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公共科学图书馆一号。2009; 4（3）：e4937。
2009年3月19日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0004937
预防性维修识别码：项目经理2654157
PMID：19295913

肌肉中肌肉抑制素的抑制，而非脂肪组织，可减少脂肪量并提高胰岛素敏感性

郭廷庆,1 威廉·茹,2 塔季扬娜·昌图里亚,2 詹妮弗·波塔斯,1 奥克萨娜·加夫里洛娃,2和亚历山大·麦克弗伦1,*
Jose A.L.Calbet，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

肌生长抑制素（Mstn）是一种分泌生长因子，在骨骼肌和脂肪组织中表达，对骨骼肌质量起负调节作用。Mstn公司−/−小鼠的肌肉质量显著增加，脂肪质量减少，对饮食诱导和遗传性肥胖有抵抗力。确定如何Mstn公司缺失导致肥胖和肥胖抵抗力降低，我们分析了底物利用率和胰岛素敏感性Mstn公司−/−老鼠吃标准的食物。尽管骨骼肌中的脂质氧化减少，Mstn公司−/−小鼠全身脂质氧化速率无变化。相反，Mstn公司−/−通过间接量热法、葡萄糖和胰岛素耐受试验以及高胰岛素-血糖钳夹测定，小鼠的葡萄糖利用率和胰岛素敏感性增加。为了确定这些代谢效应是否主要是由于肌肉或脂肪组织中肌抑制素信号的丢失，我们比较了两个携带显性负激活素IIB受体的转基因小鼠系，该受体在脂肪细胞或骨骼肌中特异表达。我们发现，在喂食标准饮食或高脂肪饮食的小鼠中，脂肪组织中肌肉抑制素信号的抑制对身体成分、体重增加或葡萄糖和胰岛素耐受性没有影响。相反，骨骼肌中肌抑制素信号的抑制，如Mstn公司删除，导致增加瘦体重，减少脂肪体重，改善标准和高脂肪饮食的葡萄糖代谢，并抵抗饮食诱导的肥胖。我们的结果表明Mstn公司−/−小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖摄取增加百万分之一−/−小鼠是骨骼肌代谢变化的间接结果。这些数据表明，通过服用肌抑制素拮抗剂增加肌肉质量可能是治疗肥胖或糖尿病患者的一个有希望的治疗目标。

引言

肌生长抑制素（Mstn）是转化生长因子β（TGFβ）超家族分泌生长因子的成员，是骨骼肌发育和成人体内平衡的重要调节因子。Mstn公司在骨骼肌中强烈表达Mstn公司−/−小鼠的肌肉质量显著增加，表明肌肉抑制素是骨骼肌大小的肌肉特异性负调节因子[1],[2].基因突变百万分之一牛、羊、狗和一个孩子的基因导致骨骼肌质量增加，表明哺乳动物的功能保持[3]肌肉抑制素还调节成年小鼠的肌肉质量：通过注射中和抗体或拮抗剂抑制肌肉抑制酶，会导致健康成年小鼠和肌营养不良小鼠模型的骨骼肌质量增加[4],[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11]因此，肌肉生长抑制素抑制剂作为肌肉消耗性疾病的候选药物引起了极大的兴趣。

肌肉生长抑制素蛋白是作为全长前体合成的，它被切割成氨基末端前肽和作为分子活性形式的羧基末端成熟区。在骨骼肌和循环中，肌肉生长抑制素存在于与其他蛋白质组成不同的非活性复合物中，例如其自身的前肽、卵泡抑制素样3（Fstl3，也称为卵泡抑素相关基因）和潜在的TGFβ结合蛋白[1],[12],[13]这些非活性配合物的活化机制或所有这些配合物是否都能被活化尚不清楚。对于含有前肽的复合物，激活可能需要前肽的蛋白水解，可能需要特定的靶细胞进行蛋白水解[11],[14]一旦激活，肌抑制素对激活素IIB受体（Acvr2b，也称为ActRIIB）具有高亲和力，对Acvr2a（也称为AcrRII和ActRIIA）具有弱亲和力，这两种受体与TGFβ家族成员的其他受体一样，结合多个配体[15].

影响Mstn公司缺失并不局限于骨骼肌。许多骨骼肌Mstn公司−/−老鼠的质量是Mstn公司+/+老鼠[16]相反，脂肪组织的大小大大缩小[17],[18].删除Mstn公司在肥胖和糖尿病的基因小鼠模型中，改善肥胖和葡萄糖代谢[18]、和Mstn公司−/−CD-1基因背景的小鼠对饮食诱导肥胖导致的体重增加具有抵抗力[19]此外，在肌肉中过度表达分泌型肌抑制素前肽拮抗剂的转基因小鼠增加了肌肉质量，并且在喂食高脂肪饮食（HFD）时对体重增加和胰岛素抵抗的发展具有抵抗力，尽管这些小鼠在喂食标准饮食时没有减少肥胖或改善胰岛素敏感性[20].

这个Mstn公司该基因在脂肪组织中低水平表达，并且在循环中发现了肌抑制素蛋白，这表明肌抑制蛋白可能在调节脂肪细胞分化或功能中起直接作用[1]在体外，肌抑制素促进多潜能C3H 10T1/2间充质细胞系的脂肪生成[21],[22]并抑制3T3L1前脂肪细胞的脂肪生成[23],[24]表明肌抑制素在检测和分化过程中的作用是不同的。在体内，Mstn公司脂肪组织的过度表达导致小的未成熟脂肪细胞，增加能量消耗，并对饮食诱导的肥胖产生抵抗力[22]此外Mstn公司,前排3、和Acvr2b公司在肥胖小鼠脂肪细胞中上调，表明肌抑制素信号可能在脂肪细胞对肥胖的反应中起作用[25].

