世界胃肠病杂志。2009年2月14日；15(6): 705–712.
慢性乙醇喂养大鼠肝脏蛋白酶体抑制的表观遗传学研究
Joan Oliva、Jennifer Dedes、Jun Li、Samuel W French、Fawzia Bardag-Gorce、美国加利福尼亚州托伦斯市Harbor-UCLA医疗中心洛杉矶生物医学研究所，邮编90502
作者贡献：Oliva J、Dedes J和Li J分别进行了实时PCR实验、微阵列分析以及动物护理和治疗；法国软件公司提供了资源和设施；Bardag-Gorce F设计了这项研究，进行了细胞核和组蛋白分离、蛋白酶体活性测量、Western blot分析，并撰写了手稿。通信地址：Fawzia Bardag-Gorce，博士，美国加利福尼亚州托伦斯西卡森街1124号Harbor-UCLA医疗中心洛杉矶生物医学研究所，邮编：90502。gro.demoibal@ecrogf公司
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收稿日期：2008年11月7日；2009年1月5日修订；2009年1月12日接受。
版权©2009 WJG出版社和Baishideng。保留所有权利。 摘要
目的：研究乙醇诱导的蛋白酶体抑制作用，以及蛋白酶体抑制在表观遗传机制调控中的作用。
方法：使用Tsukamoto-French模型给大鼠喂食乙醇1个月，并与通过腹腔注射给予蛋白酶体抑制剂PS-341（Bortezomib，Velcade™）的大鼠进行比较。进行微阵列分析和实时PCR，并使用分离的细胞核进行蛋白酶体活性分析和Western blot分析。
结果：慢性乙醇喂养可显著抑制细胞核内的泛素-蛋白酶体途径，导致转录因子、组蛋白修饰酶的转换发生变化，从而影响表观遗传机制。慢性乙醇摄入与组蛋白乙酰化增加有关，假设蛋白酶体蛋白水解酶活性通过控制组蛋白修饰酶的稳定性来调节组蛋白修饰，从而调节染色质结构，使RNA聚合酶容易获得染色质，因此，适当的基因表达。PS-341对蛋白酶体的抑制增加了组蛋白乙酰化，类似于慢性乙醇喂养。此外，蛋白酶体抑制导致肝脏再甲基化反应发生剧烈变化，因为负责S-腺苷甲硫氨酸再生的酶显著减少，尤其是β-同型半胱氨酸甲基转移酶显著减少。这表明，低甲基化与蛋白酶体抑制有关，组蛋白甲基化降低表明了这一点。
结论：蛋白酶体抑制在调节表观遗传机制中的作用及其与酒精性肝病肝损伤的关系，是研究慢性酒精摄入所致肝损伤的一种有前景的方法。
关键词：酒精性肝损伤、甜菜碱、表观遗传机制、同型半胱氨酸甲基转移酶、蛋白酶体抑制、S-腺苷蛋氨酸
简介
越来越多的证据表明，特定组蛋白修饰和修饰酶在全局和组织特异性染色质组织中发挥着重要作用[1]. 组蛋白修饰，如乙酰化和甲基化，在基因表达调控中发挥重要作用，并影响许多基本的生物过程（即细胞周期和细胞增殖）。这些修饰代表了可遗传的表观遗传记忆，它以高保真的方式传递给未来的细胞世代。
组蛋白的乙酰化是调节染色质重塑和基因转录的主要因素。需要复杂的蛋白质组合，如组蛋白乙酰转移酶[HATs，基因激活（乙酰化）]和组蛋白脱乙酰酶（HDAC），来调节表观遗传学机制[2]. 组蛋白和非组蛋白的乙酰化因此成为转录激活的一个中心过程，因为核HAT充当转录共激活剂，已证明其乙酰化不同的转录（即p53、β-连环蛋白、MyoD、SREBP-1）[三].
