移除Hsf4型通过下调γS-晶体蛋白和Bfsp公司表达

高铁四号线在出生后晶状体成熟过程中，对γ-晶体蛋白，特别是γS-晶体蛋白的表达起着关键作用

这个Hsf4型^-/-小鼠晶状体易碎且重量轻得多，但与野生型相比，其大小相似（图​（图2A）。2安培). 90%以上的晶状体蛋白是可溶性的，包括多种晶体蛋白；在哺乳动物中，晶体蛋白是αA和αB；βB1、βB2、βB3、βA3/A1和βA4；γA、γB、γC、γD、γE、γF和γS。在小鼠中，γ-晶体蛋白是成熟晶状体蛋白重量的主要贡献者。在人类中，β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白的比例几乎相等，α-晶体蛋白含量略低。Fujimoto等人检测到，即使在2天大的成年HSF4-null小鼠中，γ（A-F）-晶体蛋白基因的表达也显著降低，但E15.5 HSF4-full胚胎晶状体中γ（A-F-晶体蛋白基因表达水平正常。他们使用染色质IP（ChIP）分析显示HSF4与γF-晶体蛋白基因上游结合，表明HSF4调节γF-结晶蛋白基因的表达[8]. 相反，Min等人在1日龄至28日龄Hsf4-null小鼠中未观察到γ-晶体蛋白基因的显著减少，但γF-crystallin基因除外，与野生型小鼠相比，该基因在10日龄Hsf4-null鼠中的表达降低[9]. 这些相互矛盾的结果可能是由于Hsf4-null小鼠结构的差异、受试小鼠遗传背景的差异以及其他未知因素造成的。然而，Min等人和Fujimoto等人都没有研究另一种重要的晶体蛋白γS-crystallin。在小鼠晶状体成熟过程中，γS-晶体蛋白水平增加了五倍，取代了其他类型的晶体蛋白，占总重量的15%[11]. 这一发现促使我们对基因敲除小鼠和野生型小鼠晶状体中γ-晶体蛋白（尤其是γS-晶体蛋白）的表达进行了检测。我们定量了γ-晶体蛋白的mRNA表达，并分析了其转录活性Hsf4型。我们发现了Hsf4型^-/-与野生型小鼠相比，出生后小鼠所有亚型γ-晶体蛋白的表达水平均降低，8周龄时几乎完全缺乏γ-晶体蛋白质的表达。在野生型小鼠中，γS-crystallin mRNA的水平表明，γS-晶体蛋白在出生时仅占总γ-晶体蛋白的一小部分，并且在8周大时，其水平增加，成为主要的γ-晶体素（图​（图2B）。第2页). HSF4和γS-crystallin基因首先在胚胎晚期表达，并在胚胎发育晚期上调[12,13]. γ（A-F）晶体蛋白基因位于基因簇中，受Sox1和Maf调控，但γS-晶体蛋白基因（Crygs）的调控尚未得到很好的表征[14-17]. 为了进一步评估HSF4在调节γS-crystallin表达中的作用，我们分析了在以下条件下，人晶状体上皮细胞系SRA01/04中γS-crynallin mRNA的表达：hHSF4b型过度表达[18]. γS-crystallin mRNA表达水平在hHSF4b型-与对照组相比，细胞过度表达（图​（图2C）。2摄氏度). 由于γS-晶体蛋白启动子区域包含一个热休克元件（Crygs-HSE），该元件的保守性低于γ（a-F）-晶体蛋白的启动子（图​（图2D），二维)，我们询问了HSF4b是否可以直接与CRYGS公司调节其表达。我们使用ChIP分析来测试这个假设。用抗HSF4b抗体对表达HSF4b-的SRA01/04细胞制备的可溶性染色质进行免疫沉淀，然后使用针对CRYGS启动子区潜在HSF4b.结合位点的引物进行PCR。PCR在表达HSF4b的细胞中产生了预期的带，而在正常山羊IgG对照中没有带（图​（图2E）。第二版). 此外，我们假设HSF4b将绑定CRYGS公司-HSE激活γS-晶体蛋白转录。在此假设下CRYGS公司-构建了含有γS-结晶蛋白基因上游序列的luc载体，并在过表达和不过表达的情况下测定了荧光素酶活性HSF4b型在SRA01/04细胞系中测定。过表达荧光素酶的相对活性HSF4b型在没有过度表达的情况下，比该系统大六倍。主导-消极HSF4b型，它已经失去了的DNA结合域HSF4b型，对荧光素酶活性没有显著影响（图​（图2F）。2楼). 这些结果表明HSF4b型可以通过结合哭泣-HSE。