然而，肌肉抑制素是否像调节骨骼肌一样直接调节脂肪组织的总质量尚不清楚。直接注射肌肉生长抑制素蛋白的实验在对脂肪量的影响方面产生了相互矛盾的结果[24],[26].转基因小鼠过度表达Mstn公司特别是在脂肪组织中，尽管脂肪细胞大小减少，但身体成分正常[22]相反，肌肉抑制素的系统水平较高或拮抗剂缺失前排3导致脂肪组织肿块减少[24],[27].

其他一些增加了肌肉质量的转基因小鼠模型，包括一些使用肌肉特异性启动子来驱动导致肌肉肥大的基因表达的转基因小鼠，也降低了肥胖症，这表明脂肪组织大小的变化可以由骨骼肌大小的变化间接引起[28],[29],[30],[31]例如，HFD喂养的小鼠表现出肌肉特异性诱导成分活性Akt1公司肌肉肥大诱导后转基因体重和脂肪组织重量的减轻[29]因此，肌肉生长抑制素在直接调节脂肪组织质量中的作用不能通过分析肌肉极度发达Mstn公司−/−鼠标。

在这里，我们询问是什么代谢变化导致肥胖和肥胖抵抗力下降Mstn公司−/−老鼠。然后我们确定这些变化是由脂肪组织中直接肌抑制素信号的丢失介导的，还是由骨骼肌中肌抑制蛋白信号的丢失引起的代谢改变。

结果

Mstn的改变底物利用率−/−老鼠

肥胖减少的一个可能解释是代谢率增加。之前已经表明Mstn公司−/−小鼠的每只动物的代谢率稍高，而根据总体重标准化的代谢率略低[18].我们重新检查了Mstn公司−/−小鼠喂食标准饮食并将数据标准化为瘦体重。我们的结果证实Mstn公司−/−当标准化为瘦体重或总体重时，小鼠的代谢率较低(表S1). 此外，Mstn公司−/−小鼠的总活动或活动没有变化(表S1). 因此Mstn公司−/−小鼠似乎不是由代谢率或活动增加引起的。

我们还通过间接量热法测定了喂食小鼠的呼吸交换率（RER）。RER是CO体积比的度量2生产到O的体积2由反映碳水化合物相对氧化为脂类的动物食用。fed中的RERMstn公司−/−小鼠显著高于Mstn公司+/+表明突变小鼠增加了碳水化合物利用率，降低了脂质利用率，或两者兼而有之(图1A).

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基板利用率Mstn公司+/+和Mstn公司−/−吃标准食物的老鼠。

（A） 间接量热法测定总呼吸交换率。（B） 每个比目鱼肌氧化的棕榈酸酯量。（C） 比目鱼肌氧化的棕榈酸酯量归一化为比目鱼质量。（D）每只小鼠的油酸氧化速率。（E） 油酸氧化速率归一化为贫质量。n个 = 6–10. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001.

确定是否Mstn公司−/−喂食标准食物的小鼠对脂肪的利用发生了变化，我们测量了整个动物和比目鱼肌的脂肪酸氧化率。每只动物的脂肪酸氧化率在基因型之间没有显著差异(图1D).Mstn公司−/−与对照组相比，小鼠脂肪酸氧化率显著降低Mstn公司+/+然而，正常化至瘦体重后的小鼠(图1E). 这种差异也见于孤立的比目鱼肌。每块肌肉的脂肪酸氧化速率没有差异(图1B)，但在Mstn公司−/−比目鱼肌归一化为肌块(图1C). 这些结果表明Mstn公司−/−小鼠对碳水化合物的能量利用率增加，而每只动物的总脂肪利用率不变。

Mstn中的葡萄糖代谢−/−老鼠

肥胖的减少和碳水化合物利用的增加Mstn公司−/−小鼠表明他们可能改变了葡萄糖代谢。如前所述[18]、喂食和空腹血糖和喂食胰岛素水平Mstn公司−/−尽管胰岛素水平较低，但小鼠与对照组无显著差异(P（P） = 0.067) (表1). 为了检测对外源性葡萄糖的反应，我们对喂食标准食物的小鼠进行了葡萄糖耐量试验（GTT）。Mstn公司−/−与Mstn公司+/+室友(图2A). 为了确定外源性葡萄糖负荷导致的血糖水平降低是否是由于胰岛素分泌增加所致，我们在空腹小鼠注射葡萄糖后0分钟和30分钟测量了血清胰岛素。空腹血糖和血清胰岛素水平在Mstn公司−/−小鼠与Mstn公司+/+葡萄糖注射30分钟后的小鼠表明，GTT的改善是由于对胰岛素的反应增加，而不是胰岛素分泌增加(图2C). 因此，我们进行了胰岛素耐受性试验（ITT），以测量胰岛素给药后的血糖变化。Mstn公司−/−小鼠的血糖水平低于Mstn公司+/+注射胰岛素后的室友表现出胰岛素耐受性改善(图2B).