饮酒影响表观遗传机制，并导致组蛋白赖氨酸乙酰化增加，这与基因表达增加有关，可能导致不受控制的转录[三]. 这些修饰是特定修饰酶活性变化的结果，这些修饰酶在染色质结构和特定基因表达中起重要作用。以前的研究表明，长期摄入乙醇会增加组蛋白修饰酶的稳定性，从而影响组蛋白修饰，从而影响表观遗传机制[4,5]. 然而，对组蛋白修饰酶的寿命控制机制知之甚少。例如，细胞核中蛋白酶体抑制的后果及其对表观遗传机制的影响尚未被研究，并且很少有证据表明蛋白酶体参与调节表观遗传机理的转录因子和组蛋白修饰酶的转换。
我们的假设是，乙醇喂养诱导的蛋白酶体抑制与组蛋白修饰相关，并参与组蛋白修饰酶的调节，如HAT p300。
本研究证明了蛋白酶体活性在表观遗传机制中的作用，表观遗传在慢性乙醇喂养导致的肝损伤中起重要作用。蛋白酶体蛋白水解酶活性通过调节细胞核中组蛋白修饰酶的募集和稳定性来调节组蛋白修饰，因此，调节染色质结构，使RNA聚合酶容易获得染色质并增强基因表达。蛋白酶体的活性也被认为[6]对某些基因的表达至关重要，例如那些负责肝脏转甲基化反应的酶。在本研究中，微阵列分析显示了大量基因的上调和下调，表明蛋白酶体活性对上调以及下调特定基因表达至关重要。蛋白酶体抑制导致参与蛋氨酸代谢的几种酶的基因表达下降，尤其是β-同型半胱氨酸甲基转移酶（BHMT），当蛋白酶体受到抑制时，其表达显著下调[7]. 这些结果表明，DNA和组蛋白甲基化在基因沉默的调节中起着重要作用，可能受到蛋白酶体抑制的影响，因此可能影响许多基本的生物过程。
以前的报告显示，与双喂对照组相比，高浓度乙醇下的基因表达变化很多。1300个基因被改变[8–10]. 同样，对给予蛋白酶体抑制剂PS-341的大鼠肝脏进行的初步微阵列分析显示，基因表达发生了显著变化。因此，出现了一个问题：在这种大量的基因表达变化中，涉及哪种机制？我们认为这种机制在本质上是表观遗传的。
我们认为，基因表达的这些改变是细胞核蛋白酶体活性降低的结果，例如，蛋白酶体活性会增加p300 HAT水平和活性。由于p300负责广泛的基因调控，组蛋白中p300乙酰化的激活将增加并以非特异性和可逆的方式激活大量基因的表达。
蛋白酶体在调节组蛋白甲基化中的作用也很关键，因为当蛋白酶体受到抑制时，一些基因的表达发生了变化。我们之前已经证明蛋白酶体抑制会导致几个基因表达的下调[8]尤其是参与再甲基化途径的基因。这种再甲基化的研究，尤其是再生S-腺苷蛋氨酸（SAMe）的反应机制，即主要的甲基供体，至关重要，因为这是将甲基转移到DNA、组蛋白和非组蛋白的系统通过甲基转移酶，如甘氨酸N-甲基转移酶（GNMT）。
在本研究中，蛋白酶体抑制显著降低了BHMT基因的表达。BHMT是再甲基化途径中的一种必需酶，参与SAMe的回收。甜菜碱，一种胆碱衍生物，临床上用于治疗亚甲基四氢叶酸还原酶缺乏症患者，取得了一些成功[11,12]作为BHMT的底物，并作为肝脏和肾脏中同型半胱氨酸重甲基化的替代甲基供体[13]. 因此，甜菜碱补充剂可以覆盖蛋白酶体抑制诱导的基因表达下调，并纠正由于蛋白酶体抑制导致BHMT活性降低而导致的肝脏转甲基化反应的放松。
材料和方法
动物
雄性Wistar大鼠（Harleco，Hollister，CA，USA），体重250-300 g，使用Tsukamoto-French胃内模型喂食乙醇[14,15]. PS-341在处死前24小时腹腔注射[16,17]. 按照国家科学院所述和国家卫生研究所出版的《动物护理指南》（1996年）对大鼠进行饲养。
细胞核分离
根据Umlauf等人的方法，从细胞核中分离组蛋白[18]. 肝脏组织在异戊烷中冷冻并浸泡在液氮中，在Dounce均质器中进行10次均质。将匀浆在6000×克.重新悬浮颗粒，将其置于冰上10 min，然后在9000×克在蔗糖垫上。小球中含有细胞核。根据Shechter等人的方法，从细胞核中分离组蛋白[19]. 将分离的细胞核与0.2 mol/L H混合2SO公司4，并在4°C的旋转器上培养30分钟。样品在微型离心机中以16000×克，持续10分钟。用33%TCA沉淀上清液中溶解的组蛋白。丙酮洗涤后，将组蛋白溶解在适当的缓冲液中，并进行进一步分析。
蛋白酶体糜蛋白酶样活性测定
