介绍
近年来，代谢改变与癌症之间的联系越来越受到关注[1]在有氧条件下，正常细胞利用氧化磷酸化作为ATP生成的主要来源。与正常细胞形成鲜明对比的是，大多数癌细胞的一个共同特征是主要利用糖酵解产生ATP[2]——[6].糖酵解表型的出现和/或线粒体功能受损[7]——[9]据报道，in-carcer细胞来源于多种机制，包括对缺氧的适应、癌基因的激活或抗癌基因的丢失，以及葡萄糖缺乏的后果在一些癌细胞和组织中得到了广泛的描述[10]癌症细胞的另一种代谢适应机制早已确立，即它们倾向于增加谷氨酰胺的摄入，尽管谷氨酰胺缺乏对癌细胞的影响仍有争议，主要是因为谷氨酰胺参与了多种细胞过程。事实上，谷氨酰胺是蛋白质、RNA和DNA生物合成所需的代谢前体，通过谷氨酰胺水解参与能量生产和细胞氧化还原平衡，尤其是谷胱甘肽合成[11]因此，不同的作者指定谷氨酰胺通过调节信号转导途径和细胞周期机制在几个细胞系（如成纤维细胞、肠细胞和淋巴细胞）的生长和存活中发挥作用；通过调节应激反应能力抑制细胞凋亡；维持代谢过程，如TCA循环、脂肪酸合成，控制必需中间体的供应。因此，了解谷氨酰胺缺乏的影响对于更全面地了解肿瘤代谢的变化是必要的[11].
NIH3T3细胞是一种基因定义明确的永生化细胞系，长期以来一直是研究细胞转化的模型亲本细胞系[12],[13]像其他一些癌细胞一样，K-ras公司转化的成纤维细胞表现出与线粒体功能障碍和几种线粒体基因转录失调相关的高葡萄糖消耗率[14],[15]以及未发表的结果，这些事件通常与癌症表型有关。因此，K-ras公司转化的NIH3T3细胞对葡萄糖剥夺非常敏感[15]这是一种停止生长并死亡的状态。转化相关表型K-ras公司通过表达显性负性鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF-DN）可以挽救转化的细胞系[15]——[17].
这里我们比较了正常NIH3T3小鼠成纤维细胞（正常细胞）对谷氨酰胺限制的生理反应；通过活化形式的K-ras公司癌基因（转化细胞）和K-ras公司转化的NIH3T3成纤维细胞通过GEF-DN（转化细胞）的表达而逆转。谷氨酰胺剥夺强烈降低转化细胞的增殖，而对正常和回复系几乎没有影响。与同基因对应物相比，转化细胞的整体蛋白质合成或ATP水平未观察到谷氨酰胺缺乏依赖性降低。转化细胞的增殖减少伴随着细胞周期蛋白D、E和A的持续积累和S期进入的流产。通过添加四种脱氧核糖核苷酸（但不是TCA循环中间产物），可以恢复转化细胞的增殖缺陷，这表明K-ras公司谷氨酰胺缺乏诱导的转化细胞主要是由于DNA前体的供应减少，存在促进进入S期的活跃信号通路。
结果
在含有低初始谷氨酰胺浓度的培养基中K-ras转化的成纤维细胞增殖减少与S期细胞比例增加有关
谷氨酰胺是多种细胞过程的重要底物。我们测试了降低培养基中的初始谷氨酰胺浓度是否会对转化细胞的增殖产生与正常细胞不同的影响。异步正常和转化细胞系在正常生长培养基（4 mM谷氨酰胺）、中间培养基（1 mM谷氨酸）和低谷氨酸培养基（0.5 mM谷氨酸钠）中培养。这些浓度的选择考虑了细胞培养中通常使用的谷氨酰胺水平（4至2 mM）以及人体血浆中测定的谷氨酰胺浓度（0.6 mM）。所有培养基均添加25 mM葡萄糖。细胞被跟踪至少144小时，也就是说，从接种的那一刻起，直到它们达到汇合、开始在多层中生长或死亡。本节和以下段落中报告的所有实验均指上述实验装置。
无论谷氨酰胺浓度如何，正常细胞在72小时后停止生长。后来，细胞数量开始减少(，⧫符号）。同时，凋亡表型-包括漂浮、死亡细胞的存在(在正常细胞中观察到，与谷氨酰胺浓度无关，可能是因为接触抑制时间延长。在正常和中等谷氨酰胺培养基中，转化细胞继续增殖，并达到比正常细胞更高的细胞密度，但转化细胞在低谷氨酰胺培养液中生长时，其增殖优势几乎完全丧失，这两种细胞计数结果都表明(，约1,1×106, 0,9×106和0.4×106在正常、中等和低谷氨酰胺浓度下生长的细胞分别为144小时）和直接显微镜观察(，比较左下和右下底部面板）。无论谷氨酰胺浓度如何，转化细胞中几乎没有漂浮的死亡细胞(). 当在0.5 mM谷氨酰胺中培养时，在人类HEP3B和HCT116癌细胞系中观察到类似的增殖潜力损失（数据未显示），这表明谷氨酰胺还原抑制细胞增殖是转化细胞的一个普遍特征。