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Mstn公司−/−小鼠对标准食物和HFD的胰岛素敏感性增加，体重增加减少。

（A） GTT期间的血糖水平Mstn公司+/+和Mstn公司−/−食用标准食物或HFD的小鼠。n个 = 8–16.（B）ITT期间的起始葡萄糖百分比Mstn公司+/+和Mstn公司−/−食用标准食物或HFD的小鼠。n个 = 6-10.（C）用标准食物喂养的禁食小鼠在注射葡萄糖后0分钟和30分钟的血糖（左面板）和胰岛素（右面板）。n个 = 6.（D）体重增加Mstn公司+/+和Mstn公司−/−喂食10周后的小鼠。n个 = 7–16*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001. A和B，P（P）值符号用于同一饮食中不同基因型之间的比较；曲线以下，小鼠吃标准食物；上述曲线表明，小鼠患有HFD。

表1

标准食物和HFD小鼠的血清化学。
饲喂葡萄糖（mg/dl）空腹血糖（mg/dl）胰岛素（pmol/L）抵抗素（ng/ml）瘦素（ng/mL）游离脂肪酸（mM）甘油三酯（mg/dl）
标准Chow
Mstn公司+/+ 142±5102±7544±983.78±0.1424.60±1.320.323±0.04065.3±5.2
Mstn公司−/− 140±987±5103±343.48±0.131.96±0.57‡‡ 0.219±0.02241.1±3.7**
高频驱动
Mstn公司+/+ 143±5126±6† 884±96† 4.79±0.29* 28.34±1.720.300±0.02051.8±5.6
Mstn公司−/− 140±7109±8* 177±50‡‡ 3.72±0.2617.28±3.40† 0.252±0.03440.3±3.3
标准Chow
非tg 140±595±3332±1103.36±0.0810.47±2.200.479±0.06961.7±5.4
肌肉-DN 124±481±460±93.10±0.200.34±0.200.222±0.026†† 35.7±2.5**
高频驱动
非tg 136±4113±10* 676±107* 4.84±0.50† 18.12±3.560.431±0.05244.5±4.5*
肌肉DN 124±589±6182±50†† 3.59±0.142.35±0.99** 0.271±0.03733.6±3.9
标准Chow
非tg。 142±583±3346±913.79±0.1810.06±5.810.378±0.05952.5±8.7
脂肪-DN 146±7104±10136±214.82±0.1216.37±3.920.181±0.017†† 44.4±5.1
高频驱动
非tg 180±12‡ 144±6‡ 652±120* 5.94±0.31‡ 24.42±4.23† 0.286±0.03446.6±9.8
脂肪-DN 167±5* 115±7513±139† 8.10±0.76‡,‡‡ 23.39±4.480.199±0.01940.5±3.3

数据表示为每组5-17的平均值±SEM。

* P（P）<0.05.
† P（P）<0.01.
‡ P（P）与标准食物中相同基因型相比，<0.001。
** P（P）<0.05.
†† P（P）<0.01.
‡‡ P（P）<0.001与相同饮食的对照组相比。

非tg、非转基因对照。

对高脂肪饮食的反应

我们确定这种葡萄糖代谢的改善是否在Mstn公司−/−喂食HFD的老鼠。小鼠被喂食HFD 10周，并与喂食标准食物的同龄鼠进行比较。HFD基因型之间的食物摄入量与体重的关系没有差异（数据未显示）。正如预期，Mstn公司−/−小鼠体重增加明显少于Mstn公司+/+在10周内控制HFD(图2D). 不同于Mstn公司+/+老鼠，Mstn公司−/−在同一时间段内，HFD组小鼠的体重增加量与标准食物组相同。Mstn公司−/−然而，小鼠并不能完全抵抗饮食诱导肥胖的影响。Mstn公司−/−喂食HFD的小鼠脂肪垫质量增加(图S1)和较大的脂肪细胞(图S2)与相比Mstn公司−/−老鼠吃标准的食物。相比之下，单个肌肉的重量不受饮食的影响（数据未显示）。

HFD导致两种基因型的葡萄糖不耐受与其对标准食物的反应相关(图2A). 然而与喂食标准食物的小鼠的结果相似，百万分之一−/−与对照组相比，HFD组小鼠的葡萄糖耐受性更好Mstn公司+/+HFD小鼠(图2A).Mstn公司−/−与对照组相比，小鼠对HFD的胰岛素耐受性更好Mstn公司+/+老鼠(图2B). 喂食和空腹葡萄糖Mstn公司−/−喂食HFD的小鼠与对照组没有显著差异(表1). 血清胰岛素在Mstn公司−/−喂食HFD的小鼠表明，与对照组相比，维持正常血糖所需的胰岛素更少Mstn公司+/+老鼠(表1).

确定与代谢相关的其他循环分子是否受到Mstn公司在两种饮食的小鼠中缺失，我们测量了游离脂肪酸（FFA）、甘油三酯、脂肪因子瘦素和抵抗素的水平。血清甘油三酯显著低于Mstn公司−/−老鼠比在Mstn公司+/+小鼠食用标准食物，而FFA水平正常(表1). 如前所述[18]，血清瘦素在Mstn公司−/−吃标准食物的老鼠比对照组的老鼠多。血清抵抗素水平正常。在HFD中，FFA、甘油三酯、瘦素和抵抗素的水平在Mstn公司+/+和Mstn公司−/−老鼠。肝甘油三酯浓度在Mstn公司−/−两种饮食的小鼠(表S2).

