell系统中共同培养时，BMEC表现出增强的屏障特性，表现为增加的跨内皮电阻（TEER）和降低对小分子示踪剂荧光素钠的通透性。这些变化需要在分化的早期阶段存在NPC，并伴随着BMEC紧密连接保真度的改变，如occludin、claudin5和ZO-1在细胞-细胞边界的重新分布所示。与NPC的结果相反，出生后星形胶质细胞在BMEC TEER中引起延迟但持续时间更长的反应。BMEC共培养也抑制了NPC的神经元分化，表明两个细胞群之间存在相互作用的信号。本研究表明NPC-BMEC相互作用普遍存在，并首次证明NPC能够诱导BBB特性。

关键词：血脑屏障、脑微血管、内皮细胞、神经祖细胞、神经干细胞

介绍

血脑屏障由一类特殊的内皮细胞组成，在血流和成人大脑间隙之间形成细胞屏障。BBB通过限制血载成分的非特异性流动，在维持实质内环境稳定方面发挥着重要作用，并严格调节离子、小分子、蛋白质和细胞进出大脑的运输。血脑屏障之所以能完成这些任务，是因为其独特的内皮由连接相邻内皮细胞的上皮样紧密连接所赋予，缺乏开窗，并且拥有丰富的分子转运系统。尽管内皮细胞是屏障功能的主要决定因素，但局部微环境中的血管周围非内皮细胞已被证明做出了重要贡献。星形胶质细胞(斯图尔特和威利1981;Risau等人，1986年b;Janzer和Raff 1987)，神经元(Tontsch和Bauer，1991年)和周细胞(Balabanov和Dore-Duffy 1998年;Ramsauer等人，2002年)所有这些都被证明提供了导致独特的血脑屏障内皮表型的线索。

尽管上述脑细胞类型的诱导特性已经通过大量的体内和在体外研究表明，负责早期胚胎BBB诱导的细胞类型尚未被区分。胚胎BBB形成的发育时间因物种而异，但人们普遍认为BBB的发育开始于出生前，随后逐渐成熟为完整的BBB功能(Bauer和Bauer 2000;Engelhardt 2003年). 例如，在啮齿动物胚胎期E11和E17，血管孔消失，胞饮减少，血管直径减小(Bauer等人，1993年;Stewart和Hayakawa 1994;Bolz等人，1996年). 紧密连接形成开始于E15天，并且紧密连接复杂性在出生后第P1天继续增加(Butt等人，1990年;Schulze和Firth 1992年;Bauer等人，1995年;Kniesel等人，1996年;Nico等人，1999年). 在此期间，软脑膜血管的跨内皮电阻（TEER）介于外周血管和成人BBB之间(Butt等人1990;Schulze和Firth 1992年;Bauer等人，1995年;Kniesel等人，1996年;Nico等人，1999年). 上述属性的组合有助于限制蛋白质进入胚胎大脑(Risau等人，1986年a;Bauer等人，1995年;Dziegielewska等人，2000年)而BBB对小示踪剂（如菊粉和蔗糖）的渗透性在胚胎发育期间开始逐渐下降，并在出生后继续下降(Ferguson和Woodbury 1969). 最后，由于营养需求的变化，BBB的转运蛋白表达也从胚胎期进化到出生后阶段(约翰逊1989;Gerhart等人，1997年).

BBB的早期胚胎发育过程提出了一个问题，即是什么诱导因素或细胞类型驱动内皮分化过程。如上所述，星形胶质细胞长期以来与BBB特性的诱导有关在体外和体内实验(斯图尔特和威利1981;Risau等人，1986年b;Janzer和Raff 1987). 然而，血管新生血管侵入未成熟的胚胎神经环境，并在胶质生成开始之前很早就开始建立BBB特征，胶质生成是由啮齿动物大脑中存在GFAP阳性星形胶质细胞（E18(LeVine和Goldman 1988)). 此外，发育中的BBB血管几乎没有细胞外基质，甚至在出生前几天也很少接触星形胶质细胞(Caley和Maxwell 1970). 事实上，对于啮齿动物来说，大部分星形胶质细胞的生成发生在出生后，在此期间，围绕成熟脑毛细血管的星形胶质细胞鞘形成(约翰逊1989). 因此，星形胶质细胞不太可能在早期BBB诱导过程中发挥作用，相反，其他类型的细胞可能是BBB特性早期出现的原因。

鼻咽癌是发育中胚胎脑的主要细胞类型，最近有报道称，鼻咽癌的分化和形态受内皮细胞的影响(Shen等人，2004). 在与内皮细胞共同培养中，NPC表现出神经发生减少和自我更新增强(Shen等人，2004). 神经祖细胞也与出生后早期的血管接触，这被认为是星形胶质细胞分化的早期阶段(泽林和戈德曼1997). 此外，当内皮细胞和神经干细胞直接接触生长时，成人神经干细胞甚至可以产生具有内皮表型的后代(Wurmser等人，2004年). 最后，成人神经干细胞通常位于大脑的血管周围空间，如脑室下区和海马体，人们认为血管系统是干细胞生态位的重要组成部分(Doetsch 2003b公司). 鉴于内皮细胞与NPC之间的细胞相互作用，NPC可能也会影响脑内皮细胞表型。在这项研究中，证明了从E14胚胎脑中分离出的NPC在在体外模型由与鼻咽癌共培养的原代大鼠脑微血管内皮细胞组成。

