在有丝分裂期间组装双极微管纺锤体对于准确的染色体分离至关重要。在动物细胞中，纺锤体的形成是由中心体组织的，中心体是由一对中心粒组成的细胞器，中心粒周围环绕着中心粒物质（PCM），需要在每个细胞分裂周期精确复制一次，与DNA复制相协调以保持基因组的稳定性(1). DNA复制许可是涉及起源识别复合体（ORC）的关键监管步骤，ORC是在每个来源组装前复制复合体（pre-RC）的第一个组件(2). 累积的证据支持ORC亚单位除了授权DNA复制之外的作用(三). 特别是，人类Orc2亚单位定位于中心体，Orc2和Orc3的缺失导致有丝分裂中心体扩增(4).
据报道，DNA许可机制的几个监管机构参与了DNA和中心粒复制的控制(5). 众所周知，细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A以及Cdk2活性都是DNA复制的积极调节因子，也促进中心体复制（或重复）(6–11). DNA复制许可抑制剂Geminin的耗尽导致人类细胞中DNA和中心体的重复(12).
在使用短干扰RNA（siRNA）对在中心体生物学中起作用的人类ORC蛋白进行筛选时，我们发现人类最大的ORC亚基HsOrc1的缺失导致中心体过多(图S1,). 使用抗中心蛋白2（染色中心粒）和抗微管蛋白（染色中心体）抗体，通过双色间接免疫荧光（IF）分析Orc1 siRNA处理的U2OS细胞的中心体缺陷。siRNA转染72小时后，39.77±3.5%转染Orc1-1 siRNA的细胞和25.53±0.3%转染Orc1-2 siRNA细胞显示多个中心体和中心粒，而对照细胞为2.4±1.2%(图S1C). 在Orc1-1处理的细胞中，33.29±2.6%的多个中心体被分离而不是连接，并且在不同的人类细胞系中发生重复(图S1和S2).
Orc1缺失导致中心粒和中心体重复（A）用Orc1-1 siRNA双链处理72小时的人U2OS细胞，用抗中心蛋白2（绿色，a to e）和抗微管蛋白（红色，a to e）抗体对中心粒和中心体进行联合免疫染色。插图放大倍数更高。用DAPI（蓝色）对DNA进行染色，合并的图像显示在a到e中。比例尺，10m。（B）分别通过-微管蛋白（上面板）和中心蛋白2（下面板）免疫染色定量中心体和中心粒数量。诺康唑释放后12、36或60小时收集细胞。误差条表示一个标准误差。
1C，一个中心体；2C（L），两个中心体相连；2C（S），两个中心体分开；>=3C（L），三个或更多中心体相连；>=3C（S），三个或更多中心体分开。1对空气，一对中心粒；2对（L），两个中心粒对相连；2对（S），两个中心粒对分开；2对（Dis.），两个中心粒对无组织脱离；>=2对，两个以上的中心粒对。
为了研究Orc1缺失后中心粒和中心体再复制的动力学，通过诺克唑处理使U2OS细胞在有丝分裂中同步化并释放到下一个周期。在诺康唑释放后12小时、36小时和60小时评估中心柄和中心体数量(,图S3). 当大多数细胞处于G1期或早期S期时，释放后12小时观察到复制的中心粒（2Pirs-Dis.）的无组织脱离(,图S3; 定心2）。随后，显示中心粒重复（>2P）的细胞百分比增加。微管蛋白染色显示，完整的中心体结构在释放后60小时（微管蛋白）观察到。Orc1耗竭对中心粒脱离和再复制的早期影响表明，Orc1可能对这些过程有更直接的影响，而中心体的完全形成是在中心粒再复制之后。在HeLa细胞中观察到Orc1缺失后中心粒重复复制的类似动力学(图S4). 有人提出中心粒啮合阻止重复(13). 然而，在Orc1缺失的细胞中，发现复制的中心粒脱离并经历了重复，这表明Orc1可能通过参与新复制的中心颗粒的中心粒结合过程来阻止重复。
已经报道了中心体扩增的不同机制。中心体断裂可引起明显的多个中心体，中心体分裂发生在DNA损伤后的早期有丝分裂期间(14)或真实的重复。包括DNA含量在内的多参数分析(图S1B)，细胞周期标记(图S5)成熟中心体的中心蛋白染色(图S6和S7)以及每个PCM的中心粒数()都表明Orc1消耗导致真诚地U2OS细胞中的中心粒和中心体重复复制（参见补充文本).