如上所述分离细胞核，并使用1μg总蛋白。反应混合物包含50 mmol/L Tris–HCl pH 8、1 mmol/LDTT和40μmol/L Suc-LLVY-AMC底物，用于类糜蛋白酶活性。将混合物在37°C下培养30 min，然后通过添加100μmol/L一氯乙酸和30 mmol/L醋酸钠（pH 4.3）停止反应。通过使用Perkin Elmer LS 30荧光分光光度计测量AMC的释放（λ激发：370nm，λ发射：430nm）来测定荧光。
蛋白质印迹分析
通过SDS-PAGE分离来自分离细胞核或分离组蛋白的蛋白质（50μg），并将其转移到PVDF膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中，在25 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）、192 mmol/L-甘氨酸和20%甲醇中放置1 h。使用抗原的初级抗体对膜进行染色。选用合适种类的抗多克隆和抗单克隆HRP结合抗体作为次级抗体。根据制造商的说明（美国新泽西州皮斯卡塔韦Amersham Pharmacia Biotech），使用鲁米诺对膜进行化学发光检测。
微阵列分析
快速冷冻大鼠肝组织进行微阵列分析。使用UltraspecTM RNA Isolation Systemic（美国德克萨斯州休斯顿Biotecx实验室）提取肝脏总RNA，并使用Rneasy柱（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）进行清洗。使用5微克总RNA制备生物素标记的cRNA。随后将标记和片段化的cRNA与小鼠基因组430 2.0阵列（Affymetrix，Santa Clara，CA，USA）杂交。在洛杉矶生物医学研究所的微阵列核心进行标记、杂交、图像扫描和初始数据分析。然后进行样品制备和装载、杂交、染色和微阵列数据分析[8].
定量RT-PCR
使用Trizol Plus RNA纯化试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）提取肝脏总RNA。使用5μg总RNA和50 ng随机六聚体引物，使用SuperScriptIII RNase H-Reverse Transcriptase（Invitrogen）合成cDNA。PCR引物是使用Primer Express软件（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）设计的。大鼠p300的引物如表所示.
表1
| 300页 | XM_576312号 | 福沃德 | 5GAGGTCACTGTTCGGTTGTTC（通用汽车控制系统） |
| 300页 | XM_576312号 | 反转 | 5TGGTTCGATATGGAAAAAGATTCTGTG |
| BHMT公司 | 挪威_030850 | 福沃德 | 5GGGCAGTGCAATGAAGCT公司 |
| 制动马力 | 挪威_030850 | 反转 | 5ACCAATGCATCCCCTTCGT公司 |
使用SYBR Green JumpStartTM（应用生物系统）进行定量PCR。热循环包括在50°C下初始步骤2分钟，然后在95°C下变性步骤10分钟，然后再在95°C下40个循环15秒和60°C下1分钟。在PCR循环结束时，根据热分解协议确认单个PCR产物。每个数据点重复三次。
感官和反感：在ABI PRISM 7700序列检测系统（Applied Biosystems）上使用SYBR Green JumpStart™Tag ReadyMix（Sigma，St.Louis，MO，USA）实现定量PCR。热循环包括在50°C下初始步骤2分钟，然后在95°C下变性步骤10分钟，然后再在95°C下40个循环15秒和60°C下1分钟。在PCR循环结束时，根据热分解协议确认单个PCR产物。从阈值PCR循环数（Ct）中获得定量值，此时检测到与PCR产物指数增长相关的信号增加。每个样本中的靶mRNA丰度标准化为其18S水平，即ΔCt=Ct靶基因-Ct公司18秒对于每个目标基因，最高的ΔCt被指定为ΔCt最大值.