材料和方法

大鼠脑微血管内皮细胞的分离

如前所述进行大鼠脑毛细血管的分离(Weidenfeller等人，2005年;卡拉布里亚等人，2006年). 简单地说，用镊子将成年雄性Sprague-Dawley大鼠（220–250克）的无脑膜皮质捣碎，并彻底研磨。用2型胶原酶（沃辛顿生物化学公司）和胶原酶/dispase（罗氏应用科学公司）通过连续消化/密度离心步骤从周围组织中分离毛细血管。毛细血管被镀到1.12厘米2Transwell Clear®渗透支架（0.4µm孔径，康宁），在含有DMEM、20%牛血小板缺乏血浆衍生血清、1 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF，R&D Systems）、1µg/mL肝素、2 mM L-谷氨酰胺、，和抗生素抗真菌溶液（青霉素-链霉素-两性霉素（PSA）：100 U/mL青霉素、100µg/mL链霉素和0.25µg/mL两性霉素）。培养物保存在37°C培养箱中，加湿5%CO2/95%空气。

大鼠皮层胚胎神经前体细胞的分离培养

如前所述分离大鼠皮层NPC(Ostenfeld等人，2002年). 从E14大鼠脑中解剖皮层。用accutase（Innovative Cell Technologies，San Diego，CA，USA）在37°C下处理组织10分钟，在DMEM中清洗两次，然后分离成单个细胞悬浮液。细胞最初以2×10的密度播种5T25烧瓶中的细胞/ml，在规定的无血清NPC培养基中[DMEM:HAMS-F12，3:1，补充B27（2%v/v）、表皮生长因子（EGF，20 ng/ml）、成纤维细胞生长因子（FGF-2，20 ng/ml）和肝素（5µg/ml）]。细胞作为自由漂浮的神经球生长3天，然后在第天与BMEC共同培养在体外4（DIV4）。

星形胶质细胞的分离

新生大鼠（P6）的大脑皮层被切碎在一种含氯的冰镇汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中。将切碎的组织离心2 min（500 g），再悬浮在含有胰蛋白酶的HBSS中（0.5 mg/ml），并在37°C的摇床浴中培养25 min。将胰蛋白酶化组织研磨，并通过70µm网格过滤细胞悬浮液。3×104细胞/厘米2在含有10%FBS、10%马血清、2 mM L-谷氨酰胺和PSA的DMEM中进行电镀。培养基每三天更换一次，细胞在与BMEC共培养前用0.25 mM二丁酰cAMP处理3天，以诱导体内-相似表型(Segovia等人，1994年;Enkvist等人，1996年). 免疫细胞化学证实存在GFAP表达的星形胶质细胞。

BMEC与NPC或星形胶质细胞共培养

在DIV4上收集神经球，用accutase处理，并在DMEM中清洗两次。活细胞在血细胞仪上计数，2.5×105NPC/厘米2在下部隔室中放置无丝分裂培养基，以允许NPC分化（DMEM:HAMS-F12，3:1，2%v/v B27,1%FBS和PSA，带聚赖氨酸/层粘连蛋白涂层）或用含丝分裂培养液抑制分化（无丝分裂介质加上20 ng/mL EGF和10 ng/mL FGF-2，不带聚赖胺酸/层粘蛋白涂层）(Ostenfeld等人，2002年). 然后添加含有汇合BMEC的Transwell®过滤器，以完成共培养系统(图1). 抗nestin、抗GFAP和抗βIII微管蛋白染色证实有无BMEC存在时丝裂原介导的NPC分化抑制。通过这种方式，可以确定在含有有丝分裂原的培养基中BMEC共培养之前和之后，NPC群体是GFAP和βIII微管蛋白阴性的。NPC密度高达1×106NPC/厘米2进行了测试，但未发现TEER诱导率比2.5×10时有任何提高5NPC/厘米2电镀密度。胚胎小鼠成纤维细胞（3T3，ATCC）用作非神经共培养对照。

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体外BBB模型。原代BMEC在嘌呤霉素存在下培养2天，在胶原IV/纤维连接蛋白涂层的滤膜支架上产生近100%纯的BMEC单层。在DIV 2上，将BMEC切换到无嘌呤霉素培养基。在DIV 3汇合后，在有丝分裂原（FGF-2，EGF）存在或不存在的情况下，将NPC添加到下室。所得共培养物用于评估NPC对BMEC单层BBB特性的影响。

在共培养前一天，星形胶质细胞在无分裂原培养基中进行预处理，以避免血清提取可能对星形胶质细胞诱导的时间反应产生的影响。预处理24小时后，用胰蛋白酶-EDTA溶液处理星形胶质细胞，并将单个细胞重新悬浮在无分裂原培养基中。共6.25×104星形胶质细胞/cm2在无丝分裂培养基中将其添加到下层隔室中，并添加带有融合BMEC单层的过滤器插入物。

