美国国家科学院院刊。2009年3月3日；106(9): 3414–3419.
CXCL14是成纤维细胞的自分泌生长因子，是前列腺肿瘤生长的多模式刺激因子
,a、，1 ,a、，1 ,b条 ,a、，2 ,一 ,一 ,c（c） ,b条 ,d日 ,一和a、，三
马丁·奥格斯滕
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
克里斯蒂娜·哈格洛夫
一卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，瑞典斯德哥尔摩171 76；
Eleonor Olsson公司
b条隆德大学肿瘤学系，瑞典隆德22185；
克劳迪娅·斯托尔茨
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
Panagiotis Tsagozis（沙戈齐斯）
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
特提亚娜·列夫琴科
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
米切尔·弗雷德里克
c（c）德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科，德克萨斯州休斯顿，邮编77030；和
Å凯·博格
b条隆德大学肿瘤学系，瑞典隆德22185；
帕特里克·米克
d日瑞典乌普萨拉751 85乌普萨拉大学遗传学和病理学系
拉尔斯·埃格瓦德
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
阿恩·斯特曼
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
一瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系，171 76；
b条隆德大学肿瘤学系，瑞典隆德22185；
c（c）德克萨斯大学安德森癌症中心头颈外科，德克萨斯州休斯顿，邮编77030；和
d日瑞典乌普萨拉大学遗传与病理系，751 85
2009年1月5日，瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡学院George Klein通讯。
作者贡献：M.A.、C.H.和A.O.设计的研究；M.A.、C.H.、E.O.、C.S.、P.T.、T.L.和Å.B进行了研究；T.L.、M.J.F.和L.E.提供的试剂/分析工具；M.A.、C.H.、E.O.、C.S.、P.T.、Å.B、P.M.、L.E.和A.O.分析数据；M.A.、C.H.、P.M.和A.O.撰写了论文。
1M.A.和C.H.对这项工作做出了同等贡献。
2现住址：德国埃森大学埃森医院西德癌症中心医学部（癌症研究）。
- 补充资料
支持信息
指南：86A5D453-EA1B-4D50-8D7B-84D15B632BCC
GUID:E505569A-FDBF-444C-ACBA-8154A1D0CC57
摘要
本研究探讨了分泌性成纤维细胞衍生因子在前列腺癌生长中的作用。对匹配的正常组织和肿瘤组织的分析显示，CXCL14在大多数前列腺癌的癌相关成纤维细胞中上调。过度表达CXCL14的成纤维细胞促进前列腺癌异种移植物的生长，并增加肿瘤血管生成和巨噬细胞浸润。机制研究表明，自分泌CXCL14刺激成纤维细胞可刺激成纤维纤维细胞的迁移和ERK依赖性增殖。CXCL14刺激单核细胞迁移也得到证实。此外，产生CXCL14的成纤维细胞（而非重组CXCL14）增强了前列腺癌细胞的体外增殖、迁移和体内血管生成。因此，这些研究确定CXCL14是一种新型的成纤维细胞生长和迁移自分泌刺激因子，具有多种肿瘤刺激活性。更一般地说，我们的研究结果表明，成纤维细胞的自分泌刺激是以前未被认识的趋化因子介导的肿瘤生长刺激机制，并提出了一种新的机制，即癌相关成纤维细胞实现其促肿瘤表型。
关键词：癌相关成纤维细胞、前列腺癌、肿瘤基质
趋化因子是一类刺激趋化性和细胞生长的分泌蛋白。已经鉴定出50多种趋化因子，并将其分为CXC、CC、C和CX3C组(1). 趋化因子通过激活属于G蛋白偶联受体家族的细胞表面受体来发挥其细胞作用。大约20个趋化因子受体已被鉴定(1,2). 许多受体结合多个配体，而其他受体则具有高度特异性，如CXCR4和CXCR6，它们分别只结合CXCL12和CXCL16。对于某些趋化因子，如CXCL14，其受体尚未确定。
最近的研究表明，趋化因子在肿瘤生长的各个方面具有重要作用(2). 趋化因子有助于肿瘤中的白细胞浸润，一些，如IL-8、CXCL1-3和CXCL5，也有直接促血管生成作用(三,4). 关于作用于恶性细胞的趋化因子，最受关注的是CXCL12，它通过CXCR4和CXCR7刺激肿瘤细胞增殖和迁移(5,6). CXCL12还通过骨髓衍生内皮前体细胞的募集促进肿瘤生长(7). 此外，最近发现间充质干细胞衍生的CCL5/RANTES对乳腺癌细胞具有促转移作用(8). 最近，CCL3被认为是一种通过多种机制发挥作用的促转移剂，包括刺激成纤维细胞(9).