谷氨酰胺缺乏诱导致癌细胞增殖停滞和S期积累K-ras公司转化的成纤维细胞。正常（⧫）和转换(▪) 细胞系以3000个细胞/厘米的速度培养2在正常介质中的6孔板中。24小时后，用正常培养基−4 mM谷氨酰胺-（a）、中间培养基-1 mM谷氨酸-（B）和低培养基-0.5 mM谷氨氨酸-（C）替换培养基，并在指定时间收集细胞并进行计数。（D） 96小时时在4 mM谷氨酰胺（左图）和0.5 mM谷氨酸（右图）中培养的正常细胞（上图）和转化细胞（下图）的形态学分析。在相控显微镜下观察细胞。将指数生长的正常细胞和转化细胞在含有4mM和0.5mM谷氨酰胺的培养基中培养更长时间（24、48、72、96和144 h），然后采集、计数并在用碘化丙啶（E）染色后进行FACS分析，或用BrdU脉冲30分钟，然后使用抗BrdU特异性抗体（F）通过荧光显微镜进行分析。结果是至少三次测定的平均值，并显示标准偏差。对于BrdU染色，每个样本至少分析200个细胞。
如前所述[15]，平衡指数期很短，因为尽管细胞数量呈指数增长1实验开始后48小时，细胞就开始增多，正常细胞更是如此(). 值得注意的是，在低谷氨酰胺培养基中生长的转化细胞保留了相当大比例的S和G2/即使在72或96小时的时间点，M期细胞，即当细胞数量的增加停止时。事实上，经过72小时的生长，转化细胞在S+G中的细胞比例非常相似2M期与谷氨酰胺浓度无关，而与正常细胞相比可以观察到显著差异。为了评估S期细胞，定量掺入DNA的BrdU数量比碘化丙啶更精确，因此，DNA合成通过BrdU掺入（30分钟脉冲）进行分析，使用BrdU特异性抗体进行免疫荧光检测，并对BrdU阳性细胞进行计数(). 虽然正常BrdU-incoming细胞的比例从48小时开始稳步下降，在生长96–144小时后降至1%左右，但在生长96-144小时时转化的BrdU-Incoming细胞比例仍然较高，在添加0.5 mM谷氨酰胺的培养基中生长的细胞更是如此。例如，比较在添加0.5 mM谷氨酰胺的培养基中生长96小时的正常细胞和转化细胞：正常细胞和转换细胞达到了相同的最大密度，但正常细胞中加入BrdU的细胞比例几乎为0%，转化细胞中至少为15%。该值保持恒定直到实验结束，并且对于在4mM或0.5mM谷氨酰胺中生长的细胞基本上相同，尽管增殖差异很大。
通过测定培养基中残留的谷氨酰胺间接测量谷氨酰胺摄取(图S1A和B). 在每种谷氨酰胺可用性下，正常细胞和转化细胞以相同的速率消耗谷氨酰胺。值得注意的是，在低初始谷氨酰胺浓度下生长的细胞对谷氨酰胺的吸收速度要快得多(图S1B). 我们可以证明，在以4 mM初始谷氨酰胺浓度生长的细胞中，即当正常细胞停止增殖时，96小时内仍存在至少20%的初始谷氨酰胺（即约0.8 mM）(图S1A). 相反，在低初始谷氨酰胺浓度下生长的正常细胞和转化细胞中，96小时内没有谷氨酰胺残留。转化细胞随后停止生长，表明谷氨酰胺在这些条件下起着限制营养素的作用。我们在新生小牛血清中检测不到任何谷氨酰胺，在生长培养基中补充透析血清时，也看不到任何生长差异（数据未显示）。
当初始电镀密度降至2000个电池/cm时2（与我们3000个电池/厘米的标准电镀密度相比2)我们观察到了上述相同的表型，但延迟了24小时，这与谷氨酰胺不是限制正常细胞增殖的因素的概念一致(图S2A、C和D).
在转化细胞中，低谷氨酰胺持续的S期与细胞周期蛋白D、E和A的延长表达、pRb磷酸化增强、p27水平降低和细胞质定位有关基普1
已知致癌Ras激活可促进G1到S级数[15]——[18],[19]上一段中报道的结果表明，在低谷氨酰胺培养基中生长的转化细胞在S期保留了大量细胞，而增殖停止，这表明在转化细胞中谷氨酰胺的耗竭不能有效地关闭G期1因此，分析谷氨酰胺在正常和转化细胞中对相关参数的调节是有意义的，如参与G1到S过渡。
哺乳动物细胞S期开始所需基因的转录由E2F/DP转录因子诱导，其在早期G1细胞被pRb蛋白下调。pRb抑制的释放需要上游细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的磷酸化，即Cdk4/cyclin D和Cdk2/cyclin E[20]值得注意的是，Cdk2和Cdk4激酶复合物在G1到S转换，795号血清上的pRb蛋白。几位作者认为这种磷酸化是Cdks活性的读数。D型和E型细胞周期蛋白/Cdk复合物受细胞周期蛋白结合、磷酸化和两个Cdk抑制剂家族的调节：INK4家族，对Cdk4起特异作用，KIP家族，包括p21Cip1号机组，第27页基普1和第57页基普2同时作用于Cdk4和Cdk2[21]此外，第21页Cip1号机组和第27页基普1也有助于细胞周期蛋白D/Cdk4在G早期的组装和激活1
[21],[22].