Mstn患者的胰岛素敏感性−/−老鼠

糖尿病患者糖耐量和胰岛素耐受性的改善、血清胰岛素水平的降低和脂肪量的减少Mstn公司−/−小鼠表明，这些小鼠的胰岛素敏感性相对于Mstn公司+/+即使是吃标准食物的老鼠。确定是否百万分之一−/−小鼠的葡萄糖摄取量高于Mstn公司+/+小鼠，我们进行了高胰岛素-血糖钳夹实验。在基础状态下，Mstn公司−/−小鼠的血糖显著降低(图3A)和胰岛素水平（189±52 pmol/L inMstn公司−/−小鼠与361±69pmol/LMstn公司+/+老鼠，P（P） = 0.018). 然而，基因型之间的基础葡萄糖周转率没有显著差异（89±21µmol/kg/min）Mstn公司−/−小鼠vs.103±15µmol/kg/minMstn公司+/+老鼠）。在钳夹过程中，尽管两种菌株的胰岛素水平都升高到～688 pmol/L，但维持正常血糖所需的葡萄糖输注率（GIR）在Mstn公司−/−老鼠比在Mstn公司+/+表明突变小鼠的整体胰岛素敏感性得到改善的小鼠(图3B). 在所使用的钳制条件下，两种基因型的内源性葡萄糖生成均被完全抑制（数据未显示）。全身葡萄糖摄取Mstn公司−/−小鼠显著高于(图3C)骨骼肌葡萄糖摄取的增加几乎是显著的(图3D,P（P） = 0.053). 脂肪组织中的葡萄糖摄取也增加Mstn公司−/−小鼠，尤其是白色脂肪组织(图3E和F). 这一结果可能至少部分是由于脂肪细胞较小，每克脂肪垫的细胞数增加所致(图S2). 这些结果表明Mstn公司−/−即使在标准食物中，小鼠对胰岛素的反应也大大提高了全身葡萄糖摄取。

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Mstn公司−/−小鼠通过高胰岛素-正常血糖钳夹增加了葡萄糖摄取。

（A） 钳夹前和钳夹过程中的血糖浓度。0时注射胰岛素。（B） 夹紧过程中的葡萄糖输注率。（C）全身、（D）骨骼肌、（E）WAT和（F）BAT中的葡萄糖摄取。n个 = 7–8. *P（P）<0.05, ***P（P）<0.001.

夹持期间肌肉和脂肪组织中葡萄糖摄取的增加表明这些组织Mstn公司−/−小鼠可能增强了胰岛素信号传导。我们将胰岛素注射到禁食小鼠中，并通过蛋白质印迹评估胰岛素信号通路的激活(图4). 胰岛素信号通常会增加肌肉中Akt的磷酸化Mstn公司+/+老鼠。在肌肉中Mstn公司−/−小鼠的磷酸化Akt水平高于Mstn公司+/+小鼠对胰岛素的反应。同样，Akt也在更大程度上被激活，以响应WAT和BAT中的胰岛素Mstn公司−/−与对照组小鼠相比，突变骨骼肌和脂肪组织中的体内胰岛素信号增强。

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通过Western blot检测胰岛素刺激的Akt活化。

腓肠肌、WAT和BAT中的体内总Akt和磷酸化AktMstn公司+/+和Mstn公司−/−有或没有胰岛素刺激的小鼠。每条通道都含有来自不同动物的蛋白质。

肌抑制素信号传导的组织特异性抑制

我们发现的新陈代谢变化Mstn公司−/−小鼠可能是由于脂肪组织和骨骼肌中肌抑制素信号的丢失。为了确定脂肪组织中肌肉生长抑制素信号的抑制是否独立于骨骼肌质量的增加而改变脂肪组织质量和葡萄糖代谢，我们建立了一个表达显性阴性（DN）的转基因小鼠系Acvr2b公司脂肪细胞特异性基因。安aP2型（脂肪酸结合蛋白4）启动子片段，以前用于控制分化脂肪细胞中转基因的表达[32]，被插入到Acvr2b型由细胞外配体结合结构域和不含细胞内激酶结构域的跨膜结构域组成的编码序列(图5A). 这种结构用于原核注射。表达脂肪特异性显性阴性转基因小鼠组织RNA的Northern blot分析(脂肪-DN)在白色和棕色脂肪组织中显示出高转基因表达(图5B). 骨骼肌中的转基因表达水平较低，可以通过肌肉细胞中的漏表达或肌肉间脂肪细胞检测到。心脏组织同样具有低转基因表达。在大脑、肝脏、肾脏和睾丸中未检测到信号(图5B和数据未显示）。

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肌肉生长抑制素信号传导的组织特异性抑制。

（A） 用于制作的构造图脂肪-DN转基因小鼠aP2型调控截短基因表达的启动子Acvr2b公司包含细胞外配体结合和跨膜结构域。（B） 表达的Northern blot分析脂肪-DN转基因和Gapdh公司非转基因（−）和转基因（+）小鼠不同组织的负荷控制。（C）的身体成分脂肪-DN(n个 = 10–11）和（D）肌肉-DN(n个 = 5） 雄性小鼠与非转基因同窝小鼠的比较。瘦肉和脂肪质量显示为绝对值。体重增加（E）脂肪-DN(n个 = 9–17）和（F）肌肉-DN(n个 = 9–14）雄性小鼠和窝鼠在10周的饮食后进行对照。GTT期间的血糖水平（G）脂肪-DN(n个 = 7–8）和（H）肌肉-DN(n个 = 9-14）雄性小鼠和同窝出生的对照对标准食物和HFD。ITT期间起始葡萄糖百分比（I）脂肪-DN(n个 = 7–8）和（J）肌肉-DN(n个 = 9–12）雄性小鼠和室友对照标准食物和HFD*P（P）<0.05, **P（P）<0.01***P（P）<0.001. G–J，P（P）值符号用于同一饮食中不同基因型之间的比较；曲线以下，小鼠吃标准食物；上述曲线，HFD小鼠。

我们比较了脂肪-DN骨骼肌特异性表达相同显性阴性受体的小鼠到小鼠(肌肉-DN)肌肉质量的增加与Mstn公司−/−老鼠[33]。我们检测到BAT中转基因的一些表达肌肉-DN老鼠(图S3). 然而，这种表达比转基因表达低得多肌肉-DN骨骼肌或in脂肪-DNBAT公司(图S3和5B）。两者都是脂肪-DN和肌肉-DN老鼠，不像Mstn公司−/−小鼠仍然分泌肌抑制素进入循环（数据未显示）。我们首先测量了每个品系的身体成分，以确定脂肪量是否受到这些转基因的影响。我们没有发现脂肪-DN小鼠与对照组的比较(图5C)尽管转基因小鼠在年龄较大时体重往往较高（数据未显示）。通过组织学检查，脂肪细胞大小在脂肪-DN和非转基因同窝(图S2). 相反，肌肉DN老鼠，就像Mstn公司−/−与非转基因同窝小鼠相比，小鼠的瘦体重增加，脂肪重量减少(图5D). 尽管脂肪组织中有完整的肌抑制素信号，肌肉-DN老鼠的脂肪细胞比同窝的对照鼠小，情况也是如此Mstn公司−/−老鼠(图S2).