在单独的窗口中打开

图2

晶状体发育过程中γ-晶体蛋白的表达. (A类)8周龄野生型和Hsf4型击倒老鼠。使用10个野生型镜片和16个淘汰镜片计算平均重量。(B)用定量RT-PCR分析所有γ-晶体蛋白的mRNA水平。新生儿和8周龄小鼠晶状体中mRNA的分离(C类)使用特异性引物实时PCR分析γS-晶体蛋白mRNA水平。从分别用HSF4b、用于HSF4的shRNA或HSF4b加上用于HSF4的shRNA转染的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）中分离总RNA。(D类)七种γ-晶体蛋白的启动子序列比对。与经典热休克因子（HSE）序列相同的序列以红色显示。星号表示热休克因子结合所必需的关键核苷酸。(E类)从转染HSF4b的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）的染色质免疫沉淀富集DNA中扩增CRYGS基因启动子。(F类)通过在人晶状体上皮细胞中转染HSF4a或HSF4b，启动子萤光素酶构建体（CRYGS-luc）的相对萤光素酶活性（SRA01/04）。以六倍体进行转染，以Renilla荧光素酶质粒作为标准化对照。结果显示为具有标准偏差的平均值。经典HSE-luc被用作阳性对照。

γS-crystallin突变体rncat公司是一种隐性白内障小鼠模型，γS-crystallin基因外显子3第489位G到a的过渡点突变[19]. 杂合子rncat公司小鼠的晶状体几乎正常。我们的结果表明HSF4调节γS-晶体蛋白基因的表达（图​（图2）。2). 如果这是真的，缺乏HSF4将减少野生型γS-结晶蛋白的产生，并可能促进白内障的发展。作为参考rncat公司小鼠11天大时出现在核区[19]. 有趣的是，当我们穿越Hsf4型^-/-鼠标和rncat公司老鼠，后代(Hsf4型^-/-/rncat公司/+)晶状体后部发生白内障，而Hsf4型^+/+/rncat公司/+小鼠基本保持清醒（图​（图3A）。3A级). 双零位白内障Hsf4型^-/-/rncat/rncat小鼠发育较早，在7天大时出现，似乎比Hsf4型^+/+/rncat/rncat鼠标（图​（图3A）。3A级). 缺乏Hsf4会加重γS-crystallin突变小鼠rncat的晶状体纤维缺陷[参见附加文件1]. γS-结晶蛋白的mRNA水平Hsf4型^-/-/rncat公司/+和Hsf4型^-/-/rncat公司与对照组相比，小鼠减少了90%以上Hsf4型^+/+和rncat/rncat鼠标（图​（图3B）。3B公司). 在一定程度上，我们的结果进一步表明Hsf4型中断减少哭泣在这种杂交后代中随着白内障的形成而表达。

在单独的窗口中打开

图3

交叉Hsf4型击倒鼠标和rncat公司鼠标.（A）不同基因型小鼠的裂隙灯白内障评估。缺乏Hsf4型在杂合子和纯合子中诱导了更严重的表型rncat公司老鼠。（B）γS-晶体蛋白mRNA水平Hsf公司+/+,rncat/rncat,Hsf4-/-/rncat/rncat、和Hsf4-/-/rncat/+采用半定量RT-PCR对小鼠进行分析。

中间丝基因(Bfsp1/2型)在Hsf4晶状体中下调^-/-鼠标

的一个重要方面Hsf4型^-/-白内障的形成是晶体蛋白调节无法完全解释的晶状体纤维的异常发育。透镜的松散纤维结构Hsf4型敲除小鼠与Bfsp1/2型击倒老鼠。淘汰Bfsp1型或Bfsp2导致纤维结构疏松，纤维之间的连接蛋白较少[20,21]. 因此，我们量化了Bfsp1型和Bfsp2晶状体中的mRNAHsf4型击倒老鼠。出生时Bfsp2mRNA输入Hsf4型基因敲除小鼠是野生型小鼠的一半，而Bfsp1型mRNA与野生型小鼠相似。在8周大时Bfsp1型和Bfsp2晶状体中的mRNAHsf4型基因敲除小鼠与野生型小鼠相比减少了7倍以上Bfsp1型出生时的mRNA（图​（图4A）。4A级). 有人认为129S3系小鼠有一个缺失，导致外显子2从Bfsp2mRNA和显著降低Bfsp2野生型蛋白抗血清无法检测到该菌株中的Bfsp2蛋白[22,23]. 因为我们从Hsf4中获得了预期的PCR产物大小^-/-小鼠使用来自缺失区域的引物Bfsp2基因（图​（图4B），4B类)，至少有一份C57BL/6JBfsp2等位基因Hsf4型^-/-鼠标。尽管Hsf4型^-/-小鼠携带至少一份高表达的C57BL/6J Bfsp2等位基因，Hsf4型^-/-与129S3野生型小鼠相比，小鼠的Bfsp2表达水平低得多。因此，缺乏Hsf4导致Bfsp2表达减少。