使用针对pRb的磷酸特异性抗体检测Ser795上磷酸化的pRb795系列并且不会与未磷酸化的pRb发生交叉反应。在正常细胞中，无论初始谷氨酰胺浓度如何，Ser795磷酸化pRb-即监测Cdk4和Cdk2激酶活性的形式-随着细胞接近和达到汇合而减少(，面板A和B4）。同时，观察到细胞周期蛋白D1、E和A的下降，其水平在96小时时达到或低于检测极限(，面板A至B3）。在实验的时间过程中，观察到Cdk2减少，Cdk4更持久地表达(图S3). 此外，如所示和S4B和S4C在补充了三种初始谷氨酰胺浓度的培养基中生长的正常细胞中，p27的表达基普1和第21页Cip1号机组p27蛋白呈时间依赖性增加基普1p21的减少Cip1号机组（与谷氨酰胺的初始浓度无关）。
G蛋白的表达1正常细胞和转化细胞的S转换。为了进行蛋白质表达分析，在适当的时间点收集在含有4 mM谷氨酰胺、1 mM谷氨酸和0.5 mM谷氨酸钠的培养基中生长的正常细胞（A）和转化细胞（C），并对来自总细胞提取物的40µg蛋白质进行SDS-PAGE，然后用适当的抗体进行Western印迹。显示了至少三个独立实验中的一个。（B1–B4和D1–D4）通过扫描仪采集Western blot胶片后蛋白质水平的相对定量分析以及使用Image J程序进行密度分析。通过使用相应的vinculin值对每个蛋白质获得的密度测定值进行归一化，并考虑24小时/4 mM谷氨酰胺样品获得的密度测量值等于1绘制。结果是至少三次测定的平均值，并显示SD。
p27的表达和定位基普1在正常细胞和转化细胞中。对于p27基普1在适当的时间点收集生长在含有4mM谷氨酰胺、1mM谷氨酰胺和0.5mM谷氨酰胺的培养基中的正常细胞（A）和转化细胞（B）的表达分析，并对来自总细胞提取物的40µg蛋白质进行SDS-PAGE，然后用p27进行Western印迹基普1特异性抗体。显示了至少三个独立实验中的一个。p27的相对定量分析基普1通过扫描仪采集Western印迹胶片并使用Image J程序进行密度分析后的蛋白质水平，如正常细胞（C）和转化细胞（D）。第27页基普1通过免疫荧光染色分析p27在正常（E、F、G和H）和转化（I、L、M和N）细胞系中的细胞定位基普1（红色染色），在添加4 mM谷氨酰胺（左图）或0.5 mM谷氨酸（右图）的培养基中生长24和96小时后。DAPI染色（蓝色染色）显示细胞核。这些图片是采集到的两个单一图像之间合并的结果。每个样本至少有200个细胞被评分。三个独立实验的平均值以G、H、M和N表示，误差条表示标准条，20µM。
p27的抑制功能基普1不仅通过合成和降解，还通过亚细胞定位进行调节。的确，细胞质p27基普1在约40%的原发性人类乳腺癌中检测到Akt激活，与患者预后不良和Cdks抑制活性降低有关[23]——[25]在正常细胞中，生长在4和0.5 mM GLN中，与p27的时间依赖性增加相关基普1，我们观察到p27基普1染色在早期时间点（24-48小时-增殖细胞-，，面板E、F、G和H），并在随后的时间点（72–96小时-滞留细胞-面板E、F、G和H）。增加p27基普1表达和核定位与S期细胞和pRb的减少密切相关795系列在实验过程中观察到磷酸化。
对于转化细胞来说，模式非常不同。在添加了4 mM谷氨酰胺的培养基中生长的细胞中，细胞周期蛋白D、A和E以及磷酸化Rb仅下降到24小时时水平的50%左右(而Cyclin D1在中、低谷氨酰胺浓度下显著下降。与正常细胞中观察到的模式不同，转化细胞显示出相当稳定的Cdk4、Cdk2和p21Cip1号机组实验期间的水平(图S3和S4C系列)p27的水平没有增加基普1()：确实是第27页基普1在最后一个时间点（96小时），在低谷氨酰胺培养的细胞中几乎检测不到(). 在谷氨酰胺利用率低和高的情况下，免疫荧光染色显示，转化细胞中有很大一部分p27基普1与在正常细胞中观察到的情况相反，在正常细胞中，这种Cki的大部分在以后的时间点是核的（比较，对于转化细胞，对于正常细胞）。然而，使用抗BrdU和抗p27进行双重免疫荧光染色基普1特异性抗体，评分p27基普1在正常和转化的BrdU阳性细胞中的定位显示，几乎所有的BrdU阳性细胞都有p27的核质定位基普1蛋白质(图S4A和B).
显性阴性Ras特异性GEF下调Ras信号转导逆转K-Ras转化成纤维细胞中的低谷氨酰胺依赖性表型
据报道，显性阴性Ras特异性GEF蛋白的过度表达可使多种表型逆转K-ras公司转化的小鼠成纤维细胞，包括Ras-GTP水平、形态、锚定非依赖性生长、减少裸鼠中Ras依赖性肿瘤的形成、葡萄糖依赖性和线粒体功能障碍[15]——[17]。如所示,K-ras公司表达显性负性GEF的转化细胞显示出在所有三种谷氨酰胺条件下生长的转化细胞中观察到的所有表型的完全逆转。的确，如所示，G中累积的还原细胞1，减少BrdU阳性细胞的比例，以时间依赖的方式降低其增殖能力（数据未显示），如在正常细胞中观察到的。蛋白质表达分析完全证实了这一结果()其中细胞周期蛋白D1、E、a和pRb磷酸化减少，p27增加基普1以时间依赖和谷氨酰胺依赖的方式观察到。最后，p27的细胞定位分析基普1蛋白质表现出与在正常细胞中观察到的相似的行为(). 综上所述，这些数据支持这样的观点，即转化细胞对谷氨酰胺缺乏的高度敏感性是由于致癌K-ras的组成性表达所致。
GEF-DN蛋白完全恢复致癌诱导的表型K-ras公司谷氨酰胺缺乏表达。细胞周期分布（A）、S期细胞群（B）、G期相关蛋白表达的时间进程1丝氨酸795（C）的S转换和pRb磷酸化，p27的相对定量分析基普1蛋白质（D）和p27基普1如图所示，在不同初始谷氨酰胺可用性条件下生长的还原细胞中的细胞定位（E、F、G和H）。实验如前所示进行。A、B、D、G和H中显示了至少三个独立实验的平均值，误差条表示标准条，20µm。
谷氨酰胺减少不会实质性干扰RNA合成、蛋白质合成和能量代谢
氨基酸缺乏导致RNA和蛋白质合成速率下降，从而导致细胞总蛋白质含量降低[26],[27]谷氨酰胺是组织、体液和细胞培养基中含量更丰富的氨基酸，谷氨酰胺参与多种氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸）的生物合成以及能量生产，因此这种影响在谷氨酰胺消耗时可能更为显著[28]——[30]和核苷酸生物合成[31].
我们首先分析了谷氨酰胺缺乏是否会影响总RNA和蛋白质积累。为此，分析了每个细胞RNA和蛋白质平均含量的时间进程。正常细胞和转化细胞的平均RNA含量，与谷氨酰胺的可用性无关，在实验的时间过程中略有下降。与在正常细胞中观察到的相比，在低谷氨酰胺中生长的转化细胞的RNA含量随时间的推移而减少，这表明谷氨酰胺的减少可能会阻碍核苷酸的生物合成，从而阻碍稳定RNA的合成().