免疫细胞化学

所有步骤均在20°C下进行。用0.01 M PBS轻轻清洗BMEC和NPC培养物三次，并用多聚甲醛（PBS中4%w/v）固定。阻断和渗透后（10%的山羊血清在PBS（PBSG）中含有0.1%Triton X-100，30分钟），一级抗体（抗巢蛋白，[BD Biosciences]，兔抗胶质纤维酸性蛋白[GFAP，DAKO Cytomation]，抗βIII微管蛋白[BD Biosciences]，抗血管性血友病因子[Sigma]用3%山羊血清在PBSG中稀释抗闭塞素、抗小带闭塞素-1、小鼠抗克劳丁5[Invitrogen]、MBP和CNPase检测的一级抗体混合物[Orion Biosolutions]），并与样品孵育1h。用PBS清洗样品，并用二级抗体（得克萨斯红山羊抗兔IgG、Alexa Fluor山羊抗鼠IgG抗体）在PBSG中用3%山羊血清稀释1小时。将PBS中浓度为300 nM的DAPI核染色剂添加到微孔中5分钟。对于脑组织切片的免疫细胞化学，将新鲜分离的E14大鼠大脑包埋在组织冷冻介质中，在液氮中快速冷冻，切片，并如上所述进行标记。

电阻测量

使用EVOM电压表（世界精密仪器公司）测量跨内皮细胞电阻（TEER）。电阻值（Ω×cm2)通过减去基底涂层空过滤器的电阻进行校正。在每个时间点，每个Transwell Clear®过滤器进行三次TEER测量，以得出每个过滤器的平均TEER值。随后，使用每种培养条件下三份滤纸的TEER值计算报告的平均值和标准偏差。

渗透率研究

通过测定荧光素通过BMEC单层的通量来评估渗透性。将DMEM中的荧光素钠盐添加到顶部过滤室中，以产生1µM的均匀初始浓度。随后，在0、15、30、45和60分钟后，从基底外侧隔室中取出200µl。使用FL×800荧光阅读器（Bio-Tek仪器）测量荧光，以及用于测定通透性的下部隔室中荧光素积累速率，如前所述(Perriere等人，2005年).

文化定量分析

通过叠加抗nestin（未分化NPC）、抗βIII微管蛋白（神经元）和DAPI图像或叠加抗nestin、抗GFAP（星形胶质细胞）和DADI图像来计算NPC衍生细胞类型。通过测定特定标记物阳性标记细胞的百分比来评估细胞分布。对于这种测定，每种标记类型（βIII微管蛋白/Nestin或GFAP/Nestin，每种条件下约1000个总细胞）的5个随机场在40倍的放大倍数下计数。根据制造商的说明，通过BrdU与5-溴-2′-脱氧尿苷标记和检测试剂盒I（罗氏应用科学公司）的结合来评估BMEC的增殖。在BMEC与NPC 24小时共培养开始时，将BrdU添加到培养物中。24h后固定细胞，通过DAPI核染色评估总BMEC数，并在3个过滤器的每个过滤器上测定6个不同区域的BMEC合并BrdU的百分比（每个条件下800个细胞）。采用类似程序评估NPC-BrdU掺入和NPC总细胞数。通过随机选择相位对比模式下的显微镜视野，在不可见连接超微结构的情况下，测定了含有磨损连接的BMEC占其总细胞边界显著部分（大于10%）的百分比。然后在荧光模式下获取用于闭塞素标记的免疫细胞化学图像。如果免疫标记照射不平行于细胞-细胞边界的紧密连接突起，则相邻细胞之间的连接（每张图像100个细胞，每种情况总共5个图像）被定义为磨损。

结果

原代脑内皮细胞-胚胎NPC共培养模型

使用一种新的方法研究了NPC对成人BMEC屏障特性的影响在体外模型由原代大鼠BMEC和胚胎大鼠皮层NPC组成。自从从成人大脑去分化细胞中分离出BMEC以来在体外(Krizbai和Deli 2003)尽管它们仍具有一定程度的BBB特性，但它们已被广泛用于BBB诱导和调制的研究。使用微孔过滤装置（Transwell-Clear®）将NPC和BMEC与分别代表血脑屏障（BBB）的血侧和脑侧的上隔间和下隔间共同培养(图1). 过滤器设置允许就地通过监测小电解质的细胞旁通量，测量内皮细胞间电阻（TEER），获得有关BMEC单层完整性的信息。纯化的骨髓基质细胞在滤膜的上表面培养，3天后在体外（DIV3）已经生长到通过相差显微镜测定的汇合处。嘌呤霉素治疗确保了近100%的纯内皮单层，我们和其他人已经证明这种啮齿动物在体外BBB模型显示了明确的紧密连接，并对小分子示踪剂形成了不可渗透的屏障(Perriere等人，2005年;Weidenfeller等人，2005年;卡拉布里亚等人，2006年). 重要的是，该模型已被证明可用于测量BMEC对诱导因子（如cAMP、星形胶质细胞和糖皮质激素）的反应(Perriere等人，2005年;Weidenfeller等人，2005年;卡拉布里亚等人，2006年)，因此适用于NPC电感容量的测试。为了将NPC与BMEC单层共培养，将E14大鼠新鲜分离的NPC在EGF和FGF-2有丝分裂原培养基中扩增3天（参见材料和方法详细信息），然后在较低的隔间培养，以便BMEC和NPC可以通过可溶性介质相互作用。当在无丝分裂培养基中共同培养时，NPC附着在下层的聚L-赖氨酸/层粘连蛋白涂层底物上，生成NPC（巢蛋白阳性）和分化后代的混合物，包括星形胶质细胞（GFAP阳性）和神经元（βIII微管蛋白阳性）。有丝分裂原存在下的共培养仅支持作为巢式阳性NPC的增殖。