这些结果表明百万分之一−/−小鼠是肌肉质量增加或肌肉中myostatin信号丢失的间接影响，而不是脂肪组织中myosstatin信号缺失的直接影响。然而，肌肉生长抑制素和/或Acvr2b在调节脂肪组织大小方面的作用可能仅在导致肥胖增加的条件下才能看到。为了验证这一假设，将两个转基因系的小鼠置于HFD上。10周后，两组之间的体重增加没有差异脂肪-DN标准食物或HFD上的小鼠和非转基因同窝小鼠(图5E). 肝甘油三酯浓度在脂肪-DN并用两种饮食控制小鼠(表S2). 此外，两组之间的葡萄糖或胰岛素耐受性几乎没有差异脂肪-DN并控制两种饮食中的老鼠(图5G和I)证明在这些条件下，脂肪细胞中的肌抑制素抑制不会影响全身葡萄糖代谢。

我们还测量了脂肪因子和其他血清参数。脂肪-DN在标准食物中，小鼠的循环游离脂肪酸水平低于对照小鼠(表1). 血清抵抗素在脂肪-DN在HFD小鼠中显著。这些结果表明，肌肉生长抑制素和/或其他Acvr2b结合配体可能在脂肪细胞功能中发挥作用。所有其他值与对照组小鼠没有显著差异。

与…对比fat-DN小鼠,肌肉-DN由于饮食诱导的肥胖，小鼠对体重增加具有抵抗力，并且HFD组小鼠的体重增加不超过标准食物组(图5F)类似于百万分之一−/−老鼠(图2D).肌肉-DN与两种饮食的对照组相比，小鼠的葡萄糖和胰岛素耐受性也有所改善(图5H和J).肌肉-DN与同窝对照小鼠相比，小鼠的胰岛素和瘦素水平较低，这对HFD有显著影响(表1).肌肉-DN与两种饮食中的对照组小鼠相比，标准食物中的小鼠血清甘油三酯和FFA水平也较低，并且肝甘油三酸酯浓度也较低(表S2). 总体而言，这些结果表明肌肉-DN小鼠的代谢状况与Mstn公司−/−小鼠，特别是骨骼肌（而非脂肪组织）中肌抑制素信号的抑制，导致脂肪组织质量降低，并改善饮食诱导肥胖的后果。

适应Mstn增加的肌肉质量−/−老鼠

接下来我们问是否Mstn公司−/−小鼠对肌肉质量增加的代谢反应与HFD喂养小鼠表达肌肉特异性诱导成分活性的代谢反应相似Akt1公司转基因。首先，我们检查了Mstn公司−/−与对照组小鼠相比，小鼠的糖异生和糖酵解增加。构成活跃Akt1公司小鼠肝脏中与糖异生有关的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶编码酶基因的表达增加(佩普克)和葡萄糖6-磷酸酶(G6酶)以及刺激糖异生的血清胰高血糖素水平升高[29]。我们发现佩普克在肝脏中Mstn公司−/−与标准食物（但非HFD）上的对照窝鼠相比(图6A). 的表达式佩普克在里面Mstn公司+/+HFD小鼠显著高于百万分之一+/+吃标准食物的老鼠(图6A).Mstn公司−/−然而，小鼠的佩普克当喂食相对于标准食物的HFD时(图6A). 在表达G6酶两种饮食中不同基因型之间的肝脏G6酶在Mstn公司−/−标准食物中的小鼠比对照组(图6A). 此外，两组患者的血清胰高血糖素水平没有差异Mstn公司+/+和Mstn公司−/−食用标准食物或HFD的小鼠(图6B)或在胰岛素输注前，在高胰岛素-血糖钳夹实验中测量标准食物的基础内源性葡萄糖生成（89±21µmol/kg/minMstn公司−/−小鼠vs.103±15µmol/kg/minMstn公司+/+老鼠）。构成活跃Akt1公司喂食HFD的转基因小鼠的血清乳酸水平（厌氧糖酵解的最终产物）也增加，但Mstn公司−/−与对照组相比，小鼠的血清乳酸水平没有增加Mstn公司+/+两种饮食中的老鼠(图6C).

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适应增加的肌肉质量。

（A） 肝组织中相对mRNA表达水平佩普克,G6酶,Cpt1号机组,阿卡德姆、和Scd1号机组通过定量RT-PCR测定百万分之一+/+和百万分之一−/−食用标准食物或HFD的小鼠。（B） 血清胰高血糖素、（C）乳酸和（D）β-羟丁酸水平Mstn公司+/+和Mstn公司−/−标准食物和HFD小鼠。n个 = 6–12. *P（P）<0.05, **P（P）<0.01.

