喀斯特小鼠缺乏导致胚胎死亡4,5，因此无法确定喀斯特肺肿瘤的突变反映了肺癌发生所需的特定致癌功能，并且不能被突变所补偿赫拉（Hras）或Nras公司. The赫拉斯基鼠标提供了一个完全缺乏的可行模型喀斯特表达三()，但带有“敲门”赫拉斯在控制下表达的cDNA喀斯特监管要素。我们推断赫拉斯基如果出现以下情况，小鼠应该对肺部肿瘤的发展具有抵抗力喀斯特蛋白质对肺癌的发生至关重要。为了控制结构改变影响实验结果的可能性，我们使用了克拉斯基编码序列对应于克拉斯-4B异构体被敲回到喀斯特轨迹以生成赫拉斯基鼠标三.赫拉斯基小鼠表达的Hras蛋白水平升高，与赫拉（Hras）这些动物的基因剂量从两个拷贝到四个拷贝().克拉斯基小鼠表达的Kras蛋白水平与重量老鼠，正如预期的那样克拉斯-4B是主要的剪接亚型9,10这些动物的Akt和Erk激活水平与重量小鼠(). p38α的水平也没有差异，最近的研究表明p38α影响ras（拉斯维加斯）介导性肺癌11因此，Hras水平的升高不会影响与癌症发展相关的主要下游效应通路。
Ras蛋白水平及其对下游信号效应器的影响赫拉斯基和克拉斯基老鼠对未经治疗的小鼠肺中Ras蛋白水平的分析表明，Hras蛋白水平升高，Kras蛋白完全缺失赫拉斯基纯合子小鼠。小鼠纯合子和杂合子克拉斯基等位基因表达的Kras蛋白水平与重量老鼠。在所示基因型的小鼠中，通过蛋白磷酸化测定Akt和Erk的激活以及p38α的水平没有明显差异。
我们治疗过赫拉斯基纯合和杂合小鼠和重量与乌拉坦同寝，20周后处死动物进行分析。令人惊讶的是，赫拉斯基纯合子小鼠发生的肺部肿瘤约为正常小鼠的10倍重量窝友对照组（44.8±11.7 vs.4.7±2.9()). 年肺部肿瘤数量赫拉斯基杂合小鼠（29.9±5.8）介于重量和赫拉斯基纯合子动物。虽然先前的研究表明激活突变喀斯特对肺癌的发展很重要2,7,12,13，我们的发现表明喀斯特对于肺癌的发生显然是可有可无的。
赫拉斯基小鼠对氨基甲酸乙酯诱发的肺肿瘤高度敏感赫拉斯基纯合子小鼠发生的肺癌明显多于重量室友。肺部肿瘤数量的增加与赫拉斯基等位基因。误差线表示标准偏差，并使用Wilcoxon Mann-Whitney检验进行统计。
肺肿瘤的多样性与肿瘤的数量相关的观察赫拉斯基等位基因表明该等位基因是赫拉斯基老鼠。大多数肺部肿瘤（27例中的21例）来自重量小鼠体内含有激活突变喀斯特如前所述，通常位于第61密码子，但也位于第12或13密码子2,7(补充表1). 在35例肺癌中赫拉斯基分析纯合小鼠，32只（91%）在赫拉斯基等位基因。杂合子赫拉斯基小鼠，绝大多数肺部肿瘤（>90%）的赫拉斯基等位基因，内源性喀斯特基因出现在不到10%的肿瘤中(第页= 1.6 × 10-22，费希尔精确测试）。在所有情况下赫拉斯基等位基因涉及第61密码子处的CAA>CTA颠倒，这是赫拉（Hras）两阶段化学致癌方案诱导的小鼠皮肤肿瘤中的基因14然而，我们从未发现内生赫拉（Hras）氨基甲酸乙酯诱导的肺肿瘤中的突变基因。以下事件的发生赫拉（Hras）因此，肺肿瘤的突变完全依赖于赫拉（Hras）从喀斯特轨迹。
我们进一步探讨了ras（拉斯维加斯）通过诱导同一肿瘤类型的肺癌和皮肤肿瘤的基因突变赫拉斯基纯合子小鼠。腹腔内注射单剂量氨基甲酸乙酯诱发肺部肿瘤，然后用氨基甲酸乙酯在皮肤上进行单次局部治疗，随后每两周应用一次十四烷基-羟基乙酸乙酯（TPA）诱导乳头状瘤的发生。所有分析的肺肿瘤（n=28）在赫拉斯基等位基因。在这些小鼠中发生的乳头状瘤（n=20）中，15（75%）在内源性赫拉（Hras）7号染色体上的基因，与先前的研究一致14,15在剩下的5例乳头状瘤中，4例（20%）的乳头状瘤组织中含有CAA>CTA突变赫拉斯基等位基因。内源性突变喀斯特基因很少出现在重量小鼠，但在赫拉（Hras）-/-没有内源性的小鼠赫拉（Hras）目标可用16.中的监管要素喀斯特因此能够将表达导向表皮内的至少一个子集的靶细胞，但总体偏好强烈支持赫拉斯这些结果表明，Kras（拉斯维加斯）肺癌的突变选择赫拉（Hras）皮肤癌涉及每个基因特有的顺式调节元件，而不是编码蛋白之间的功能差异。以前的研究已经证明小鼠中存在多种序列变异喀斯特可能影响表达调控的基因17，需要进一步研究以确定所涉及的特定元素。
和其他人一样喀斯特肺部肿瘤发展模型12,13,赫拉斯基小鼠出现乳头状腺瘤()但混合性腺瘤明显增多()和实体腺瘤()有时伴有支气管内扩张(，插图）。相当大比例的实体腺瘤含有上皮样形态的细胞()-大而饱满的细胞，细胞核偏心，细胞质丰富，从细颗粒和嗜酸性到微泡和双亲性。细胞角蛋白8/18染色阳性()PAS染色阴性()证明这些细胞绝大多数是上皮样、非黏液性肿瘤细胞。这些实体上皮样肿瘤SP-C染色阳性()对CCA/CC10呈阴性()就像聚氨酯治疗的肿瘤重量小鼠和其他小鼠肺癌模型12,13,18.