NPC对BMEC TEER和渗透率的影响

这个在体外共培养模型用于研究NPC可能参与诱导BMEC单层BBB特性。为了确定NPC或NPC衍生细胞是否会影响在体外在存在或不存在分化型NPC（无丝分裂条件）的情况下，测量BMEC单层的屏障表型TEER。共培养24小时后的TEER测量表明，与NPC共培养的单层TEER增加了47%（110±5Ω×cm2)与缺乏NPC的对照BMEC培养物相比（75±4Ω×cm2)表明对鼻咽癌释放的可溶性因子有早期诱导反应(图2，第1列和第2列）。在通透性研究中也观察到分化型鼻咽癌存在时的屏障增强效应，其中鼻咽癌共培养使荧光素钠盐单层通透性降低33%，鼻咽癌影响(表1). BBB-不透性荧光素扩散的减少和TEER的增加直接相关。此外，为了支持调节TEER增加的可溶性因子的存在，将经过24小时共培养条件调节的培养基连续应用于新鲜BMEC单层。与仅在BMEC条件培养基中生长的BMEC单层相比，BMEC-NPC共培养条件培养基再次诱导BMEC TEER（150±6%）。最后，即使NPC在1-5周的更长时间内保持无差异状态在体外在与BMEC共培养之前，在无分裂条件下仍能观察到诱导特性（TEER增加31-43%）。

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NPC共培养和NPC条件培养基对BMEC TEER的影响。BMEC培养如下：1。在没有NPC（控制）的情况下，2。在存在分化NPC（+NPC−有丝分裂原）的情况下，3。在存在24h前分化NPC（+NPC 24h prediff）的情况下，4。在NPC条件培养基中，NPC在无分裂原分化培养基（NPC条件-有丝分裂原）中培养24小时后生成，5。在有丝分裂原培养基（NPC+有丝分裂素）中存在NPC，6。在分离NPC（NPC条件+有丝分裂原）的24小时条件含丝分裂原培养基中。24小时后，对每种培养条件的TEER进行监测，并以对照TEER值的归一化%表示。将含有丝分裂原的条件（5和6）独立归一化为含有丝裂原的BMEC单细胞培养对照。统计显著性如下所示第页<0.001（**）和第页<0.03（*），由未配对学生的t检验确定。对每种情况下的三份培养物进行分析，结果显示平均值±SD。该结果代表了8个独立实验，其中分化型鼻咽癌（2）的TEER增加范围为17-53%。

表1

分化型鼻咽癌对BMEC通透性、结构和增殖的影响。

BMEC公司渗透率（10−4厘米/分钟）（a）三通（Ω×cm2)%磨损的（b）细胞密度（104细胞/厘米2)（c）%溴化铀+细胞
+NPC公司3.3 ± 0.5105 ± 733.5 ± 3.1%2.56 ± 0.228.7 ± 2.4
−核电站4.9 ± 1.165 ± 665.1 ± 2.1%2.49 ± 0.208.7 ± 6.3
a）渗透性：这些培养物对荧光素钠盐的渗透性和相应的TEER值（n=6，渗透性p<0.004，TEER p<0.001）。
b）%磨损：包含磨损边缘的细胞的百分比超过其总细胞边界的显著部分（大于10%）（p<0.001）。
c）结合内皮特异性标记物和DAPI核染色测定每个区域的内皮细胞数量。表1中的所有数据均表示平均值±标准偏差，统计置信度由未配对学生的t检验确定。

相反，在没有BMEC的情况下分化NPC的条件培养液（24小时）在应用于BMEC后24小时内对TEER没有影响(图2，第4列）。当与在没有BMEC的情况下预先分化的鼻咽癌共同培养24小时时，TEER增加减弱（11±6%）(图2，第3列）。为了确定增殖的、未分化的巢式阳性鼻咽癌或增殖的、尚未分化的鼻咽癌的条件培养液是否能诱导TEER增加，BMEC分别在有丝分裂原存在的情况下与鼻咽癌共培养，或与来自24小时有丝分裂素处理的、增殖的鼻咽炎的NPC培养条件培养液共培养(图2，第5列和第6列）。在这些条件下，24小时后BMEC TEER中未观察到诱导。最后，研究了非神经胚胎3T3成纤维细胞对BMEC的影响，并且与有丝分裂原处理的NPC一样，没有观察到诱导（数据未显示）。存在未分化、增殖的NPC或3T3成纤维细胞时缺乏诱导，这表明在存在分化NPC时观察到的表型变化与单纯存在另一种细胞类型无关。