接下来，我们寻找肝脏中脂肪酸代谢改变的证据。百万分之一−/−小鼠的肝甘油三酯浓度低于Mstn公司+/+两种饮食的小鼠(表S2). 肝肉碱棕榈酰转移酶-1的表达(Cpt1号机组)，一种脂肪酸进入线粒体所需的酶，和中链酰基辅酶A脱氢酶(阿卡德姆，也称为麦卡德和学院1)，一种代谢中链脂肪酸的酶，在喂食HFD组分活性食物的肝脏中增加Akt1公司老鼠[29]。我们发现Cpt1号机组在里面Mstn公司−/−小鼠与Mstn公司+/+标准食物中的老鼠(P（P） = 0.085），但在表达阿卡德姆两种饮食的基因型之间(P（P） = 标准食物0.321P（P） = HFD上0.161）(图6A). 构成活跃Akt1公司HFD转基因小鼠的血清酮水平也较高，表明肝脏对脂肪酸的氧化作用增强[29]因此，我们测量了血清中β-羟基丁酸酮的浓度Mstn公司+/+和百万分之一−/−用标准食物和HFD喂养的小鼠。β-羟基丁酸水平在Mstn公司−/−两种饮食的小鼠与对照小鼠的比较(图6D). 最后，硬脂酰辅酶A去饱和酶1的表达(Scd1号机组)催化饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的脂肪酸，在具有组成活性的肝脏中减少Akt1公司HFD转基因小鼠反映了脂质合成的减少。我们没有发现Scd1号机组之间Mstn公司+/+和Mstn公司−/−两种饮食中的老鼠(图6A). 这些结果表明，饮食诱导肥胖的反应在Mstn公司−/−小鼠和组成活性Akt1公司老鼠。

讨论

我们的结果表明Mstn公司−/−小鼠在标准食物和高脂肪饮食中都改善了葡萄糖代谢，增加了胰岛素敏感性。我们还表明，葡萄糖代谢和肥胖的变化是骨骼肌改变的结果，而不是脂肪组织中肌抑制素信号抑制的直接作用。尽管脂肪细胞和肌肉表达的转基因分别在肌肉和脂肪组织中显示微弱表达，但小鼠的表型差异很大。因此，泄漏的表达不太可能解释此处呈现的表型。

脂肪组织中过表达myostatin的转基因小鼠[22]，脂肪细胞中Acvr2b功能的抑制不会改变身体成分。综上所述，数据表明高血清肌抑制素小鼠脂肪组织的丢失是由分泌肌抑制蛋白的肿瘤引起的[24]所需的肌抑制素超生理水平。因为aP2型我们用来表达显性负受体的启动子在脂肪生成中表达较晚，很可能抑制早期祖细胞中的肌抑制素信号传导对总脂肪量有影响。这可能不太可能，因为在脂肪特异性Mstn公司转基因小鼠，尽管成熟脂肪细胞分泌的肌抑制素理论上能够向脂肪垫内未分化和未分化的祖细胞发出信号，但未检测到身体成分的变化[22]也有可能，尽管骨骼肌现象副本中的Acvr2b抑制Mstn公司缺失，具有相反而非冗余功能的多个配体结合成熟脂肪细胞中的Acvr2b，减弱了仅使用肌抑制素的抑制作用。

血清游离脂肪酸水平下降脂肪DN小鼠提示肌肉生长抑制素和/或其他Acvr2b结合配体在成熟脂肪细胞中具有一些功能。然而，我们和其他人没有发现体外脂肪细胞对肌抑制素的反应中脂肪分解速率有任何变化[26]，数据未显示]。其他代谢挑战脂肪-DN小鼠可能揭示脂肪细胞中Acvr2b配体的特殊功能。

鉴于我们的研究结果以及IGFI等其他信号通路的改变导致肌肉发达的转基因小鼠的肥胖症减少[28],[29],[30],[31]，我们假设Mstn公司−/−和肌肉DN小鼠很可能是肌肉质量增加的间接结果。肌抑制素信号通路也可能在调节肌肉代谢中起直接作用，从而影响脂肪组织质量，而非其调节肌肉质量的作用。在这方面，一些体外研究表明，肌肉生长抑制素在调节Akt激活中发挥作用。例如，肌抑制素已被证明抑制苯肾上腺素处理的心肌细胞中Akt的激活[34]降低C2C12肌管磷酸化Akt的基础水平[35]。肌生长抑制素还降低了设计用于过度表达的C2C12未分化成肌细胞中Akt激活水平阿克特 [36]相反，肌肉生长抑制素增加了人胎盘提取物中的基础葡萄糖摄取[37]检查肌抑制素缺乏骨骼肌中可能调节新陈代谢的其他信号通路，以确定新陈代谢改善是由于肌肉质量增加、肌抑制蛋白信号缺失还是两者兼而有之，这一点非常重要。

肌肉小鼠脂肪组织重量减少的另一个合理解释是骨骼肌的“底物偷窃”[38]如果骨骼肌增加了葡萄糖摄取，那么作为肝脏甘油三酯合成和随后储存在脂肪细胞中的底物的碳水化合物就会减少。在这方面，诱导成分活性Akt1公司导致HFD小鼠糖酵解纤维快速肥大，肌肉葡萄糖摄取增加，肝脏脂质氧化增加[29].Mstn公司−/−小鼠肌肉中的纤维肥大主要由快速糖酵解纤维组成[16],[39]此外，Mstn公司−/−老鼠的肌肉比身体活动性强得多Akt1公司小鼠具有较多的快速糖酵解纤维8,16，即使在标准食物中，脂肪量也较少[17],[18]。因此，可以预期删除Mstn公司该基因将对肝脏代谢产生更为显著的影响。尽管来自肝脏的基因表达数据Mstn公司−/−喂食标准食物的小鼠显示出脂肪生成减少、糖异生增加和脂质氧化增加的轻微趋势(图6). 然而，这种趋势在喂食HFD的小鼠的肝脏中并没有出现，而在成分活性方面则不同Akt1公司-喂食HFD的表达小鼠[29]此外，与我们的数据一致，Stolz等人[26]未发现大鼠肝脏脂肪酸氧化率有差异Mstn公司−/−小鼠喂食标准食物。