肺部肿瘤来自赫拉斯基小鼠呈现乳头状、实性和混合生长模式，并含有上皮样形态的细胞重量和赫拉斯基小鼠出现乳头状突起(一)，混合(b条)和实体腺瘤(c（c）). 鉴于重量动物主要发展为乳头状腺瘤，偶尔伴有混合性和实体瘤赫拉斯基小鼠倾向于发生更多混合性和实体性腺瘤，有时伴有明显的支气管内扩张(c（c），插图，用星号标记）。中的虚线(b条)标记混合腺瘤的乳头（左）和实体（右）部分之间的边界。几个实体腺瘤来自赫拉斯基含有上皮样细胞的小鼠(日期：，插图放大e（电子）)染色呈阳性(如果)细胞角蛋白8/18和PAS阴性(克). 偶尔出现巨噬细胞簇(f、，角蛋白阴性细胞）也存在于上皮样腺瘤中。杯状细胞化生是PAS/粘蛋白的阳性对照(克，插图）。这些腺瘤显示肺泡II型肺细胞的特征，与乳头状细胞相似（未显示），因为它们对SPC染色呈阳性(小时)对CCA/CC10不利(我). 与预期一样，相邻支气管上皮CCA/CC10染色阳性(我，插图）。
两者都有克拉斯-4A和克拉斯-4B剪接变异体存在于正常肺中，但克拉斯-4B显然是更丰富的亚型9,10然而，克拉斯基纯合小鼠只表达克拉斯-4B证明对氨基甲酸乙酯诱导的肺部肿瘤形成具有高度抵抗力(). 第页，共10页克拉斯基经检查，8只纯合子小鼠未发生任何表面肺肿瘤。两只小鼠分别产生了1个和2个小肿瘤，但没有一个肿瘤中含有突变克拉斯基等位基因，也不在内源性赫拉斯或Nras公司基因。与我们的发现一致，基因敲除外显子4A的小鼠，因此只能表达克拉斯-4BN-甲基-N-亚硝基脲治疗后肺部肿瘤数量显著减少19.
这个克拉斯基等位基因使小鼠对氨基甲酸乙酯诱导的肺癌发生具有抵抗力，并且在抑制肺癌发生方面不足喀斯特拉丁美洲2动物(一)克拉斯基纯合子小鼠几乎没有肺癌，而克拉斯基杂合子小鼠仍然容易发生肺癌，并且发生的肺癌明显多于重量老鼠。这些肿瘤中的突变仅在内源性喀斯特基因而不是克拉斯基等位基因。(b条)喀斯特拉丁美洲2窝藏老鼠克拉斯基等位基因只产生4B亚型，与携带完整基因的人相比，其患肺癌的几率增加了近3倍喀斯特能够产生4A和4B亚型的基因。这个赫拉斯基等位基因喀斯特拉丁美洲2对肿瘤数量的抑制作用类似于重量老鼠。误差线表示标准偏差，并使用Wilcoxon Mann-Whitney检验进行统计。
杂合小鼠肿瘤克拉斯基SPC等位基因阳性，CCA/CC10等位基因阴性(补充图1).喀斯特33例肿瘤中有24例（73%）发生突变克拉斯基杂合子小鼠，但在所有24例中，突变发生在内源性喀斯特基因（保留两者克拉斯-4A和克拉斯-4B)而不是在克拉斯基等位基因（只表达Kras-4B型) (第页=6.2×10-14，费希尔精确测试）。这些发现与克拉斯基纯合子小鼠，表明致癌突变仅涉及克拉斯-4B不提供肿瘤发生所需的必要优势。因为两者都是克拉斯-4A和克拉斯-4B转录物存在于小鼠肺部，含有完整的克拉s基因9,10，我们的结果表明喀斯特肺癌发生过程中的突变体内主要通过Kras-4A蛋白的活性介导。
Kras-4A和Kras-4B亚型仅在羧基末端不同，导致翻译后修饰的差异8Kras-4A和Hras蛋白经历类似的翻译后修饰，因此定位于膜上类似的微域中，与涉及Kras-4B的蛋白质不同8,20Kras-4A和Hras在这方面的相似性与它们在重量和赫拉斯基小鼠。体外研究还表明，突变体克拉斯-4A和赫拉（Hras）是比突变Kras-4B更强的致癌基因21,22.