在肿瘤微环境中，多种细胞类型被确定为趋化因子产生的来源，包括恶性细胞和炎性白细胞。最近对癌相关成纤维细胞（CAF）表达谱的表征也证实了这种细胞类型是趋化因子的重要产生者(7,10–12). 在乳腺癌中，发现CXCL12和CXCL14在肿瘤基质中上调(10,13). 此外，卵巢癌的CAFs过度表达趋化因子CXCL1/GRO1(11).
在这项研究中，对人类前列腺CAF的表征导致CXCL14被鉴定为一种新的CAF衍生肿瘤刺激因子。
结果
CXCL14在前列腺癌CAF中上调。
通过激光捕获显微切割从4组匹配的正常组织和肿瘤组织中分离出富含成纤维细胞的基质。基于阵列的扩增mRNA比较鉴定了266个在肿瘤基质中上调至少2倍的转录物，其中15个编码分泌蛋白。其中包括趋化因子CXCL14系列在肿瘤基质中上调约40倍。
对8个匹配的正常和肿瘤组织进行qRT-PCR分析，证实基质上调CXCL14系列8例中有6例(A类). 内皮细胞特异性引物qRT-PCR(CD31型)，巨噬细胞(CD163型)和白细胞(CD45型)表明肿瘤基质制剂中这些细胞类型的相对含量增加了1.5到3倍。由于这些变化太小，无法解释CXCL14系列结果表明CXCL14系列发生在前列腺CAF中。
CXCL14在成纤维细胞丰富的前列腺癌基质中上调。(A类)对8例不同患者的正常前列腺（开放条）和前列腺癌组织（填充条）的基质进行显微解剖，并对其表达进行分析CXCL14系列用qRT-PCR分析。(B类)肿瘤基质中CXCL14上调且未改变的成对组织的CXCL14免疫组织化学分析示例(顶部)，上调(中部)，或下调(底部)在上皮细胞中表达。（比例尺，100μm）
对27对匹配的前列腺癌和正常前列腺进行免疫组织化学分析，以进一步比较CXCL14在正常和肿瘤间质中的表达。这些分析表明(P（P）<0.05）在15/27（56%）癌症样本中CXCL14的基质表达增加(B类). 在正常组织和癌组织的上皮细胞室中也观察到可变的CXCL14表达。用抗CXCL14抗体和PDGFβ受体作为成纤维细胞标记物的双重免疫荧光染色证实，人前列腺癌成纤维细胞产生CXCL14(图S1). 基质和上皮CXCL14状态与Gleason分级无显著相关性。
这些分析表明，CAF中CXCL14的上调是人类前列腺癌的一个常见特征。
NIH-CXCL14细胞在不影响上皮基质比率的情况下促进肿瘤生长和增殖。
前列腺癌CAF或NIH 3T3成纤维细胞联合注射可促进人前列腺癌LNCaP细胞的皮下肿瘤生长(14). 因此，该肿瘤模型用于研究CXCL14在CAF中上调的功能意义。用控制载体（NIH-ctr）或编码人类CXCL14（NIH-CXCL14）的载体感染细胞，产生两株NIH 3T3细胞系。通过qRT-PCR和CXCL14特异性ELISA证实CXCL14在转染细胞中过度表达(图S2).