构成性活动之间有几个不同Akt1公司和Mstn公司−/−这可能解释为什么这两个肌肉突变体在喂食HFD时肝脏基因表达和血清值没有相同变化的小鼠模型。大约到断奶年龄，百万分之一−/−老鼠比Mstn公司+/+小鼠肌肉纤维肥大和增生。相反，构成活跃Akt1公司转基因小鼠只有在成年期转基因诱导后，才能因现有纤维肥大而获得肌肉。更微妙的代偿代谢变化可能已经发生在Mstn公司−/−出生前或出生后早期的小鼠。此外，导致肌肉肥大的信号通路改变在每个模型中都是不同的。活性Akt的基本水平在构成活性中较高Akt1公司转基因肌肉[29]，但不在Mstn公司−/−肌肉(图4). 因此，肌肉因子或肌肉代谢物向其他组织发出的信号可能不同。组成活性的类似诱导Akt1公司，出生后抑制小鼠的肌抑制素信号传导可导致纤维肥大，但不会增生或改变纤维成分[8],[9].饮食诱导肥胖小鼠出生后对肌抑制素信号的抑制对于直接比较这两种肌肉肥大模型以确定喂食HFD组分的脂肪组织质量减少是否积极Akt1公司小鼠是由快速糖酵解纤维肥大、Akt信号通路激活增加或两者兼而有之引起的。

然而，在标准食物的小鼠体内注射肌肉生长抑制素中和单克隆抗体，即使单个肌肉的重量增加了20-30%，也不会导致脂肪组织重量减少[9]同样，在极度肥胖的瘦素受体缺乏小鼠中注射相同的单克隆抗体引起的肌肉质量轻度增加不会减少脂肪组织质量[26]。鼠标均为空Mstn公司和瘦素与相比，脂肪组织略有减少瘦素无效小鼠，但这种改善只在幼年动物身上发现[18]这些结果表明，瘦素信号缺失的小鼠可能过于肥胖，以至于在肥胖发生后无法通过肌肉肥大来挽救。用肌生长抑制素拮抗剂治疗因不同遗传或饮食原因导致的肥胖小鼠，将明确哪些特定类型的肥胖可以通过出生后对肌生长抑素的抑制来挽救。此外，通过使用不同剂量的肌抑制素拮抗剂治疗来改变肌肉肥大的程度，将有助于确定是否存在减少肥胖所需的肥大阈值水平。

除了降低肥胖的潜力外，我们认为胰岛素敏感性的提高Mstn公司−/−,肌肉-DN，并且构成活跃Akt1公司小鼠表明，通过增加肌肉质量来改变代谢可能是治疗糖尿病和代谢综合征的一种很有前途的策略。糖尿病患者的骨骼肌降低了胰岛素敏感性[40]最近的临床试验表明，阻力训练可以提高糖尿病患者的胰岛素敏感性[41],[42]与生后肌抑制素抑制或诱导成分活性引起的肌肉表型相似阿克特表达[1],[2],[29]，阻力运动导致纤维尺寸增加[43]然而，一些研究表明，人类的阻力训练也会导致这些出生后肌肉肥大的小鼠模型中所未见的纤维类型的改变，而且小鼠肌肉中含有的快速纤维相对多于人类肌肉[43]然而，通过药物干预（如抑制肌抑制素信号传导）增加肌肉质量可能会改善糖尿病患者的糖代谢，尤其是那些身体状况不佳且无法进行阻力运动的患者。

材料和方法

道德声明

所有动物都严格按照相关国家和/或地方动物福利机构规定的良好动物规范进行处理，所有动物工作都得到NIDDK动物护理和使用委员会的批准。

动物的繁殖和饲养

N6代Mstn公司+/+和Mstn公司−/−老鼠[16]在C57BL/6Ncr中，所有实验的纯合子交配都获得了遗传背景，但饮食实验中N6Mstn公司+/+和Mstn公司−/−小鼠是通过杂合交配获得的。Mstn公司如前所述，通过PCR测定基因型[44]肌肉特异性显性阴性Acvr2b公司先前已经描述过C57BL6/Ncr遗传背景（>N10）的转基因品系C11[33].肌肉-DN通过PCR对小鼠进行基因分型（正向，5′-CCATTTATAGTCTGAGCCGAATGCC-3′; 反向，5′-AATTGAAGTCATAGCAGCACCCC-3′; 500个基点）。用于产生脂肪特异性显性阴性Acvr2b型转基因小鼠，相同的截短小鼠Acvr2b公司将用于产生C11系（氨基酸1–174）的编码序列插入Pst（磅/平方英尺）KS/422-FlagØ10 3heptad-F/拼接的I位置aP2型启动子载体[32]取下Ø10 3heptad-F插件后。将FVB基因背景的创始人回交至C57BL/6Ncr至少5次，以产生用于实验的动物，并通过PCR进行基因分型（正向，5′-gctgctgcgaaggcacaacttctgcaacgag-3′; 反向，5′-CTCTGTAGGTAGTTTGTCCAATTATGTC-3′; 341个基点）。两个转基因品系均以非转基因同窝卵作为对照。老鼠被随意喂食，并保持12小时的光/暗循环。

代谢分析

如前所述，对禁食5小时的清醒小鼠进行高胰岛素-血糖钳夹[45]经过修改。实验使用了预先持续输注[3-三H] 葡萄糖（2.5µCi团注，基础状态下0.05µCi/分钟，钳制期间0.1µCi/min）。以2.5 mU/kg/min的速度注射胰岛素（无需注射）。按照说明进行间接热量测定和活性测量[46]对清醒的动物进行脂质氧化[47]和孤立比目鱼肌[45]如上所述。使用EchoMRI 3-in-1™（Echo医疗系统）测量5-7月龄动物的身体成分。