探讨Orc1的过度表达是否会影响羟基脲（HU）存在下延长S期阻滞引起的中心体重复(9,15)，U2OS细胞用YFP-Orc1瞬时转染重量、YFP-Orc2或HU存在时仅携带YFP的向量(;图S8). HU处理后的中心体重复制，但不是正常复制，在YFP-Orc1中被显著抑制重量细胞，而YFP或YFP-Orc2没有任何作用，表明Orc1作为中心体重复的抑制剂发挥作用。
Orc1区中心体重复的过度表达用所示结构（见正文）转染U2OS异步细胞（或不转染，UNT），并用16mM羟基脲（+或HU）处理。HU处理后68小时收集细胞。在YFP或Flag阳性细胞中，通过微管蛋白免疫染色对中心体数量进行评分。（A–C）HU阳性细胞中多个中心体的定量。（D）用抗微管蛋白（红色，a至i）对细胞进行中心体免疫染色；YFP表达在（A）（绿色，A到d）中用抗GFP免疫染色，或在（B）（e，f）中直接可视化；用（C）（g至i）中的反Flag进行免疫染色。DNA用DAPI（蓝色）染色，合并的图像显示在10米的比例尺上。插图放大倍数较高。
YFP-Orc1除了在大约35%的转染细胞中的核定位外，还与中心体相关(图S9A和视频1). 此外，内源性Orc1和其他ORC亚单位与纯化的中心体共分离(图S9B). 瞬时表达的Orc1融合到PACT结构域，这是一个以中心体蛋白为靶点的保守基序(16)导致HU处理的U2OS细胞中心体重复复制受到抑制()这表明Orc1位于中心体时控制着中心体拷贝数。
Orc1的全长和N末端区域（aa 1到500；Orc1重量.Nterm（名词）。旗帜；)后者是ORC组件缺陷(17). 两种Orc1版本在应用HU阻断后表达时也抑制了中心体重复复制，表明这种抑制不是由这些细胞中的G1阻滞引起的(图S10). 因此，Orc1对中心体拷贝数的控制与其DNA复制作用是分开的，不需要组装成ORC，但这种组装可能有助于形成更有效的区块。
同步化U2OS细胞中Orc1的缺失并没有触发DNA损伤检查点通路的早期反应，这些通路已知会影响中心粒和中心体拷贝数(18,19). 未检测到丝氨酸317磷酸化对Chk1的激活，在中心粒扩增启动后，p27和p53通路被很好地激活(,图S11).
一些报告表明，哺乳动物细胞中Cyclin E的过度表达与基因组和中心体异常有关(20,21)中心体重复需要Cdk2活性(7–9,11). 早在Cyclin A阴性细胞中释放同步化Orc1缺失的U2OS细胞后12小时，细胞周期素E水平升高(，另请参见图S5A和S5B)并继续增长。因此，我们假设Orc1对中心粒和中心体重复制的控制涉及细胞周期蛋白E和Cdk2。Cdk2抑制剂roscovitine抑制Orc1缺失细胞的中心粒和中心体重复复制(图S12). 在第二个实验中，Orc1和Cyclin E的同时耗竭阻止了中心粒和中心体的重复，而观察到正常的重复中心粒和中心粒数量(,图S13A). Orc1-1处理后，细胞周期蛋白E siRNA没有改变4C DNA含量的细胞数量(图S13B)这意味着Cyclin E siRNA阻断Orc1-1缺失细胞中心体过度复制并不是由于竞争性G1期阻滞。相反，细胞周期蛋白A siRNA并没有消除Orc1缺失细胞中心体重复().
Orc1缺失导致Cdk2和Cyclin E依赖的中心粒和中心体重复（A） 和（B）用对照（GL3）或Orc1-1 siRNA转染诺卡唑阻断的U2OS细胞，然后释放到下一个周期，并用相同的siRNA双链重新转染。（A）在指定时间点采集的细胞全细胞提取物的免疫印迹。用特异性抗体免疫印迹法评估Orc1、Cyclin E、Cycrin A和-微管蛋白水平。细胞周期蛋白E*，暴露时间更长。（B）诺康唑释放后12小时收集细胞，并用抗细胞周期蛋白E（绿色）和抗细胞周期素A（红色）联合免疫染色。用DAPI（蓝色）对DNA进行染色，合并的图像显示在a和b中。比例尺，30m。（C）通过微管蛋白和中心蛋白2免疫染色分别对转染所示siRNA的异步U2OS细胞的中心体和中心粒数量进行量化。首次转染72小时后对细胞进行分析。误差条代表一个标准误差。
我们测试了细胞周期蛋白水平升高在HU处理的表达YFP的细胞中引起中心体重复的能力。Orc1公司重量(). 细胞周期蛋白E与YFP的共表达。Orc1公司重量阻止了YFP。Orc1公司重量抑制HU诱导的中心体重复，而细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B均无任何作用(). HU处理的细胞共同表达YFP。Orc1公司重量与细胞周期蛋白A一起，显示了一个过度表达YFP的细胞质池。Orc1公司重量除了中心体的核定位和YFP-Orc1的增强外(; Cyclin A存在时，YFP-Orc1阳性中心体的数量比YFP-Orc1单独存在时增加了6倍）。细胞周期蛋白E与YFP的共表达。Orc1公司重量PACT还消除了YFP的能力。Orc1公司重量PACT阻断中心体再复制，而细胞周期蛋白A或细胞周期蛋白B没有作用(). 总之，这些结果表明Orc1可能直接调节细胞的中心粒和中心体拷贝数，其机制涉及细胞周期蛋白E。