鼻咽癌共培养对骨髓基质细胞形态的影响

对单独培养或与NPC共同培养的BMEC的紧密连接进行研究，以确定NPC是否能够影响BMEC细胞与细胞的接触或细胞形态，从而解释TEER增加和荧光素通透性降低的原因。用抗紧密连接蛋白ZO-1、闭塞素和克劳丁5的抗体检测BMEC(图3 A、C、E)或缺席(图3。B、 D、F)区分NPC。在NPC患者中，大多数BMEC显示出牢固的紧密连接，并有明显的闭塞素、克劳丁5和ZO-1染色。在没有鼻咽癌的情况下，细胞-细胞连接也很明显，但紧密连接染色显示65%的BMEC呈现不规则的磨损染色模式，而在有鼻咽癌时，只有34%的BMEC表现出这种连接结构(表1,图3). 在这两种条件下，细胞形态和细胞大小无法区分(表1). 对有或无鼻咽癌共培养的BMEC进行F-actin定位，未检测到BMEC-NPC共培养和BMEC单培养之间的差异。在这两种情况下，都观察到了肌动蛋白的紧密结合部位以及细胞内肌动蛋白丝（数据未显示）。

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分化型鼻咽癌存在（A、C、E）或不存在（B、D、F）时BMEC的紧密连接组织和细胞形态。在无丝分裂培养基中共培养24小时后，检测BMEC中的ZO-1（A，B）、闭塞素（C，D）或克劳丁5（E，F）。注意，紧密连接突起垂直于细胞-细胞边界，代表磨损的连接。箭头所示的示例被放大并显示在面板B的插图中。显示了代表性字段以说明接合形态的差异。请参见表1对应的定量数据。比例尺表示50µm。

NPC对BMEC增殖的影响

接下来，对BMEC的过滤密度进行评估，以确定TEER值的增加是否是单层膜紧密堆积的结果。采用DAPI核染色和5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）掺入法分别检测有或无NPC共培养的BMEC单层细胞的密度和增殖情况。作为表1表明，NPC-BMEC共培养物和BMEC单培养物之间的增殖内皮细胞数量或BMEC细胞密度没有显著差异。

共培养系统中的潜在诱导细胞类型

为了确定可能导致TEER诱导的NPC衍生细胞类型以及观察到的连接结构变化，对基底外侧室中的NPC子代进行了星形细胞（GFAP）、神经元（βIII-管蛋白）和祖细胞（nestin）标记物的探测(图4). 在存在或不存在BMEC的情况下，下层室中NPC衍生细胞的总数和增殖的BrdU的数量没有显著变化+细胞也相同（约40%）。与BMEC共培养24小时后，大多数NPC衍生细胞仍为巢蛋白阳性（65±5.3%），在此期间首次观察到NPC诱导效应。结果还表明，鼻咽癌分化为神经元和胶质细胞。第二大细胞群GFAP和nestin均阳性（15.6±3.8%），表明这些细胞可能是未成熟的星形胶质细胞。一小部分细胞（9.7±2.7%）仅为GFAP阳性，被认为是更成熟的星形胶质细胞。在24小时内，NPC存在时产生的神经元很少（6.5%±0.7%），βIII微管蛋白未成熟和巢蛋白阳性神经元很少（3.3±1.0%）。在没有BMEC的情况下，更多的NPC向神经元方向分化，而GFAP阳性细胞和GFAP/nestin共染细胞的数量未受影响。在没有BMEC的情况下，神经元数量的增加伴随着巢蛋白阳性细胞数量的减少（46±4.2%），这表明鼻咽癌在不受BMEC影响的情况下更容易分化。使用抗髓磷脂碱性蛋白或2'3'-环核苷酸-3'磷酸二酯酶（CNPase）的抗体，通过免疫荧光不能检测到少突胶质细胞。

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BMEC对NPC分化的影响。NPC在有或无BMEC培养24小时后固定。使用细胞标记物（βIII微管蛋白、GFAP和nestin）通过间接免疫荧光测定细胞类型，并对细胞进行计数。统计显著性如下所示第页< 0.001 (***),第页<0.01（**），以及第页<0.03（*），由未配对学生的t检验确定。结果表示5种不同显微镜视野的平均值±SD（总计约1000个细胞）。

BMEC对鼻咽癌形态的影响

通过研究BMEC对NPC衍生细胞形态的影响，进一步收集了BMEC-NPC串扰的证据。与原代BMEC共培养显著影响神经前体细胞的形态。在没有内皮细胞的情况下允许NPC增殖和分化（无丝分裂条件）的NPC具有较小的细胞体，并显示出成熟星形胶质细胞和神经元典型的多个薄突起(图5 A和C). 相反，BMEC的存在减少了突起的数量和长度，细胞具有更扁平的前驱体样形态(图5 B和D). 这种效应在每种类型的星形胶质细胞、神经元和NPC细胞中都可以检测到。

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BMEC共培养对鼻咽癌形态的影响。检测GFAP（红色）、nestin（绿色）和DAPI（蓝色）（面板A和B）或βIII tubulin（红色），nestin和DAPI的NPC合并图像（面板B和C）。面板A和C表示存在BMEC时的分化，面板B和D表示不存在BMEC。箭头表示小胞体和细长的细突起（面板A和C），箭头表示较大胞体和短突起（板B和D）。比例尺表示20µm。