正常细胞和转化细胞中谷氨酰胺依赖性细胞过程的分析。用分光光度法测定用TRIzol溶液提取的总RNA以及生长在4 mM谷氨酰胺（A、C和E）和0.5 mM谷氨酸（B、D和F）中的正常细胞和转化细胞的不同裂解缓冲液（蛋白质），计算出单个细胞的总RNA、蛋白质数量和RNA/蛋白质比率。将正常（G）和转化（H）细胞系以3000个细胞/厘米的速度培养2在正常介质中的6孔板中。24小时后用正常培养基−4 mM谷氨酰胺-(◊), 低-中-0.5 mM谷氨酰胺-(□), 含有0.5 mM谷氨酰胺和2 mM丙酮酸的培养基(▵) 以及含有0.5 mM谷氨酰胺和2 mM苹果酸的培养基(○) 然后在指定时间收集并计数细胞。在4 mM（I）、1 mM（L）和0.5 mM谷氨酰胺可用性（M）条件下，使用荧光素-荧光素酶法沿时间进程测量两种细胞系中的ATP含量。根据ATP标准校准ATP浓度，并以每10.000个细胞的纳米数表示。在所有实验中，至少有三个独立实验的平均值都用误差条表示SD。
当细胞接近并达到稳定期时，无论谷氨酰胺浓度如何，正常细胞中的蛋白质含量都会略有下降(). 相反，转化细胞的蛋白质含量随时间而显著增加。通过SDS-PAGE凝胶的Comassie染色，至少在该技术的有限分辨率内，未观察到主要的质量定量变化(图S5). 这些结果总结在面板E和F中，显示在4 mM谷氨酰胺中，正常细胞和转化细胞的RNA/蛋白质比率的时间依赖性变化非常相似，而转化细胞在限制性谷氨酰胺下生长时，该参数的下降更明显。
谷氨酰胺是一种可氧化燃料，通过天冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷氨酸脱氢酶催化的反应，以α-酮戊二酸的形式进入TCA循环[32],[33]因此，据报道，谷氨酰胺缺乏可能导致该周期的缺乏[34],[35]在谷氨酰胺水解的最后步骤中，用2 mM丙酮酸补充生长培养基（含0.5 mM谷氨酰胺），丙酮酸主要通过其在乙酰-CoA中的转化进入TCA循环，或用2 mM苹果酸补充生长介质（含0.5mM谷氨酰胺，不能挽救转化细胞中由低谷氨酰胺引起的增殖缺陷(). 事实上，这两种细胞系的三条生长曲线完全重叠，分别对应于0.5 mM谷氨酰胺单独或加上丙酮酸或苹果酸。
在正常细胞和转化细胞中测量ATP水平（在4、1和0.5 mM谷氨酰胺中24、48、72和96小时，). 在实验的过程中，两种细胞系中的ATP均下降。在所有情况下，即使在最近的检测时间，仍存在大量的ATP残留，但正常细胞的ATP含量下降更为明显（在添加4 mM、1 mM和0.5 mM初始谷氨酰胺的培养基中生长的细胞分别为20%、41%和38%）与转化细胞相比（在添加4 mM、1 mM和0.5 mM初始谷氨酰胺的培养基中生长的细胞分别为5%、25%和18%）。对还原细胞进行的相同分析证实了与在正常细胞中观察到的行为类似的行为（数据未显示）。这些结果排除了谷氨酰胺对转化细胞的影响可能是由于能量消耗所致。
添加脱氧核糖核苷酸三磷酸可挽救K-ras转化成纤维细胞中谷氨酰胺含量低或完全缺乏所导致的S期进入流产
上述报告的结果表明，转化细胞在限制谷氨酰胺浓度下的能量代谢并不严重失衡，因为这些细胞具有正常的ATP和蛋白质水平，并且不会从增加TCA循环的燃料供应中受益。另一方面，在限制谷氨酰胺的条件下，转化的成纤维细胞不能下调负责G的机制1S期细胞周期蛋白的持续积累、p27的低水平和较大的细胞质定位证明了向S期转变基普1以及随后pRb的持续磷酸化。尽管如此，转化细胞仍无法继续增殖，尽管维持了相当高的S期细胞水平。由于谷氨酰胺是嘌呤和嘧啶生物合成中的一个重要中间产物，谷氨酰胺耗尽可能耗尽细胞内的核苷酸库，进而导致正常细胞周期的执行失败[31],[36]为了验证这一假设，我们检查了添加脱氧核糖核苷酸（使用的浓度已被证明不会干扰多个细胞系的增殖在体外)[37]可影响正常细胞系和转化细胞系的增殖。在补充4mM谷氨酰胺的培养基中，10µM dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）的存在对正常细胞和转化细胞的生长没有影响(图S6以及添加0.5 mM谷氨酰胺的培养基中正常细胞的生长(). 相反，添加dNTPs可以维持转化细胞的进一步生长，无论是添加一次（0小时时）还是添加两次（0和48小时时）（比较). 然而，当稍后添加时，即在72小时时，脱氧核糖核苷酸未能恢复低谷氨酰胺诱导的增殖缺陷（数据未显示）。这些结果表明，持续供应脱氧核糖核苷酸可缓解转化细胞对谷氨酰胺的增殖依赖性。