统计分析
数据来自每组至少三只动物。条形代表平均值±SE。P（P）通过单因素方差分析和Student Newman-Keuls确定值，用于多组比较（Sigma Stat软件，美国加利福尼亚州旧金山）。P（P）≤0.05用于确定显著差异。采用皮尔逊周期动量法，通过线性回归分析进行数据关联。
结果
对喂食乙醇大鼠肝脏样本的微阵列分析表明，由于长期喂食乙醇，大量基因（约1300个）上调或下调[8]. 对服用PS-341（Bortezomib，Velcade®）的大鼠肝脏样本进行的微阵列分析也表明，基因表达发生了显著变化（约2082个基因发生了变化），影响了几种功能途径（图).
蛋白酶体抑制诱导基因表达的Kegg功能途径改变。乙醇摄入和蛋白酶体抑制几乎影响所有途径。
本研究基于以下观察：慢性乙醇喂养引起的蛋白酶体抑制通过改变正常表观遗传调控发生的机制参与了乙醇所致肝损伤的发展。其结果是肝细胞中几种功能通路的基因表达发生了显著变化（图).
数据挖掘和基因特异性途径聚类表明，与乙醇喂养相似，蛋白酶体抑制显著改变了细胞周期、组蛋白修饰酶和再甲基化途径等几个转录因子。因此，通过PS-341抑制蛋白酶体被证明是研究蛋白酶体活性在表观遗传机制中作用的有力工具。
验证基因表达变化受核蛋白酶体活性调节的假设，其中抑制是由慢性乙醇摄入引起的[20]，在长期摄入乙醇的大鼠肝脏和摄入PS-341的大鼠肝的分离细胞核中测定蛋白酶体活性。图结果表明，慢性乙醇喂养导致离体肝细胞核中蛋白酶体糜蛋白酶样活性显著降低。
核蛋白酶体糜蛋白酶样活性。在长期摄入乙醇的大鼠肝脏和摄入PS-341的大鼠肝的分离细胞核中测量20S蛋白酶体糜蛋白酶样活性。
为了进一步研究蛋白酶体活性在调节表观遗传机制中的作用，我们分析了给予PS-341的大鼠肝脏中的组蛋白乙酰化，并与长期摄入乙醇的大鼠的肝脏中的组织蛋白乙酰化进行了比较。图显示乙酰化组蛋白3赖氨酸9（AcH3K9）在喂食乙醇的大鼠肝脏中增加，乙酰化组蛋白3赖氨酸27（AcH3K27）在喂食PS-341的大鼠肝脏中增加（图).
蛋白酶体抑制在组蛋白乙酰化中的作用。A： 蛋白酶体抑制导致组蛋白乙酰化显著增加，如喂食乙醇的大鼠肝细胞核提取物和喂食PS-341（B）的大鼠肝脏细胞核提取物所示。C： 实时PCR（D）显示，长期摄入乙醇的大鼠肝脏细胞核提取物和摄入PS-341的大鼠肝细胞核提取物中p300蛋白水平升高，P（P）= 0.003. （平均值±SE，n个= 3).
乙酰化增加伴随着HAT p300水平的增加，这与长期摄入乙醇的大鼠肝脏中的蛋白酶体显著抑制有关（图)，并在给予PS-341的大鼠肝脏中（图). 乙醇分离核提取物中的P300增加，这证实了之前的报告[4]. 现在已经很好地证明，摄入乙醇会增加组蛋白乙酰化[4,5]与乙酰转移酶CBP/p300增加和Sirt1活性降低相关[三,21]. 在我们的实验条件下，Sirt1基因表达和蛋白质水平上调[22]，或无明显变化[4]. 然而，酶的活性可能会由于NAD+（Sirt1辅因子）的低水平而降低[23].