E14大鼠脑内血管-NPC定位的测定

为了关联在体外观察到实际细胞分布的结果体内在发育中的E14大鼠皮层中，研究了NPC、星形胶质细胞和神经元的分布。根据nestin的表达，鼻咽癌可以在整个皮层中识别出来，在靠近心室的内侧皮层密度很高(图6 A、B、D). 放射状胶质细胞延伸到软脑膜表面，被鉴定为细长的巢蛋白阳性细胞。在软脑膜近端区域，也可以观察到高密度的神经元(图6 B、C). 通过抗谷氨酸1、抗PECAM1和抗血管性血友病因子标记，可以很容易地在整个胚胎脑中识别血管，并且在鼻咽癌和神经元数量较多的区域发现血管(图6 A). 相反，E14大鼠皮层中未检测到星形胶质细胞(图6 D). 最后，未检测到紧密连接蛋白闭塞素，表明E14大鼠脑中存在未成熟的内皮连接(图6 C).

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胚胎第14天发育大鼠皮层。A组显示发育中的皮层中的血管性血友病因子阳性血管（红色）。vWF阳性血管（几个用箭头表示）定位于具有大量巢蛋白表达细胞的区域（绿色），并从软脑膜表面分布到心室。图B显示软脑膜表面有高度βIII微管蛋白阳性区（红色），整个NPC阳性（绿色）心室区神经元分布均匀。C组再次显示了βIII微管阳性神经元的分布，此外还缺少紧密连接蛋白闭塞素（绿色）。图D显示，虽然E14大鼠皮层呈高巢蛋白阳性（绿色），但未检测到星形细胞蛋白GFAP（红色）。P=pial表面；V=心室。比例尺代表400µm。

出生后星形胶质细胞与胚胎NPC介导屏障诱导的比较

尽管BMEC-NPC共培养中的大多数NPC衍生细胞呈nestin阳性，但也存在少量星形胶质细胞（GFAP）或未成熟星形胶质细胞。因此，为了区分通常与星形胶质细胞相关的作用和由分裂和分化NPC介导的作用，直接比较了这两种情况下的TEER诱导特性。与NPC-BMEC共培养平行，BMEC也与出生后（P6）星形胶质细胞共培养，密度与BMEC-NPC共培养实验中计算的GFAP阳性细胞数量（25%）相对应。根据这些计数，BMEC与星形胶质细胞（6.25×104/厘米2)或NPC（2.5×105/厘米2)TEER作为时间函数进行监控(图7). 数据表明，NPC诱导BMEC TEER增加24%（96±5Ω×cm2)与24小时后未治疗的对照组相比（77±5Ω×cm2)而星形胶质细胞并未诱导TEER的显著增加（78±4Ω×cm2)在此期间。星形胶质细胞共培养达到的最大TEER与NPC达到的相似，并在共培养48小时后检测到，其中星形胶质细胞（97±5Ω×cm2)导致TEER增加38%。到72小时，鼻咽癌共培养的TEER下降到单培养对照的水平。然而，在星形胶质细胞共培养的情况下，TEER仍然升高到120小时。为了研究星形胶质细胞总密度低于NPC是否有助于诱导反应的延迟，还对BMEC与汇合的星形胶质细胞单层进行了共培养。高密度星形胶质细胞共培养产生的TEER诱导量和时间响应与低密度星形胶质胶质细胞共培育相同，包括TEER诱导延迟（数据未显示）。

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与鼻咽癌或星形胶质细胞共培养的BMEC的TEER测量。使用相同的无丝裂原培养基将NPC或出生后星形胶质细胞与融合的BMEC共培养，并遵循TEER时间过程5天。对每种情况下的三份培养物进行分析，并将电阻测量值与时间零点时未经处理的对照组的电阻测量值标准化，结果显示平均值±SD。样本和对照之间的统计显著性表明：p<0.006（*）、p<0.02（**）和p<0.001（***）。这些结果是来自多个BMEC、NPC和星形胶质细胞分离物的5个独立共培养实验的代表性结果。文本中所示的百分比增加是指在关注时间点（24或48小时）相对于控件的TEER增加。在24小时时观察到的对照BMEC培养物的TEER最初增加是可重复的，这是由于切换到无分裂原培养基后血清含量降低的结果。

讨论

本研究研究了NPC对BMEC BBB性能的影响。安在体外评估由原代大鼠BMEC和胚胎NPC组成的模型的屏障特性，并与缺乏NPC的BMEC模型进行比较。NPC通过诱导TEER、降低渗透率和影响紧密连接结构而显著影响BMEC。仅在分化的NPC中观察到屏障诱导效应，而在有丝分裂原存在下增殖的NPC对BMEC单层TEER没有影响。最后，从TEER诱导的时间和持续时间来看，NPC诱导的屏障强化效应与星形细胞诱导的屏障增强效应是不同的。据我们所知，这是首次证明NPC对BMEC血脑屏障特性的直接影响。