在单独的窗口中打开

图4

高铁四号线调节镜片专用珠丝Bfsp1型和Bfsp2. (A类)实时聚合酶链式反应测定Bfsp1型和Bfsp2新生儿和成人野生型和Hsf4型击倒老鼠。（B）PCR分析Bfsp2基因缺失Hsf4型^-/-,Hsf4型^+/-129S3和C57BL/6J小鼠，使用129S3小鼠Bfsp2基因缺失区域的引物。结果表明，在Hsf4型^-/-鼠标。（C）实时PCR分析SRA01/04转染HSF4b、HSF4的shRNA或HSF4b+HSF4 shRNA后Bfsp1和Bfsp2的mRNA水平。(D类)启动子序列比对Bfsp1型和Bfsp2与经典热休克因子（HSE）序列相同的序列以红色显示。星号表示热休克因子结合所必需的关键核苷酸。(E类)从转染HSF4b的人晶状体上皮细胞（SRA01/04）染色质免疫沉淀富集DNA中扩增Bfsp1和Bfsp2基因启动子。(F类)用HSF4a或HSF4b转染人类晶状体上皮细胞（SRA01/04）后，启动子-荧光素酶结构体（Bfsp1-luc或Bfsp2-luc）的相对荧光酶活性。以六倍体进行转染，以Renilla荧光素酶质粒作为标准化对照。结果显示为具有标准偏差的平均值。经典HSE-luc被用作阳性对照。

的过度表达hHSF4b型在SRA01/04细胞中上调Bfsp1型和Bfsp2短发夹RNA（shRNA）靶向可特异性抑制这种上调HSF4b型（图​（图4C）。4摄氏度). 作为两者Bfsp1型和Bfsp2发起人的HSE序列不太保守（图​（图4D），4D（四维）)，我们问是否高铁四号线可以直接结合Bfsp1型和Bfsp2.我们使用ChIP分析并检测了Bfsp1型和Bfsp2表达HSF4b的细胞中的基因（图​（图4E）。第四版). 这一结果表明，HSF4可以与Bfsp1型和Bfsp2基因。然后我们使用双核糖核酸酶系统来评估高铁四号线激活的表达式Bfsp1型和Bfsp2.人类Bfsp1型-luc或Bfsp2-luc载体联合转染或不转染HSF4b型进入SRA01/04单元。的相对萤光素酶活性HSF4b型联合转染Bfsp1型-luc或Bfsp2-luc大约是转染细胞的8倍Bfsp1型-luc或Bfsp2-仅luc（图​（图4F）。4楼). 这些结果表明HSF4可能与Bfsp1型-健康、安全与环境/Bfsp2-HSE序列和调节中间丝蛋白的表达Bfsp1型和Bfsp2.

组织病理学

将小鼠眼睛解剖，用4%多聚甲醛固定至少2周，用石蜡包埋，并切割成6μm厚的切片。这些石蜡包埋切片用苏木精和伊红染色。

扫描电子显微镜

处死小鼠，摘除眼睛，摘除角膜。将剩余的眼眶立即放置在pH 7.4的0.1 M二羧酸钠缓冲液中的2%戊二醛固定液中。组织在4°C下固定2–3天，每天更换固定剂。在0.2 M二甲氨基甲酸钠缓冲液中清洗过夜后，从含有视网膜的眼睛后部取出晶状体。为了暴露纤维和缝合方式，将晶状体囊和表面纤维从晶状体直径周围剥离。收集纤维剥离物和剩余的透镜芯，并对其进行扫描电子显微镜（SEM）处理。样品在1%的OsO水溶液中进行后固定₄在4°C下清洗12小时，并在pH值为7.4的0.1 M二羧酸钠缓冲液中清洗。它们在一系列分级乙醇中脱水，并通过临界点干燥进行处理。在干燥样品的表面沉积一层20 nm厚的金，然后使用日立S-520扫描电子显微镜在20 kV下对其进行检查。