组蛋白乙酰化水平的增加证实了喂食乙醇的大鼠肝脏中p300活性的增加。此外，PS-341对蛋白酶体的抑制导致组蛋白乙酰化显著增加，这证实了我们的假设，即乙醇诱导的甾酮乙酰化与蛋白酶体抑制有关。长期喂食乙醇时，细胞核中p300的水平增加，也可能是由于细胞核中蛋白酶体蛋白水解速度减慢而积累的。
蛋白酶体活性也被发现参与再甲基化酶基因表达的调节，从而在其被抑制时影响DNA和组蛋白甲基化。微阵列数据挖掘显示，当蛋白酶体被抑制时，再甲基化酶的基因表达下调（图)尤其是BHMT，它重建甲基化途径中的主要元素蛋氨酸（图). 蛋白酶体抑制也下调了Mat1a、Adm（S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶）和Ahcy（S-腺糖同型半胱氨酸水解酶）（图)，表明蛋白酶体活性在蛋氨酸代谢酶系统中的作用。图显示蛋白酶体抑制显著降低了给予PS-341的大鼠肝脏中BHMT的蛋白质水平，并且在较低程度上降低了慢性乙醇喂养的大鼠的BHMT的蛋白水平。这些发现证明了蛋白酶体在调节再甲基化途径中基因表达的作用，以及蛋白酶体活性在细胞再甲基化路径中的作用。Western blot分析显示，服用PS-341的大鼠肝脏中H3K9二甲基化显著降低。H3K9二甲基化减少（图)在乙醇处理的细胞中也观察到[24]这表明蛋白酶体抑制和乙醇喂养的效果相似。这些结果首次表明了蛋白酶体活性在调节细胞再甲基化机制中的作用，并且在使用蛋白酶体抑制剂作为抗肿瘤药物的化疗方案中是一种有前途的方法。
蛋白酶体抑制在再甲基化途径中的作用。A： 蛋白酶体抑制剂PS-341（PS）显著降低BHMT基因表达；B： BHMT表达的实时PCR分析；C： Western blot分析慢性乙醇喂养大鼠和PS-341喂养大鼠肝脏中BHMT水平。注意，服用PS-341的大鼠肝脏中BHMT水平显著降低；D： 蛋白酶体抑制导致组蛋白甲基化降低。
讨论
几项研究表明，泛素蛋白酶体途径的抑制是一种与肝病，尤其是酒精性肝病发展相关的病理生物学机制[25,26]. 我们认为，乙醇诱导的蛋白酶体活性抑制可能在酒精性肝病（ALD）的表观遗传机制和肝损伤相关机制的放松调节中发挥重要作用。
许多细胞信号通路是通过泛素蛋白酶体系统通过关键调节蛋白的选择性蛋白水解来控制的[4,12,27]. 蛋白酶体参与RNA聚合酶II降解[28]，这是控制转录机制的关键步骤，防止乙醇代谢产生氧化应激时可能发生的失控转录，氧化应激会导致DNA损伤[29]. 有报道表明，蛋白酶体功能障碍导致肝细胞凋亡死亡，并对肿瘤坏死因子（TNF）的细胞毒性敏感，导致直接肝损伤[25]. 虽然现在很明显，ALD模型中始终显示细胞质蛋白酶体功能受到抑制，但蛋白酶体功能障碍可能增强肝毒性的方式尚不明确。此外，乙醇喂养对核蛋白酶体活性的影响以及蛋白酶体抑制对表观遗传学机制变化的影响尚未得到证实。最重要的是，我们以前的研究一再表明，长期摄入乙醇会导致细胞内蛋白酶体显著抑制[30,31]. 泛素蛋白酶体途径是专门用于控制蛋白质稳定性的细胞蛋白水解酶途径，了解泛素蛋白质体途径和组蛋白修饰机制之间的联系将确定蛋白酶体蛋白水解度活性、表观遗传机制和有毒物质的影响之间的联系，如乙醇及其代谢产生的终产物，在表观遗传机制的调控中。
正如预测的那样，我们的结果显示，长期摄入乙醇的大鼠肝细胞核提取物中H3K9的乙酰化增加。这种增加与HAT p300的增加有关，这证实了之前的一份报告[4]. 此外，当使用PS-341抑制蛋白酶体活性时，还获得了p300激活和组蛋白乙酰化，这支持蛋白酶体活性在调节细胞核中p300稳定性方面的作用，因此支持蛋白酶体在调节乙酰化机制和基因表达方面的作用。这些结果证实了Marcu等人的发现[32]这表明p300是一种蛋白酶体底物，当蛋白酶体受到抑制时，p300就会积累。