LNCaP细胞和NIH-CXCL14成纤维细胞的混合物形成的肿瘤比LNCaP/NIH-ctr肿瘤出现得早，生长速度快( A类和B类). 在整个实验中，单独注射LNCaP细胞并不能产生可检测的肿瘤。在注射后的前30天内，仅注射NIH-ctr或NIH-CXCL14细胞不会导致肿瘤形成。
NIH-CXCL14细胞促进前列腺癌异种移植物的生长。(A类)在皮下注射到SCID小鼠中后，随着时间的推移，跟踪注射的LNCaP细胞（填充三角形）或LNCaP细胞与NIH ctr（开放正方形）或NIH-CXCL14细胞（填充正方形）一起的肿瘤生长。(#n个= 6;§ n个=剩余5只动物）(B类)计算第28天和第49天的肿瘤发病率，即LNCaP/NIH-CXCL14和LNCaP/NIH-ctr组第一只动物被杀的时间。收集两组肿瘤并分析其细胞密度(C类)，细胞增殖(D类)以及丰富的血管(E类)和巨噬细胞(G公司)如图所示，使用H&E染色或免疫组化。Spearman相关分析用于分析肿瘤内CXCL14系列表达和CD31型(F类)或CSF1R公司(H（H）)表达式。中的误差线B–D类表示SEM。（比例尺，100μm）*，P（P）<0.05，未成对t吨测试。
两种肿瘤类型之间的细胞密度无显著差异(C类). 用上皮标记物进行qRT-PCR分析细胞角蛋白18在肿瘤上皮细胞的相对含量方面没有任何差异。成纤维细胞标记物分析嘌呤霉素（存在于NIH-ctr和NIH-CXCL14细胞的pBABE载体中）和波形蛋白尽管在LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤中观察到成纤维细胞含量增加的趋势，但表明没有显著差异(图S3). 与对照肿瘤相比，LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤显示出显著更高的增殖率(D类). 由于在上皮瘤比率上没有观察到重大差异，因此可以得出结论，这两个腔室的增殖都在增加。
这些分析表明NIH-CXCL14细胞的致瘤前效应，包括肿瘤中细胞增殖的增加，发生在上皮瘤比率没有重大改变的情况下。
LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤的特征是巨噬细胞浸润增加和血管生成增加。
根据肿瘤切片CD31染色对两种肿瘤类型的血管生成进行分析，发现NIH-CXCL14肿瘤中的血管含量增加(E类). qRT-PCR分析表明CD31型-阳性细胞伴α减少座椅模块组件LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤中的水平(图S3). 此外，一个非常重要的关联(P（P）=0.0039）CXCL14系列和CD31型级别(F类). 荧光标记CD31和αSMA抗体双重染色的切片分析显示LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤血管系统周细胞的相对含量降低(图S4).
使用CD68抗体进行的巨噬细胞染色显示了局部富集的染色模式，这在LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤中更常见(G公司). 用另一种巨噬细胞标记物进行qRT-PCR分析，CSF-1R型，证实LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤中巨噬细胞含量较高(图S3). 此外CXCL14系列和CSF1R公司mRNA表现出高度显著的相关性(P（P）= 0.0008) (H（H）). 然而，NK-cell含量分析(NK1.1标准)没有显示这两种肿瘤类型之间的差异(图S3).
综上所述，数据显示LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤的特点是未成熟血管和巨噬细胞密度较高。
CXCL14刺激成纤维细胞的生长和迁移。
为了从机理上了解观察到的肿瘤表型，进行了几项体外研究。当在1%FCS中培养时，NIH-CXCL14细胞的生长速度明显快于对照细胞(A类). BrdU掺入的测量证实了低血清条件下NIH-CXCL14中DNA合成增加(图S5). 重要的是，NIH-CXCL14和NIH-ctr细胞都不能在软琼脂中形成菌落。
CXCL14促进成纤维细胞的体外生长和迁移。(A类)通过细胞计数测定NIH-ctr（开方格）和NIH-CXCL14细胞（填充方格）在1%FCS培养基中的生长。(B类)CXCL14诱导NIH-ctr细胞ERK1/2磷酸化的Western blot分析。(C类)NIH-ctr和NIH-CXCL14细胞在MEK抑制剂UO126存在的低血清中培养后，通过结晶紫染色测定细胞密度。(D类)在迁移研究中，将成纤维细胞接种在2室室的上部室中，并允许其迁移20小时，然后收集下部室中迁移的细胞，并使用血细胞仪进行计数。误差条指示SEM.*，P（P）<0.05，未成对t吨测试(A类)，方差分析(C类)、和配对t吨测试(D类).
趋化因子信号传导涉及例如MAPKs的磷酸化[综述于Thelen(15)]. 与此一致，CXCL14诱导NIH-ctr细胞ERK1/2磷酸化的时间和浓度依赖性增加(B类和第5章). 也检测到AKT的可检测但较弱的磷酸化。为了研究ERK和AKT信号对NIH-CXCL14细胞在降低血清条件下生长的重要性，在MEK抑制剂UO126或PI3K抑制剂Wortmanin存在下进行了生长实验。UO126（而非沃特曼）显著降低了NIH-CXCL14细胞1%FCS的生长(C类和第5章).