正常细胞和转化细胞在培养基中加入四种dNTP的增殖分析。如前所述，对正常（A）和转化（B）细胞系进行电镀。24小时后（显示为0小时），用正常培养基−4 mM谷氨酰胺-(◊), 低-中-0.5 mM谷氨酰胺-(□), 含有0.5 mM谷氨酰胺和10µM dNTP（ATP、GTP、TTP和CTP）的培养基(▵) 以及含有0.5 mM谷氨酰胺和10µM dNTP的培养基，其中在0和48小时时添加dNTP(○), 然后在指定时间收集细胞并计数。在含有10%血清、4 mM或0.5 mM谷氨酰胺、dNTPs和BrdU的培养基中释放正常（左面板）和转化（右面板）细胞，并同步24小时血清饥饿，以进行连续DNA标记。在指定的时间点收集细胞，用碘化丙啶和抗BrdU特异性抗体进行染色，并用流式细胞仪进行分析。分别获得异步和0小时（时间0）时间点样本的代表性细胞图，绘制BrdU含量（标记细胞）与。PI染色（DNA含量）(-正常细胞和D转化细胞）。图中的红色表示S相细胞。G中细胞的百分比1（面板E和F）、S（面板G和H）和G2/M（面板I和L）、在4 mM和0.5 mM谷氨酰胺中释放的正常（左侧面板）和转化（右侧面板）细胞的相，或通过上述双参数分析获得的加上dNTP的相。星号表示S或G2/在两种谷氨酰胺可用性中确定了M相峰值。误差条对应于三份分析的标准偏差。
为了更好地分析G1在含有4 mM谷氨酰胺的培养基中生长的细胞通过血清饥饿同步24小时达到S转变。正如预期的那样，转化细胞在G中没有阻滞0/克1和正常细胞一样有效()双参数BrdU/PI染色测定的具有复制前DNA含量的细胞百分比，正常为89%，转化为78%。将10%的血清添加到含有4 mM谷氨酰胺、0.5 mM谷氨酸或0.5 mM谷酰胺加10µM dNTPs的培养基中，释放细胞周期阻滞，并在指定的时间点（8、10、12、14、16、18和20 h）收集。然后跟踪细胞周期各阶段的转运时间过程。正常细胞表现出与谷氨酰胺浓度无关的重新进入细胞周期的同等动力学。G的分数0/克1细胞在血清刺激后至少达到14-16小时（图E），而S期（图G）和G期2/M期（图I）分别在14小时和18小时达到峰值。与正常细胞（8小时）相比，转化细胞可重复预测其进入S期与。10 h，面板G和h），与谷氨酰胺浓度无关。S相（面板H）和G中的峰值2/M期（面板L）也是预期的，但仅在含有4 mM谷氨酰胺（黑色条）或0.5谷氨酰胺加10µM dNTP（白色条）的培养基中刺激的细胞中，而在含有0.5 mM谷氨酸的培养基（灰色条）中刺激的胞体中没有。
接下来，我们研究了添加核苷酸是否对完全缺乏谷氨酰胺的血清饥饿阻断释放的细胞也有效，使用的方案与0 mM谷氨酰胺的释放不影响正常细胞的细胞周期再进入，无论是否存在核苷酸(面板A、C和E）。在转化细胞中，在缺乏谷氨酰胺的情况下释放可延迟2小时进入S期(面板B和D），并将S相峰值延迟2小时(，面板D，星号）。将10µM dNTPs添加到0谷氨酰胺（白条）中释放的转化细胞中，可以缓解S期进入的延迟，达到S期峰值的延迟，但不能缓解穿过G期的延迟2/M相（面板F，比较黑白条）。
在0 mM谷氨酰胺±dNTPs中释放的同步正常和转化细胞的细胞周期。在含有10%血清、4mM或0mM谷氨酰胺、dNTPs和BrdU的培养基中释放正常细胞和转化细胞，并同步24小时血清饥饿，用于连续DNA标记。在指定的时间点收集细胞，用碘化丙啶和抗BrdU特异性抗体进行染色，并用流式细胞仪进行分析。G中细胞的百分比1（面板A和B）、S（面板C和D）和G2/图中显示了在4 mM和0 mM谷氨酰胺中释放的正常（左侧面板）和转化（右侧面板）细胞的M（面板E和F）期，或通过双参数分析获得的加dNTP。星号表示S或G2/在两种谷氨酰胺可用性中确定了M相峰值。误差条对应于三份分析的标准偏差。
这些数据表明，谷氨酰胺限制对转化细胞的主要影响是增加S期的长度，在低谷氨酰胺条件下，S期细胞在2小时后达到峰值(，峰值用星号表示），4小时后完全不含谷氨酰胺(，峰由星号表示）：谷氨酰胺的这一功能可以通过dNTPs保持。谷氨酰胺完全耗尽严重减缓通过G的转运2/M、 不考虑dNTP供应()表明谷氨酰胺在这个细胞周期阶段具有独特的作用。
选定信号通路对谷氨酰胺可用性的反应以及雷帕霉素治疗对正常和转化细胞增殖能力的影响
据报道，在不同的转化细胞系中，谷氨酰胺或其他氨基酸的缺乏会诱导细胞在G0/克1和/或加倍时间增加，最大细胞密度降低[36],[38],[39]这种抗增殖作用，很可能由TOR途径介导[40],[41]与mRNA翻译和/或蛋白质生物合成的普遍减少或与细胞周期正、负调节因子表达的特定减少/增加有关，正如在缺乏精氨酸的细胞中观察到的那样（Cdk4减少）[42]，在缺乏hystidine的细胞中（p21增加waf1和第27页基普1)或蛋氨酸（p21增加waf1)[43],[44]在非转化细胞中，上游激活物（如PI3K/Akt和Ras/Raf/Erk）和上游抑制剂（如磷酸盐PTEN和AMP激酶）适当地控制TOR通路的激活。在转化细胞中，TOR途径通过几个途径解除调控，其中一个主要作用是致癌Ras信号，能够激活TOR途径的正调控因子（PI3K和ERK）[45],[46].