细胞周期蛋白E抑制S期阻滞细胞中心体重复制的Orc1抑制在A、B、C和D:U2OS异步细胞中转染所示结构（见正文），并用16mM羟基脲（+HU）处理。未转染细胞分别用HU（UNT+HU和UNT HU）处理或不处理。转染和HU-处理后68小时收集细胞。（A）转染HU受体细胞中多个中心体的定量。用微管蛋白免疫染色法对YFP阳性细胞中心体数量进行评分。误差条代表一个标准误差。（B）用抗微管蛋白（红色，a至d）对转染HU处理的细胞进行中心体免疫染色，直接观察YFP的表达（绿色，a至d）。DNA用DAPI（蓝色）染色，合并图像显示在a到d的比例尺上，10 m。（C）用HEK293细胞全细胞提取物中的抗Flag抗体进行免疫沉淀，瞬时共同表达所示结构，并用所示抗体进行免疫印迹。矢量，全长Orc1重量.Flag（野生型）或全长Orc1A-A公司将Flag（突变体）单独瞬时转染（）；或与T7-Cyclin E、T7-Ccylin A或T7-CYlin右面板：10%的免疫沉淀物。（D）和（E）转染HU受体细胞中多个中心体的定量。用微管蛋白免疫染色法对（D）中Flag阳性细胞的中心体数量进行评分，用微管免疫染色法直接观察（E）中YFP阳性细胞。误差条代表一个标准误差。
如前所示，Orc1与细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A共沉淀(22)，而未观察到与细胞周期蛋白B相关(). 与细胞周期蛋白E复合物的相关性强于与细胞周期素a的相关性；然而，到目前为止，我们还无法找到Orc1与细胞周期蛋白E直接结合的证据。然而，纯化的野生型Orc1以组蛋白H1为底物抑制细胞周期蛋白E-Cdk2和细胞周期蛋白A-Cdk1激酶活性(图S14B).
Orc1‘RXL’突变体（K235A-L237A，Orc1A-A公司)损害与细胞周期蛋白A的直接相互作用，但不影响细胞周期蛋白E的结合(;图S14A)并且不能阻断细胞周期蛋白A相关激酶的活性(图S14B). 尽管观察到一些抑制作用，Orc1A-A公司和Orc1答：。Nterm并没有像野生型Orc1那样有效阻止中心体重复，这表明Orc1-Cyclin A相互作用是控制中心体拷贝数的必要条件(). Orc1公司A-A公司PACT阻断中心体重复复制的程度与Orc1相同重量.协定(). 由于细胞周期蛋白A的功能先前与Orc1的细胞质定位有关(23)，可能是Orc1A-A和Orc1答：。Nterm突变体不能有效地输出到中心体以阻止HU诱导的重复，而Orc1A-A公司PACT直接靶向中心体。因此，当与“RXL”Orc1共表达时，Orc1与中心体结合的Cyclin A刺激显著降低A-A公司突变体。总之，数据表明细胞周期蛋白E和细胞周期蛋白A在Orc1介导的中心体数量控制中发挥作用。
人类细胞中的ORC在细胞周期中动态组装和分解，参与染色体复制和分离的许多方面，包括动粒、着丝粒和异染色质的功能(三). Orc2定位于中心体，但其缺失除了控制DNA复制、着丝粒活性和染色体结构外，还会影响有丝分裂中的中心体拷贝数(4). 相反，Orc1通过直接防止中心粒复制后细胞分裂时中心粒的重复，控制依赖细胞周期蛋白E的中心体拷贝数。在没有Orc1的情况下，重复的中心粒被分离，并发生广泛的细胞周期蛋白E依赖的中心粒重复。注意，在没有Orc1和Cyclin E的情况下，中心粒重复，但它们不重复，这表明这种中心粒重复依赖于CyclinA，这与以前的研究一致(24). 但在缺乏细胞周期蛋白E和Orc1的情况下，中心体重复不会发生。类似地，细胞周期蛋白E（而非细胞周期蛋白A）能抑制中心体再复制的Orc1抑制。
细胞周期蛋白E是中心体复制和重复以及与Orc1共沉淀所必需的(7,11,25–27). 我们还无法检测到细胞周期蛋白E和Orc1之间的直接结合，这表明介体蛋白可能有助于这种结合。介体可能是中心体生物学中涉及的另一种DNA复制蛋白(12,28). 此外，Orc1的缺失增加了细胞中的Cyclin E蛋白水平，这可能有助于中心粒重复。这两种蛋白质都被SCF降解，SCF定位于中心体，也参与中心体复制的控制(29,30).
当细胞中仍存在Cyclin E时（G1晚期和S早期），在中心粒复制后的细胞分裂周期中有一段短时间。在此期间，如果不检查细胞周期蛋白E活性，可能会发生中心粒重复。我们认为Orc1在中心体中的细胞周期蛋白a依赖性定位机制可以阻止细胞周期蛋白E依赖性中心粒在此时间窗内的重复(图S15). 通过这种方式，Orc1在协调DNA复制和中心体拷贝数方面发挥双重作用。