接下来，在2室迁移室中研究表达CXCL14的成纤维细胞的固有迁移能力。该分析显示，与对照细胞相比，NIH-CXCL14细胞的固有迁移能力增加(D类).
最后，分析了外源性重组CXCL14对永生化人成纤维细胞生长和迁移的影响。在两种试验中均观察到CXCL14刺激反应(图S6).
这些实验表明，小鼠成纤维细胞的自分泌CXCL14刺激与强烈的迁移和ERK依赖性增殖反应有关。此外，人类成纤维细胞也对外源性添加的CXCL14产生反应。总之，这些数据确定了以前未被认识到的CXCL14对成纤维细胞的生长和迁移刺激作用。
NIH-CXCL14细胞刺激LNCaP细胞的体外迁移和增殖。
接下来，研究了NIH-CXCL14细胞是否能以旁分泌的方式促进LNCaP细胞的生长和迁移。
在体外共培养试验中，NIH-CXCL14细胞比对照细胞更能刺激LNCaP细胞的生长(A类). 在与前列腺癌PC-3细胞和乳腺癌MCF-7细胞共培养时，也观察到CXCL14产生的成纤维细胞的这种促生长作用(图S7). 此外，NIH-CXCL14衍生培养基比对照培养基更能刺激LNCaP迁移(B类). 相反，重组CXCL14没有刺激LNCaP的迁移，这表明这种作用是通过CXCL14在成纤维细胞中诱导的其他因素产生的(B类). 重组CXCL14未能在LNCaP细胞中诱导ERK磷酸化，这一发现进一步证实了这一观点(C类)或PC3细胞。然而，先前发现对CXCL14有反应的MCF-7乳腺癌细胞(10)，在CXCL14刺激后表现出强大的ERK磷酸化(C类).
NIH-CXCL14细胞的条件培养基，而非重组CXCL14，在体外促进LNCaP的增殖和迁移。(A类)用罗丹尼染色法在共培养10天后测定NIH-ctr或NIH-CXCL14成纤维细胞对LNCaP细胞生长的影响。(B类)允许LNCaP细胞向对照培养基迁移，或补充100 ng/mL CXCL14或NIH-ctr或NIH-CXCL14细胞调节培养基20 h。使用血细胞仪测定迁移细胞的数量。(C类)通过总细胞裂解物的免疫印迹分析100 ng/mL CXCL14对LNCaP细胞和MCF细胞ERK1/2磷酸化的影响。误差条表示SEM。*，P（P）<0.05，成对t吨测试(A类)和方差分析(B类).
总之，这些实验表明NIH-CXCL14细胞对LNCaP细胞产生旁分泌刺激作用，这些作用是由CXCL14以外的因素介导的。
CXCL14刺激单核细胞迁移，NIH-CXCL14细胞在体内模拟血管生成的能力增强。
与之前的研究一致，CD14+单核细胞对CXCL14表现出迁移反应。NIH-CXCL14细胞的条件培养基在刺激CD14迁移方面也比对照细胞的培养基更有效+单元格(A类). 当分析仅限于CD14时，这种差异更加显著+/CD16型+单核细胞亚群，表示对各种单核细胞子集的不同影响(图S8).
NIH-CXCL14细胞促进体外单核细胞迁移和体内血管生成。(A类)允许新分离的单核细胞向10 ng/mL CXCL14迁移，或向NIH-ctr或NIH-CXCL14成纤维细胞衍生的条件培养基迁移4 h。通过CD14的FACS分析确定下层室中迁移的单核细胞核数量+细胞。(B类)通过监测Matrigel塞中的血管生长情况，分析其对体内血管生成的影响，该塞单独与1%FCS培养基混合，或与含有100 ng/mL CXCL14、NIH-ctr或NIH-CXCL14细胞的培养基混合。误差条表示SEM。*，P（P）方差分析表明，<0.05。
为了分析这两种成纤维细胞类型的血管生成能力，将补充了这两种细胞类型的Matrigel-plugs植入皮下，并测定血管生长中的情况。含有NIH-CXCL14细胞的Matrigel-plugs显示较高的血管密度(B类). NIH-CXCL14细胞的条件培养基也诱导了比对照培养基更强的促血管生成作用(图S9). 重要的是，qRT-PCR分析显示FGF-2型在较小程度上，血管内皮生长因子-A, -B类、和-C类在NIH-CXCL14细胞中(图S10)提出了这种现象的可能机制。与之前的研究一致(16)，重组CXCL14未能刺激血管生成(B类).