逆转录和实时定量PCR分析

使用Qiagen RNA-easy Mini Kit（Qiangen）分离RNA。将1μg总RNA样品在42°C下逆转录1小时，总体积为20μL（Promega），寡核苷酸（dT）₁₅引物。反应结束时，将混合物在70°C下加热15分钟，使逆转录酶失活。Q-PCR（表​（表1），1)使用主混合物（SYBR Green Supermix；ABI），使用热循环器（MG）将1μL cDNA扩增45个循环。在反应结束时（45个循环后）进行熔融曲线分析，以评估最终PCR产物的质量。阈值周期C（t）值通过将基础荧光固定为0.05单位来计算。每个样品使用五个重复，并计算平均C（t）值。ΔC（t）值计算为C（t）样品-C（t）β-actin。使用胎儿C（t）值作为参考点，通过ΔΔCt方法计算表达的N倍增加或减少。N倍差异确定为：

SDS-PAGE和Western blot分析

在变性还原条件下，使用4%–12%Nupage Bis-Tris凝胶和Mops-SDS流动缓冲液（Invitrogen）对提取物进行电泳。按照方案所述，每条通道使用大约30-50μg蛋白质进行分析。在200 V下电泳约35–60分钟。电泳后，使用Surelock X细胞转移系统（Invitrogen）将蛋白质转移到硝化纤维素膜（Amersham）。用抗体标记印迹的膜高铁四号线或HSF4b型（圣克鲁斯）。这些斑点在TBS/T中清洗，使用ECL试剂盒（Cell Signaling Technology.Inc.）培养，并暴露于X射线胶片（Kodak）。

细胞培养、转染和荧光素酶分析

人晶状体上皮细胞（SRA01/04）在低葡萄糖（1 mg/ml）的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中生长和培养，并在36.5°C、5%CO的气氛中补充15%胎牛血清、庆大霉素（50单位/ml；Fluka）和青霉素-链霉素抗生素混合物（50 U/ml；PAA）₂建立人晶状体上皮细胞原代培养的方法如下所述[18]. 用胰蛋白酶-EDTA溶液（PAA）分离外植体培养的细胞，并通过离心收集。细胞在初始培养基中继代培养，培养温度为36.5°C，湿度为5%CO₂重复该程序进行额外的继代培养。

如上所述培养细胞。使用FuGENE 6试剂（Roche）进行瞬时转染，基本上符合制造商的方案，但有轻微修改。将SRA01/04细胞放置在密度为2×10的常规培养基六孔培养皿中⁶细胞/ml。在100μl无血清、无抗生素的培养基中制备2μg质粒DNA样品，并与6μl分别制备的FuGENE 6试剂在100μl无血清、15%FBS培养基中孵育。30分钟后，将DNA混合物加入细胞中，然后在37°C下孵育24小时。细胞在磷酸盐缓冲盐水中清洗，补充15%FBS的DMEM，并在37°C下培养过夜。在联合转染实验中，使用适当的空载体DNA以确保在所有条件下DNA的浓度相似。在所有转染中，0.1μg雷尼利亚包括荧光素酶质粒（Promega，Madison，WI）以控制转染效率。蛋白质浓度通过Bradford分析测定。萤火虫和雷尼利亚使用双荧光素酶试剂盒定量荧光素酶活性(普罗米加)，根据制造商的说明。这个雷尼利亚荧光素酶值用于转染效率差异的标准化。使用归一化值计算诱导细胞和非诱导细胞中萤火虫荧光素酶活性的比率（诱导因子）。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

从表达HSF4b或对照质粒pCDNA3.1（+）的SRA01/04细胞中制备染色质DNA，并按照制造商的说明使用染色质免疫沉淀分析试剂盒（马萨诸塞州沃尔瑟姆Upstate Biotechnology）进行后续ChIP分析。抗HSF4b抗体沉淀HSF4b/DNA复合物。使用位于CRYGS启动子潜在HSF4结合位点（位置-207至-64）、Bfsp1启动子-308至-61位置或Bfsp2启动子-351至-81位置两侧的引物，通过PCR扩增沉淀DNA。山羊IgG作为阴性对照。引物如表所示​表1。1PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中通过电泳分离。