这个重量ras肿瘤中包含的等位基因拉斯突变经常被删除，和/或突变等位基因被放大23-25WT-Ras蛋白具有肿瘤抑制功能的可能性由在体外功能分析26和体内基因工程小鼠的遗传学研究6,7这些研究表明，WT-Kras可以有效抑制致癌Kras的活性，从而调节肺部肿瘤的发展6,7。我们发现了克拉斯基杂合小鼠意外地患上了2倍于正常小鼠的肺癌重量小鼠(). 观察结果以及我们的突变分析结果表明克拉斯基等位基因在这种抑制活性中可能效率较低。为了进一步验证这个想法，克拉斯基杂合小鼠用喀斯特拉丁美洲2老鼠13通过自发重组激活喀斯特并且不需要致癌物治疗。测试的基因型包括一种喀斯特拉丁美洲2等位基因和WT克拉基因或aWTKrasKI公司等位基因。喀斯特拉丁美洲2携带克拉斯基等位基因比那些能够表达克拉斯-4A来自WT克拉基因(). 有趣的是赫拉斯基等位基因也比克拉斯基Kras中抑制肿瘤多样性的等位基因拉丁美洲2小鼠，表明它可以替代克拉斯-4A抑制活性体内.同时在体外研究表明，过度表达的WT克拉斯-4B具有抑制作用，我们的集体体内研究结果表明，有效抑制致癌Kras活性需要完整的WT克拉能够产生克拉斯-4A亚型。
对人类肿瘤的研究表明Kras-4B型是更丰富的剪接变体，事实上克拉斯-4A可能会比克拉斯-4B携带肿瘤喀斯特突变27这显然与我们的遗传证据相矛盾，遗传证据表明克拉斯-4A亚型在肺癌发生中的作用。因此，我们调查了克拉斯-4A在正常肺和肺肿瘤中表达。使用Kras-4A特异性抗体，在整个支气管树的Clara细胞亚群中检测到表达，包括在支气管-肺泡交界处(). 纯合子小鼠的类似切片克拉斯基等位基因()或赫拉斯基等位基因（未显示），两者都缺乏克拉斯-4A，均为阴性。Kras-4B抗体产生非特异性信号，即使在赫拉斯基完全缺乏喀斯特表达式（未显示数据）。据报道，支气管-肺泡连接处含有假定的支气管-肺叶干细胞（BASC）28但Kras-4A阳性细胞肯定比BASC丰富。来自重量然而，小鼠几乎没有检测到Kras-4A蛋白的信号()，尽管在RNA水平检测到低水平表达，如之前所述的人类癌症27这些数据，加上上述遗传证据，表明克拉斯-4A是肿瘤发生所必需的，但可能不是维持肿瘤生长所必需的。有可能克拉斯-4A表达可能影响导致腺癌谱系的干细胞命运决定，但还需要进一步的详细研究来阐明两者之间的关系喀斯特亚型表达和肺干细胞。有趣的是Kras-4A型和-第4页以前曾被提议用于胚胎干细胞分化9，但目前还没有关于成人干细胞的数据。
克拉斯4A在正常肺上皮中表达，但在肿瘤中不明显在Clara细胞亚群中观察到Kras-4A染色WT129/Sv型(一)和FVB/编号小鼠(b条)但纯合子中缺失克拉斯基小鼠（仅表达克拉斯-4B) (c（c）). 在整个支气管树中都观察到了这种染色，染色终止于支气管-肺泡管连接处，即BASC的位置。相反，乳头状腺瘤来自129/S号v小鼠对Kras4A没有明显染色(d日)虽然邻近支气管结构显示阳性染色(日期：，插图）。
针对特定Ras翻译后事件，特别是法尼基化的抑制剂在临床试验中尚未成功，其原因尚不清楚。然而，在体外研究和小鼠模型强烈表明，通过操纵致癌Ras蛋白的羧基结构域可以有效抑制其活性8,20Kras-4A，而非之前认为的Kras-4B，作为突变Kras致癌活性和WT-Kras抑制活性的主要介体，为设计和测试新的靶向治疗提供了新的机会。