因此，单核细胞迁移的体外分析表明，NIH-CXCL14细胞的肿瘤促进作用涉及由CXCL14直接介导的巨噬细胞向肿瘤中的募集增加。此外，Matrigel-plug分析表明，成纤维细胞中CXCL14的表达可诱导包括FGF-2在内的刺激血管生成的因子。
讨论
基于人类前列腺CAF的特征，本研究确定成纤维细胞衍生的CXCL14是一种新的潜在前列腺癌刺激蛋白(和). 还揭示了成纤维细胞衍生CXCL14促进肿瘤生长的多种机制。这些包括CXCL14对成纤维细胞生长和迁移的直接刺激(和图S5和S6系列)以及单核细胞的吸引力(和图S8). 此外，CXCL14产生的成纤维细胞对恶性细胞和血管生成具有更强的旁分泌作用，这种作用由CXCL14本身以外的其他因素介导(和和图S7和第9部分).
CXCL14，也称为BRAK、MIP-2γ、BMAC或KS1，是CXC趋化因子家族的孤儿，属于缺乏氨基末端ELR基序的亚家族。许多研究表明，NK细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞具有广泛的趋化活性(16–19). 然而，发现CXCL14在体内炎症条件下对树突状细胞和巨噬细胞功能是不必要的(20). CXCL14也在胰岛素信号传导中起作用(21,22). 间充质细胞活化与CXCL14上调之间的一般联系，与目前和早期的研究结果一致，也得到活化星状细胞中CXCL14下调的发现的支持(23).
CXCL14在肿瘤生物学中的功能作用已在之前的几份报告中进行了讨论。这些报告声称CXCL14具有抗肿瘤和抗血管生成作用，这显然与我们目前的研究相矛盾(16,24,25). 然而，其中2项研究报告了恶性LAPC4前列腺癌细胞或HSC-3鳞癌细胞过度表达后对肿瘤形成的影响(24,25). 本研究中描述的CXCL14效应主要来源于CXCL14激活的成纤维细胞。因此，LAPC4或HSC-3肿瘤模型中缺乏原癌效应可能是由这些肿瘤模型的成纤维细胞依赖性引起的。关于对血管生成的影响，我们的研究表明NIH-CXCL14细胞的促血管生成作用是通过CXCL14在成纤维细胞中诱导的因子实现的()而在分析纯化的重组CXCL14的作用的实验中观察到了抗血管生成作用(16). 然而，本研究和先前出版物的综合结果要求继续分析CXCL14在其他肿瘤模型中可能的肿瘤类型和阶段特异性影响。在这种情况下，还应该注意到，一些肿瘤的恶性细胞可能直接对CXCL14产生反应，如MCF7细胞的CXCL14反应性所示().
本研究结果提出了一系列继续进行力学研究的课题。CXCL14受体的鉴定是非常必要的。分析具有已知靶点特征的GPCR抑制剂的作用可能有助于受体识别。还应探讨巨噬细胞募集增加在多大程度上促进LNCaP/NIH-CXCL14肿瘤的生长和血管生成。确定导致CAF中CXCL14上调的因素是另一个需要进一步分析的相关问题。
作为一种分泌蛋白，CXCL14具有很高的“药物敏感性”，并且有可能产生中和抗体、适配体和可能的小分子抑制剂。基于CXCL14生理功能的有限信息，很难预测CXCL14拮抗剂可能的不良反应。然而，CXCL14基因敲除小鼠的正常发育和生存能力(20)在CXCL14靶向化合物的潜在用途方面很有希望。
本研究的发现是通过一个综合程序实现的，该程序允许识别新的CAF衍生的潜在药物靶点。该程序包括人体CAF的表达谱分析，然后进行体内和体外机械研究。我们希望这项研究的发现将鼓励在其他肿瘤类型中继续使用这种策略。
更广义地说，我们的研究结果表明，成纤维细胞的自分泌刺激是以前未被认识的趋化因子介导的肿瘤生长刺激机制，从而确定了CAF实现其原癌表型的新机制。据预测，未来对趋化因子在癌症中的作用和CAF特性的分析将继续揭示新的潜在治疗机会。
方法
人体组织样本和显微解剖。
组织样本的收集和使用符合乌普萨拉大学医院病理学系和卡罗林斯卡研究所肿瘤病理学系的伦理规则，并符合瑞典生物库立法。有关显微解剖的详细信息，请参见SI方法.