在无分裂原培养基中与鼻咽癌共培养24小时后，可以检测到BMEC TEER的增加，并且与荧光素通透性的降低相关。由于荧光素是一种小分子，无法明显穿过BBB体内(霍夫曼和奥尔谢夫斯基1961)这些测量值可作为BBB模型功能抗渗性的晴雨表。绝对TEER值（70–120Ω×cm2)本研究中获得的是其他大鼠和小鼠BBB模型的典型TEER值(de Vries等人，1996年;Perriere等人，2005年;Weidenfeller等人，2005年;卡拉布里亚等人，2006年;Kis等人，2001年). 作为比较，NPC对BMEC荧光素通透性的影响（3.3±0.5×10−4cm/min，通透性降低33%）与之前在大鼠BMEC与星形胶质细胞（2.7×10−4厘米/分钟(Kis等人，2001年;Perriere等人，2005年)). 观察到的影响可能是由于滤膜上的BMEC密度较高所致。然而，NPC不会影响内皮细胞密度，也不会产生更多增殖的BMEC。因此，可以得出结论，NPC对BMEC性能的诱导不仅仅是基于更紧密的单层，也不是新形成的BMEC具有优化性能的结果，因为它们是在NPC影响下生成的。相反，这种效应与紧密结保真度相关，因为很大一部分BMEC具有在NPC存在下连续的结（33.5%磨损，110Ω×cm2)而在没有NPC的情况下，细胞-细胞连接主要磨损（65.1%磨损，75Ω×cm2). 先前也发现，磨损的BMEC紧密连接的减少与BMEC培养物中较高的TEER和较低的渗透性有关(Weidenfeller等人，2005年;卡拉布里亚等人，2006年). 与鼻咽癌诱导病例类似，使用BBB诱导的糖皮质激素如皮质酮（21%磨损，168Ω×cm2)或氢化可的松（12%磨损，218Ω×cm2)减少了磨损连接的数量，增加了TEER，同时也降低了荧光素的渗透性（0.66×10−4氢化可的松（cm/min）(Weidenfeller等人，2005年;卡拉布里亚等人，2006年). 综上所述，这些结果表明，NPC存在时屏障性能的改善可能是细胞间连接接触改善的结果。

由于BMEC和NPC由微孔滤膜和1 mm培养基分离(图1)，屏障诱导明显由可溶性因子介导。当鼻咽癌开始分化为星形胶质细胞和神经元时，在无丝分裂培养基中观察到这种诱导，但在有丝分裂原的存在下，鼻咽癌处于未分化的巢蛋白阳性状态，这种诱导是无法检测到的(量规2000;Ostenfeld等人，2002年). 这一发现表明，分化过程的某些组成部分可能是BMEC屏障诱导所必需的，而NPC在未分化状态下增殖不会产生重大影响。尽管有丝分裂原本身的存在可能影响了BMEC单层的完整性，从而掩盖了增殖、巢蛋白阳性NPC释放的因子的影响(Sobue等人，1999年)在含有有丝分裂原的培养基中，对照BMEC的TEER测量结果表明这一点并不明显。3T3成纤维细胞、增殖巢蛋白阳性的鼻咽癌或出生后24小时的星形胶质细胞缺乏BMEC诱导，也表明观察到的分化型鼻咽癌的诱导并不是一般的营养反应，因为存在另一种增殖细胞类型，但这表明需要区分NPC的特定属性。当BMEC在分化NPC条件培养基中培养24小时时，未检测到TEER诱导。因此，鼻咽癌分化过程中BMEC的存在是鼻咽癌释放BBB诱导可溶性因子所必需的，这一发现暗示了BMEC与鼻咽癌之间的双向沟通。通过证明共培养条件培养基在连续应用于新鲜BMEC单层时增加TEER的能力，进一步验证了NPC和BMEC之间的必要相互作用。为了确定缺乏早期BMEC的预分化NPC是否影响释放诱导因子，NPC在没有有丝分裂原的情况下进行预分化，然后添加到BMEC单层中。在共同培养24小时后，仅检测到BMEC TEER略有增加（11%预分化与47%共同分化鼻咽癌）。在没有BMEC的情况下进行24小时的预分化后，只有不到50%的NPC未分化（仅巢蛋白阳性），与高纯度未分化NPC群体开始共培养相比，可能会削弱分化细胞的作用。这些观察结果支持这样的结论，即分化的NPC，而不是分化的（微管蛋白或GFAP阳性）或增殖的（巢蛋白阳性）NPC，刺激了BMEC屏障的诱导。