组蛋白的修饰反映了控制基因表达和调节转录的复杂蛋白质机制。因此，认为只有H3K9乙酰化才能解释观察到的基因表达的所有变化是天真的[11]. 所有组蛋白赖氨酸残基修饰之间的平衡说明了基因表达的模式，进一步的组蛋白修饰当然涉及定义特定的基因表达。
组蛋白甲基化在调节基因表达和转录中也起着关键作用。细胞再甲基化途径是甲基化机制中的主要参与者，因为它产生甲基供体SAMe。众所周知，长期摄入乙醇会导致这一途径的严重失调。负责蛋氨酸转化为SAMe的蛋氨酸腺苷转移酶1-alpha在喂食乙醇的大鼠肝脏中降低[33]. 因此，由于SAMe降低，DNA和蛋白质甲基化水平降低[34]，同型半胱氨酸水平升高[35]. SAMe/SAH（S-腺苷同型半胱氨酸）的比率在细胞中至关重要，因为它控制着大多数甲基转移酶的活性。水解甜菜碱的BHMT有助于去除SAH和同型半胱氨酸，随后甲基再生并降低SAH水平。我们的结果表明，当蛋白酶体活性受到抑制时，无论是通过慢性乙醇喂养还是通过蛋白酶体抑制剂治疗，BHMT均显著下调。此外，组蛋白甲基化降低，反映了蛋白酶体活性在调节肝细胞甲基化机制中的作用。蛋白酶体抑制在调节再甲基化途径中的关键酶（如BHMT）的基因表达方面发挥着关键作用。
评论
背景
酒精摄入会引起多种细胞机制的改变，并导致炎症、细胞凋亡和纤维化。这些现象与表观遗传机制的显著变化以及随后的肝细胞记忆有关。泛素蛋白酶体途径是一种重要的细胞途径，由于长期摄入乙醇而发生功能障碍。
研究前沿
虽然蛋白酶体功能抑制在酒精性肝病（ALD）模型中已被广泛报道，但蛋白酶体功能障碍为什么会增强肝毒性尚不明确。此外，没有证据表明乙醇喂养对核蛋白酶体活性的影响以及蛋白酶体抑制在表观遗传机制和DNA修复中的后果。
创新和突破
本研究主要关注蛋白酶体活性在基因表达中的作用以及蛋白酶体抑制在改变表观遗传机制中的作用。用于研究慢性胃管内乙醇给药导致蛋白酶体抑制后果的模型是PS-341抑制蛋白酶体，PS-341是一种二肽硼酸，目前在临床试验中用作抗肿瘤药物，与严重的副作用有关。长期摄入乙醇的大鼠和摄入PS-341的大鼠肝细胞核中的蛋白酶体活性受到抑制。这种抑制导致转录因子、组蛋白修饰酶的转换发生变化，因此影响表观遗传机制。组蛋白乙酰化在两种处理后都增加，基因表达也发生改变。DNA和组蛋白修饰的鉴定对于调节基因表达至关重要，尤其是参与细胞周期和凋亡的基因，以及参与乙醇代谢的基因。此外，蛋白酶体抑制已被证明显著影响肝脏再甲基化途径。尤其是蛋白酶体抑制导致β-同型半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）基因表达降低，该酶参与s-腺苷蛋氨酸（SAMe）的恢复。当蛋白酶体被抑制时，组蛋白甲基化也降低，这表明低甲基化与蛋白酶体活性的降低有关。
应用
目前，通过饮食中补充甲基供体（甜菜碱）来纠正低甲基化现象，以使蛋氨酸/同型半胱氨酸代谢转向蛋氨酸的恢复和SAMe再生。
术语
慢性酒精摄入会导致蛋白酶体抑制，从而导致细胞功能障碍，包括严重酒精中毒患者肝脏中形成Mallory小体的受损蛋白质的积聚、免疫反应缺陷、细胞周期失调和基因表达不正确。错误基因表达的机制是本研究的重点，特别是乙醇诱导的细胞核内蛋白体抑制的后果以及蛋白酶体在调节表观遗传机制中的作用。
同行评审
这项研究的影响是巨大的，因为当与蛋白酶体抑制相关的表观遗传机制被完全确定后，将启动一种治疗方法来抵消乙醇诱导的表观遗传学变化，并防止未来细胞世代的任何细胞记忆。
脚注
支持单位：美国国立卫生研究院/NIAAA 8116号拨款和加州大学洛杉矶分校海港医学中心洛杉矶生物医学研究所513217-00-00号种子拨款
同行评审员：Natalia A Osna，医学博士，肝脏研究室，研究服务（151），VA医疗中心，4101 Woolworth Avenue，Omaha NE 68105，美国
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