为了研究信号转导在正常细胞和转化细胞对谷氨酰胺缺乏反应中的作用，我们分析了TOR途径的两个主要调节因子Akt和AMPK的表达和激活水平，以及下游TOR靶点p70 S6激酶（S6K）的表达和活化水平。如所示在正常细胞中，激活形式的Akt（用抗磷丝氨酸473抗体探测）随时间而减少，与谷氨酰胺初始浓度无关。在转化细胞中，磷酸化Akt的水平始终非常显著，在初始时间点略高，不会随时间而降低，也不会受谷氨酰胺浓度的影响。
正常细胞和转化细胞中AKT、AMPK和TOR通路的激活。（A） 生长在补充不同初始谷氨酰胺浓度的培养基中的正常和转化细胞系中AKT蛋白的时程表达和磷酸化。为了进行蛋白质表达分析，在适当的时间点收集生长在含有4mM谷氨酰胺和0.5mM谷氨酰胺的培养基中的正常细胞和转化细胞，并对总细胞提取物中的50µg蛋白质进行SDS-PAGE，然后用特定的抗磷酸化蛋白进行Western blottingSer473系列AKT（p-AKT）抗体和抗AKT抗体。（B） 在补充不同初始谷氨酰胺浓度的培养基中生长的正常细胞系和转化细胞系中AMPKα蛋白的时程表达和磷酸化。为了进行蛋白质表达分析，在适当的时间点收集生长在含有4mM谷氨酰胺、1mM谷氨酰胺和0.5mM谷氨酰胺的培养基中的正常细胞和转化细胞，并对总细胞提取物中的50µg蛋白质进行SDS-PAGE，然后用特异性抗磷酸化蛋白进行Western blottingThr172电话AMPK（p-AMPK）抗体和抗AMPK抗体。（C） 在正常细胞系和转化细胞系中S6K蛋白的时程表达和磷酸化如B所述。Western blotting分析是通过使用特定的抗磷酸化通过389S6K（p-AKT）抗体和抗S6K（S6K）抗体。这些面板代表了三重分析（Akt和AMPK）或重复分析（S6K）。
如前所述，TOR蛋白也通过AMPK控制，AMPK被ATP/ADP比率的下降激活，随后的AMP积累导致信号传导，导致不同的细胞反应和细胞周期停滞[47]我们的Western blot实验分析了在不同谷氨酰胺利用率下生长的细胞中AMPK的激活状态，结果表明，与两种细胞系中ATP水平的下降相关，只有正常细胞中的ATP下降更大（参见)观察到AMPK活性可靠且依赖谷氨酰胺(1 mM和0.5 mM谷氨酰胺样品）。p70 S6K磷酸化的分析（用抗磷苏氨酸389进行探测，其与p70S6K活性密切相关，而该活性又被广泛用于TOR通路激活的生物读数）表明，与正常细胞样品相比，所有转化细胞样品中的活性和表达都更高。这些结果与其他作者的一些观察结果密切相关，突出了Akt和S6K在致癌中的重要性ras（拉斯维加斯）信号[48]为了进一步探讨TOR通路在正常细胞和转化细胞对谷氨酰胺缺乏反应中的作用，研究了雷帕霉素（已知的TOR蛋白活性药物抑制剂）对同步化细胞进入S期能力的影响。我们检测了在4 mM或0 mM谷氨酰胺+dNTPs培养的同步正常和转化细胞中添加雷帕霉素是否会干扰G1在存在dNTPs的情况下，转化细胞也发生S转化。如所示，用雷帕霉素处理过的正常细胞样本显示出从G区退出的延迟1停止（面板A），从而延迟4小时到达S相峰值（面板C，用星号表示的峰值），从而执行G2/在为该特定实验选择的时间间隔内未观察到的M转变（面板E）。用4mM谷氨酰胺加雷帕霉素或0mM谷氨酰胺释放的转化细胞从G细胞中退出较慢1逮捕并延迟4小时到达S相和G相2+与4 mM样品和0 mM加dNTP相比，M峰值（面板D和F，用星号表示的峰值）。令人惊讶的是，在0mM谷氨酰胺加dNTP中释放并用雷帕霉素处理的样品几乎不能从G1从而进入S相。事实上，在随后分析的时间点（18小时），G组细胞的得分分别为50%和34%1和S相。细胞周期蛋白D1表达的western blot分析进一步证实了这些发现。事实上，在用雷帕霉素处理的正常细胞和转化细胞中，该蛋白的表达水平低于未处理样品（数据未显示）。
雷帕霉素处理后细胞周期分析。在含有10%血清、4 mM谷氨酰胺±雷帕霉素或0 mM谷氨酸±雷帕霉素、±dNTPs和BrdU的培养基中释放正常细胞和转化细胞，并同步24小时血清饥饿，以进行连续DNA标记。在指定的时间点收集细胞，用碘化丙啶和抗BrdU特异性抗体进行染色，并用流式细胞仪进行分析。G中细胞的百分比1（面板A和B）、S（面板C和D）和G2/表示在上述介质中释放并通过双参数分析获得的正常（左侧面板）和转换（右侧面板）细胞的M（面板E和F）相。星号表示S或G2/在两种谷氨酰胺可用性中确定了M相峰值。误差条对应于三份分析的标准偏差。
这些结果共同表明，在正常细胞中，氨基酸剥夺可能参与TOR信号抑制，诱导G1逮捕(即通过减少mRNA翻译、蛋白质合成、ATP水平和细胞周期调节器的表达）K-ras公司转化细胞的这种控制被Akt的激活和AMPK的强烈抑制所扰乱，以协同的方式发挥作用，在低或缺乏谷氨酰胺的情况下，也保持TOR通路的相当大的活性，能够促进进入S期。事实上，同步化细胞中的TOR信号抑制完全阻断了转化细胞在dNTPs存在下进入S期的能力。
讨论
一种基因定义的实验模型，其中转化的表型通过下调致癌基因的显性阴性GEF蛋白的表达而表型逆转K-ras公司
[16],[17]，使我们能够在本文中表明谷氨酰胺缺乏导致流产的S期进入K-ras公司转化细胞，而它不参与阻止G中正常和还原细胞1阶段。
本文中的主要结果概括于其中谷氨酰胺的代谢相互联系()以及谷氨酰胺缺乏对G的信号通路和分子事件的影响1到S的转换，正常/恢复或K-ras公司转化细胞，描述如下().