高脂肪饮食的治疗与分析

9周龄雄性大鼠被喂食标准食物（NIH-31 Open Formula，Zeigler）或4.73 kcal/g HFD，其中45%kcal来自脂肪，35%kcal来源于碳水化合物（D12451，研究饮食）10周。分别在8周和9周后进行GTT和ITT（见下文）。10周后，通过静脉注射80 mg/kg BW戊巴比妥麻醉喂食动物，并通过心脏穿刺采集血清样本。肝脏和脂肪样本快速冷冻在干冰上或放入RNA Later（Ambion）进行蛋白质和RNA分析。

葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验

按说明进行GTT和ITT[20]。使用Elite血糖仪（拜耳）在指定时间点通过尾部出血测量血糖。在注射2 mg/kg BW葡萄糖之前和30分钟之后，从禁食小鼠的尾部取血，以测量葡萄糖激发期间的血清胰岛素。

RNA分离、Northern印迹和定量RT-PCR

根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Invitrogen）从组织中分离出总RNA。对于Northern分析，使用20µg总RNA进行电泳和印迹到GeneScreen Plus膜（Perkin Elmer），并根据制造商的说明与对应于小鼠细胞外区域的探针进行杂交Acvr2b型对于实时定量PCR，用DNA酶消化样品，然后使用Superscript II（Invitrogen）逆转录500ng总RNA。使用指定的Taqman引物（Applied Biosystems）在ABI Prism®7000序列检测系统上通过实时定量PCR对所得cDNA进行定量，并将其归一化为18秒表达式。

血清测量

血清胰岛素、瘦素、抵抗素和胰高血糖素通过放射免疫分析法（Millipore）测定。根据制造商的说明，采用比色法测定血清甘油三酯（Infinity甘油三酸酯试剂盒，Thermo）、游离脂肪酸（半微量检测试剂盒，Roche）、β-羟基丁酸盐（Stanbio实验室）和乳酸（BioVision）。

磷化氢-Akt检测

对于体内Akt检测，小鼠禁食过夜，用戊巴比妥（80 mg/kg体重）麻醉，并腹腔注射10 U/kg BW胰岛素（礼来）。10分钟后取出腓肠肌、性腺WAT和肩胛内BAT，冷冻在干冰乙醇浴中，在含有1 mM原钒酸钠、1 mM氟化钠和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、1%NP-40、0.25%脱氧胆酸钠、150 mM氯化钠和1 mM EDTA）中均质，并在13000 g下离心10分钟以收集上清液。上清液（20µg蛋白质）用于减少SDS PAGE和蛋白质印迹。为了对磷酸化Akt进行免疫印迹分析，将Western blot与1∶2000稀释的兔抗磷Akt-Ser473（Cell Signaling）孵育，然后用1∶5000稀释的HRP-结合山羊抗兔二级抗体（Invitrogen）孵养，并用ECL（Pierce）检测。然后剥离印迹（H2O、 0.2N氢氧化钠，H2O、 分别培养5分钟），用1∶2000稀释的兔抗Akt一级抗体（细胞信号）孵育，然后按上述方法检测总Akt。

肝甘油三酯测量

从Burant等人[48]在用200µL 3 M氢氧化钾在65%乙醇中水解后，使用甘油激酶分析放射测量甘油三酯[49].

组织学

组织被解剖，用10%福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切片，H&E染色。

统计分析

结果表示为平均值±SEM。高胰岛素-高血糖钳夹数据对糖尿病患者葡萄糖输注率和葡萄糖摄取增加的统计分析Mstn公司−/−用单尾学生的t吨测试。使用SPSS软件，以基因型和饮食为因素，通过双因素方差分析对HFD实验数据（GTT和ITT除外）进行统计分析。当受试者之间的影响显著时，使用Bonferroni置信区间调整进行多重比较，通过两两比较进一步分析数据。间接量热法、GTT和ITT数据由双尾学生的t吨测试。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

支持信息

图S1

标准食物或HFD中Mstn+/+和Mstn−/−小鼠的脂肪垫质量。

（0.10 MB PDF格式）

图S2

突变小鼠和标准饮食或高脂肪饮食（HFD）的对照鼠的H&E染色性腺脂肪垫的代表性图像。

（0.99 MB PDF格式）

图S3

非转基因（−）和转基因（+）小鼠肌肉-DN转基因表达和Gapdh负荷控制的Northern blot分析。

（0.12 MB PDF格式）

表S1

间接量热法

（0.05 MB PDF格式）

表S2

标准或HFD的肝脏甘油三酯浓度

（0.11百万PDF）

致谢

我们感谢孔晨（Kong Chen）对数据和手稿进行的有益讨论，感谢萨姆·库什曼（Sam Cushman）进行的有益探讨，感谢马克·拉普兰特（Marc Laplante）对统计分析的帮助，感谢米歇尔·奥利夫（Michelle Olive）、查尔斯·文森（Charles Vinson）和丹·莱恩（Dan LanaP2型向量，Se-Jin Lee用于生成脂肪-DN构建和约翰霍普金斯转基因核心设施，用于原核注射和胚胎移植。

脚注

竞争利益：根据MetaMorphix，Inc.（MMI）与约翰·霍普金斯大学之间的许可协议，a.C.M.有权分享该大学销售肌抑制素所获得的特许权使用费。A.C.M.和大学拥有MMI股票，这受到大学政策的某些限制。这些安排的条款由大学根据其利益冲突政策进行管理。

基金：这项研究得到了NIH（NIDDK）的校内研究计划的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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