RNA分离、cDNA合成和qRT-PCR分析。
分别使用PicoPure RNA分离试剂盒（Arcturus Engineering）、TRIzol（Invitrogen）和GeneElute（Sigma–Aldrich）从显微切割材料、异种移植瘤和细胞系中分离RNA。根据制造商的说明进行cDNA合成和qRT-PCR分析（参见SI方法). 有关引物序列，请参见表S1.
组织学分析。
在冷冻组织切片上进行CD31、CD68和CXCL14的免疫组织化学分析。石蜡包埋组织进行PCNA和苏木精染色。有关更多详细信息，请参阅SI方法.
NIH-CXCL14细胞的产生。
详细信息见SI方法简单地说，将人CXCL14 cDNA克隆到pBabe嘌呤霉素载体中，用于NIH 3T3细胞的病毒转染。通过qRT-PCR和CXCL14特异性ELISA（R&D系统）确认CXCL14的表达。
异种移植实验。
动物实验是根据国家指南进行的，并得到斯德哥尔摩北方动物实验伦理委员会的批准。异种移植瘤的生成如参考文献所述。14和中SI方法.
体外生长和迁移试验。
NIH 3T3和LNCaP细胞的生长速度。
总计1×104成纤维细胞和2×104LNCaP细胞接种在12孔板中（Sarstedt）。成纤维细胞在添加1%FCS的DMEM中生长，而LNCaP细胞在NIH-ctr或NIH-CXCL14细胞的条件培养基中培养。用Buerker室测定细胞数。
LNCaP和NIH 3T3细胞的共培养。
总计1×104将NIH-ctr或NIH-CXCL14细胞接种于96周培养板（Sarstedt）中。第二天，用2×104 LNCaP细胞替换培养基，用1%FCS重新悬浮在DMEM中。使用罗丹尼染料（Sigma–Aldrich）测定10天后LNCaP细胞的数量，如参考文献所述。26.
MEK抑制剂存在下成纤维细胞的生长。
共4×10三将成纤维细胞接种到96周板中，并用二甲基亚砜或不同浓度的UO126（Promega）处理。如参考文献所述，用结晶紫测定4天后的细胞密度。27.
LNCaP和NIH 3T3细胞的迁移。
4×10迁移分析5成纤维细胞和LNCaP细胞在含有8-μm孔径插入物的Transwell室中进行（Costar，Corning）。
单核细胞迁移。
通过Ficoll梯度（Ficoll Paque Plus，GE Healthcare）和CD14微珠（Miltenyi Biotec）离心分离单核细胞。在96周的趋化室（Neuroprobe）中，检测它们通过聚碳酸酯5μm孔过滤器向条件培养基或添加不同浓度重组CXCL14的培养基的迁移。迁移的CD14数量+用流式细胞仪（FACS）计数4h后的细胞数。
所有体外生长和迁移实验至少进行了3次。
CXCL-14诱导ERK磷酸化的分析。
用CXCL14刺激缺血细胞后，制备细胞裂解物并进行免疫印迹。更多详细信息见SI方法.
基质分析。
总计2.4×104将NIH-ctr细胞或NIH-CXCL14细胞重新悬浮在100μL培养基和200μL基质凝胶（BD Biosciences）中。还制备了仅添加100 ng/mL CXCL14的培养基或培养基的基质。将悬浮液注射到小鼠体内（300μL s.c。，n个= 6). 1周后分离塞子，放置在4%PFA中过夜，然后保存在30%蔗糖中，然后包埋在Tissue-Tec（樱花）和切片中（Microm HM 560 Cryo-Star Cryostat）。CD31免疫组织化学检测如SI方法.
致谢。
A.Ø。获得了瑞典癌症协会的资助，以及瑞典研究委员会向STARGET提供的Linné-资助。Å.B.和E.O.由克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会通过隆德大学的SWEGENE项目提供支持。我们感谢卡罗林斯卡研究所MTC动物设施的工作人员提供的专家技术援助。R.A.Weinberg和W.C.Hahn很好地提供了永生人成纤维细胞。Phoenix细胞是L.Holmgren赠送的，pBABE载体由F.D.Böhmer好心提供。L.Holmgren和A.实验室成员。提供了富有成效和支持性的评论。
工具书类
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