谷氨酰胺控制G的作用模型1/S过渡。面板中使用了以下约定。代谢连接用黑色箭头表示。蓝线表示正（箭头）或负（钝端）监管连接。上调和下调分别由向上或向下的红色箭头表示。一个完整的区块由红色X表示，一个漏区块由虚线X表示。（A）谷氨酰胺的一些代谢作用在浅蓝色区域内表示。（B） 异步和同步正常细胞中谷氨酰胺短缺引起的事件摘要。G蛋白的生物读数1报道了细胞向S的转变及其对细胞周期的影响。（C） 异步和同步谷氨酰胺短缺事件总结K-ras公司转化细胞。G蛋白的生物读数1报道了细胞向S的转变及其对细胞周期的影响。
在异步正常细胞中，无论谷氨酰胺的可用性如何，接触抑制都会导致Akt的下调，再加上低谷氨酰胺时观察到的AMPK上调，都会导致TOR通路失活。因此，细胞周期蛋白D、E和a的表达下调，pRb磷酸化强烈降低，p27基普1能级增加，其局部化优先成为核，从而建立了一个条件，使G1-细胞周期阻滞(). 在同步正常细胞中，谷氨酰胺缺乏减缓G2/M转变，表明谷氨酰胺可能在这种细胞周期阶段发挥作用。
在K-ras公司转化细胞中激活的Ras-GTP水平很高[17]接触抑制效率较低[17]谷氨酰胺的缺乏以与正常细胞相反的方式影响Akt和AMPK，使TOR通路至少部分激活(). 该事件使细胞周期蛋白D（至少72小时）、E和A大量表达，pRb磷酸化持续，p27减少基普1及其优先的细胞质定位，这些条件共同促进进入S期(). 在同步转化细胞中，谷氨酰胺缺乏会减缓G1向S过渡或G2/M过渡。
但为什么在低谷氨酰胺中K-ras公司转化细胞流产？谷氨酰胺的缺乏也会降低核苷酸的可用性，这导致与高谷氨酰胺的生长相比，RNA积累略有减少（至少在72小时之前，)对DNA合成有更显著的影响(,S1D系列). 脱氧核糖核苷酸耗竭是谷氨酰胺缺乏导致转化成纤维细胞增殖减少的主要影响，这一观点得到了证实，转化细胞的增殖缺陷可以通过将这些DNA聚合前体添加到低谷氨酰胺培养基中来修复().
当低量的谷氨酰胺仍然与细胞周期进程相适应时，如在血清饥饿的细胞中，G1()在转化细胞中，低谷氨酰胺培养基导致血清再添加后进入S期延迟2小时。相同的延迟传输到G2/M转变，表明在S期完成和细胞分裂之间，细胞周期计时没有主要的代偿机制。谷氨酰胺的完全缺乏加剧了这种对细胞周期计时的影响()其中进入S阶段和G执行延迟4小时2/观察到M转变。这些数据有力地表明，谷氨酰胺限制在转化细胞中的作用首先是减缓S期的移动，然后，当出现更严重的限制时，会使大部分细胞停留在S期。
在几种细胞模型中进行的研究表明，dNTP的可用性及其合成调控在DNA复制中起着关键作用[49]确实，dNTP合成酶的表达受细胞周期调节，在S期开始时表达增强[50],[51]此外，dNTP水平在细胞周期的S期内变化[52]从而改变了S期DNA复制的速率[53]dNTPs水平的细微变化可能对DNA复制产生相当大的影响[54]通过化学抑制其生物合成获得的核苷酸耗竭可诱导G1或S期阻滞或减缓S期的整体进展[55],[56]。添加10µM脱氧核糖核苷酸混合物可恢复异步和异步培养的效果，这表明依赖谷氨酰胺脱氢途径的早期主要速率限制步骤与核苷酸生物合成有关。然而，当谷氨酰胺在培养基中完全受限时，异步和同步细胞中的这种连接似乎都会丢失。实际上，在转化细胞谷氨酰胺增殖曲线较低的后期（72–96小时），相当于培养基中谷氨酰胺几乎完全耗尽(图S2B)，dNTP无法恢复扩散()表明在这种情况下，谷氨酰胺缺乏会激活其他细胞反应。此外，在转化的同步细胞中，在完全谷氨酰胺耗尽的培养基中释放，dNTPs能够恢复S相转变，但不能恢复G的适当执行时间2/M相(). 事实上，在没有谷氨酰胺和dNTPs的样品中观察到这种细胞周期延迟。其他作者在不同的细胞系中观察到了这一结果。例如，Abcouwer等人。[57]表明，一些乳腺癌细胞生长介质中谷氨酰胺可用性的降低可能通过mRNA稳定诱导GADD45和GADD153的表达。GADD45过表达已被证明诱导G2/M细胞周期阻滞[58]在几个环境压力下。此外，Drogat等人。[38]表明，在A549/8癌细胞中，谷氨酰胺剥夺减少了G1期，瞬时增加S期细胞的数量，并诱导G期细胞数量稳定增加2/M相。这些发现可以解释延迟到达G2/在谷氨酰胺含量低或完全缺乏的情况下，在正常细胞和转化细胞中观察到M峰值(和).
在表现出高代谢率的细胞中，例如快速分裂的癌细胞生长在体外谷氨酰胺是最容易获得的氨基酸，可用作能源，可能成为维持蛋白质和核酸合成的主要能源[11]尤其是当葡萄糖水平较低且能量需求较高时。谷氨酰胺消耗与Krebs循环中间产物水平下降的相关性myc公司-已鉴定出转化细胞[35].