NPC增殖为巢蛋白阳性细胞，并在无核分裂条件下分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞(Ostenfeld等人，2002年;Ostenfeld和Svendsen 2004). 因此，NPC衍生的星形胶质细胞或神经元可能负责TEER的诱导。大量研究表明，星形胶质细胞和神经元具有调节BBB紧密连接、转运体表达和代谢活动的潜力在体外和体内(斯图尔特和威利1981;Risau等人，1986年b;Savettieri等人，2000年). 在BMEC存在的情况下，很少产生βIII微管蛋白阳性神经元和βIII微管蛋白/nestin共阳性细胞（10%合并）。此外，由于在共培养前预分化NPC时存在更多的神经元，但由此产生的诱导效应减弱，βIII微管阳性神经元在观察到的诱导过程中似乎没有发挥重要作用。近16%的NPC衍生细胞对GFAP和nestin均呈阳性，表明第二大细胞群致力于星形胶质细胞的命运，但尚未完全成熟。只有10%是GFAP表达定义的成熟星形胶质细胞。虽然星形胶质细胞是BBB特性的强诱导剂，但NPC诱导TEER的时间进程表明，NPC作用较早，而星形胶质细胞作用则更长。同样，含有25%GFAP阳性细胞的预分化鼻咽癌培养物在24小时后也仅表现出弱诱导特性(图2，第3列）。有趣的是，NPC和星形胶质细胞导致BMEC达到相似的最大TEER值，表明在这些实验条件下NPC和星形胶质细胞的绝对诱导能力相当，尽管诱导的动力学明显不同。虽然本研究不能完全排除NPC衍生的星形胶质细胞提供诱导信号的可能性，但这些数据强烈表明，分化NPC和星形胶质细胞通过不同的诱导机制或至少不同的时间程序发挥作用。

除了鼻咽癌提供的诱导信号外，BMEC还影响鼻咽癌的形态和分化，进一步表明存在双向旁分泌相互作用。原代BMEC存在时，前驱体样子代变平，神经元生成减少，这一发现证实了先前一项研究的结果，该研究将脑内皮细胞系或肺动脉内皮细胞用于胚胎神经干细胞共培养(Shen等人，2004). 此外，先前的研究还表明，去除内皮细胞后，神经发生增加(Shen等人，2004). 其他研究也表明，内皮细胞有助于新形成的神经元的募集，从而表明内皮参与了鼻咽癌的调节(Louisaint等人，2002年)并刺激星形胶质细胞前体分化为表达GFAP和S100β的成熟星形胶质细胞(Mi等人，2001年). 也有人认为，祖细胞在发育过程中与微血管的接触有利于星形细胞谱系(泽林和戈德曼1997). 最后，在成人大脑中靠近所谓干细胞龛中血管系统的各个区域也发现了NPC(Doetsch 2003b公司)在成人中，神经发生发生在与血管密切相关的病灶中(Palmer等人，2000年). 也有证据表明，血管生成和神经发生可能是共同调节的，因为它们受到许多相同因素的刺激，如bFGF、VEGF、IGF-1和TGF-β̃此外，内皮细胞分泌已知的神经元分化和生存因子（bFGF、IGF-1、VEGF、PDGF、IL8和BDNF），在睾酮诱导的血管生成过程中，成年鸣禽脑中发现血管生成和神经生成之间的联系(Palmer等人，2000年;Jin等人，2002年;Louisaint等人，2002年). 因此，双向BMEC-NPC通信在胚胎发育和成人大脑可塑性中都可能发挥重要作用。

E14天发育中大脑皮层的主要细胞类型是NPC、放射状胶质细胞、成神经细胞和神经元(图6、和参考(Bass等人，1992年;桑德斯等人，2000年;McCarty等人，2002年;Doetsch 2003年a)). 这些细胞与发育中的脑血管密切接触体内血脑屏障内皮特性的出现体内血管侵入胚胎大脑后不久，内皮细胞开始变薄(Bauer等人，1993年;Stewart和Hayakawa 1994;Bolz等人，1996年)，脑血管通透性降低，TEER增加(Risau等人，1986年a;Bauer等人，1995年). BBB发育的早期阶段发生在发育中的大脑中星形胶质细胞稀少的时候(图6、和参考(LeVine和Goldman 1988年)). 因此，除星形胶质细胞外，脑细胞可能能够诱导脑内皮细胞的早期BBB特性，这是完全合理的。在发育中的脑环境中，NPC分化过程可以为幼稚的脑EC获得初始BBB属性提供必要的线索；然而，在发育的后期，星形胶质细胞会诱导进一步成熟，并有助于维持分化EC中的BBB特性(图7). 因此，本研究中提供的观察结果表明，分化NPC对于发育中的胚胎脑中BBB特性的早期出现可能很重要，尽管还需要进行额外的研究来确定所报告的BMEC-NPC相互作用的确切生理影响。尽管对于本文所述的研究来说，幼稚胚胎脑内皮细胞的产量低得令人望而却步，但考虑使用在体外该模型采用胚胎BMEC甚至干细胞衍生EC，为BBB和NPC共同发展的过程提供了额外的见解。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款AA013834的支持。Christian Weidenfeller是德国Forschungsgemeinschaft博士后研究金（DFG，We 4172/1-1）的获得者。

使用的缩写

英国广播公司血脑屏障
BMEC公司脑微血管内皮细胞
碱性成纤维细胞生长因子/FGF2碱性成纤维细胞生长因子
溴化铀5-溴-2′-脱氧尿苷
DAPI公司4'，6-二氨基-2-苯基吲哚二氢氯化物
DMEM公司Dulbecco改良的Eagle介质
DIV公司体外培养天数
表皮生长因子表皮生长因子
FBS公司胎牛血清
GFAP公司胶质纤维酸性蛋白
哈佛商学院汉克的平衡盐溶液
NPC公司神经祖细胞
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
PSA公司青霉素-链霉素-安非他命
发球台跨内皮电阻
ZO-1号机组闭塞带-1。

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