在我们的系统中，转化细胞的代谢读数（包括ATP、RNA和蛋白质水平）与正常细胞和还原细胞中的代谢读数非常接近。添加克雷布斯循环中间产物对K-ras公司转化成纤维细胞(和第5章)由此表明，扩散抑制可能独立于克雷布斯循环中间产物消耗和能源短缺。相反，我们发现在限制葡萄糖利用率下生长的相同细胞系中，ATP下降，这与这些细胞无法正确激活线粒体呼吸有关[14],[15]最终导致细胞死亡。线粒体功能的这种部分紊乱在本报告中得到了进一步证实，因为我们表明K-ras公司转化细胞生长在1 mM丙酮酸和4 mM谷氨酰胺（主要用于克雷布斯循环和氧化呼吸的底物）完全取代葡萄糖的培养基中，生长不良(图S7)最终死亡（数据未显示）。
总之，谷氨酰胺短缺K-ras公司转化细胞通过诱导流产的S期进入来限制增殖，而同一系统中的葡萄糖缺乏会加剧细胞死亡[14],[15]谷氨酰胺和葡萄糖对细胞活力的差异影响不是转化表型的特性就其本身而言而是取决于转化中激活的特定途径。例如，myc公司-过度表达的细胞在谷氨酰胺完全缺乏的情况下死亡myc公司-依赖性方式与非葡萄糖消耗[35]在相同的实验条件下，谷氨酰胺完全耗尽，细胞死亡K-ras公司与在myc公司-过度表达细胞（数据未显示）。在设计旨在利用正常细胞和转化细胞之间代谢差异的抗癌疗法时，应考虑转化细胞对营养应激的不同反应。
材料和方法
细胞培养
小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞（CRL-1658；美国型培养物收藏）和K-Ras公司转化NIH3T3衍生细胞系，226.4.1[59]，常规生长在37°C，含10%新生小牛血清、4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素（正常生长培养基）的Dulbecco改良Eagle's培养基中，湿度为5%CO2.稳定、组成性表达显性阴性突变体Cdc25的回复细胞系MmW1056E型（GEF-DN）[17]维持在添加0.7 mg/ml基因素的正常生长培养基中（G418；Sigma-Aldrich Inc.，St.Louis，MO，USA）。使用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（Invitrogen）传代细胞，并在操作前保持培养48 h。
细胞治疗
为了验证细胞对谷氨酰胺的反应，以3000个细胞/厘米的速度培养细胞2在正常生长培养基（4 mM谷氨酰胺）中。接种后18小时，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞2倍，并在具有不同谷氨酰胺（GLN）浓度（4mM、1mM和0.5mM谷氨酰胺）的培养基中孵育。需要时，按正文所示添加2 mM丙酮酸（Sigma）、2 mM苹果酸（Simma）、10µM dNTPs（Rovalab）和20 nM雷帕霉素（ALEXIS生化制剂）。
小区同步
细胞以5500个细胞/厘米的速度进行电镀2在正常生长培养基中。接种后18 h，用PBS冲洗细胞2倍，并用含有4 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素（Invitrogen）、6 ng/ml亚硒酸钠和6µg/ml转铁蛋白（Sigma）的Dulbecco改良Eagle's培养基进行24 h血清饥饿同步。通过在培养基中添加10%的新生小牛血清和适当浓度的谷氨酰胺（和dNTPs，如需要）来刺激静止细胞。用33µM 5-溴脱氧尿苷标记DNA。
流式细胞术分析
通过流式细胞术评估特定细胞周期阶段的细胞分布。将细胞胰蛋白酶化，用PBS洗涤，并在4°C下用75%乙醇固定。细胞在PBS中清洗以去除乙醇，并在0.25%Triton X-100和HCl 2N中孵育30分钟。随后，每个样品用抗BrdU一级抗体（Becton-Dickinson）染色1小时，并用Alexa Fluor 488驴抗鼠IgG（分子探针/Invitrogen）探测以识别S期。此外，使用碘化丙啶（Sigma）对相同样本进行染色，并使用Cell Quest软件（BD Bioscience）通过FACS（FACScan，Becton-Dickinson）进行分析。使用WinMDI软件进行数据分析。
谷氨酰胺测定
使用谷氨酰胺/谷氨酸酶分光光度测定试剂盒（Sigma）测定正常和转化成纤维细胞上清液中谷氨酰胺的变化，该试剂盒基于L-谷氨酰胺的酶脱氨基和L-谷氨酸脱氢以及NAD的转化+至NADH。该分析按照制造商数据表的规定进行，对谷氨酰胺具有特异性，不会与其他氨基酸或氨发生交叉反应。为了计算谷氨酰胺的含量，对标准曲线进行了线性回归分析。
免疫荧光显微镜
细胞在预先用0.2%明胶处理过的盖玻片上生长。细胞用PBS冲洗3倍，并在4%多聚甲醛中固定10分钟。随后，用PBS清洗3倍，用0.1%Triton X-100渗透10分钟，用PBS+10%山羊血清封闭30分钟，用一抗p27进行检测基普1（1∶100）（美国加州圣克鲁斯生物技术公司）在PBS+10%山羊血清中室温放置1h，用PBS洗涤3×，用荧光标记的二级抗体Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG（1∶400）（分子探针/Invitrogen）在PBS+10%山羊血清中室温放置30min，用PBS洗涤3×，用DAPI染色2分钟（1∶500）（Sigma-Aldrich Inc），然后安装在DABCO（Sigma Aldrich Inc.）中。对于BrdU（Sigma-Aldrich Inc.）标记，按照上述方法固定、渗透和封闭细胞。细胞与抗BrdU单克隆抗体（1∶10）（Becton-Dickinson）孵育后，MgCl2（3 mM）和DNasi I（Invitrogen）100 U/ml在室温下培养1h。随后，用PBS洗涤细胞3倍，并用荧光标记的二级抗体Alexa Fluoro 488驴抗鼠IgG（1∶100）（分子探针/Invitrogen）在PBS+10%山羊血清中培养30min，再用PBS洗涤3倍，DAPI染色2分钟（1∶500），然后安装在DABCO中。
显微镜检查
使用Plan-Apo物镜（40×干物镜和60×油物镜；数值孔径分别为0.75和1.4），在配备b/w CCD相机的尼康ECLIPSE 90i荧光显微镜下分析安装在DABCO中的盖玻片。这些图像是使用成像软件Metamorph 7采集的，然后在Adobe Photoshop 7.0.1中进行处理，调整亮度和对比度。使用成像软件image J进行定量分析图像。p27的相对分布基普1通过测量细胞核、细胞质和核/细胞质两个隔室中的像素平均信号，计算核/细胞浆两个隔室内的蛋白质。随机选择至少200个细胞和阴性对照（无一级抗体）。为了排除染色背景，并选择细胞的阳性染色部分进行测量，在相同阈值下对不同样本的图像进行处理，然后进行测量。
免疫印迹分析
细胞在含有150 mM NaCl、0.5%NP-40、1%甘油、50 mM HEPES（pH 7.5）、5 mM四乙酸乙二醇（EGTA）、1 mM苯甲基磺酰基（PMSF）、50 mM-NaF和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏）的缓冲液中消化。在冰上孵育30分钟后，将提取物在13.200转/分离心20分钟。采用Bradford程序（美国加利福尼亚州里士满市Bio-Rad实验室），以牛血清白蛋白为标准，测量上清液的蛋白质浓度。这些细胞提取物在十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后，通过电印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并与抗体孵育过夜。
使用的抗体是针对细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E、细胞周期素A、p27的单克隆或多克隆抗体基普1Cdk2、Cdk4（均来自Santa Cruz Biotechnology）、磷酸Rb-795、p70 S6激酶、磷酸-p70 S6酶和长春碱（均来自Cell Signaling）。随后，将膜与过氧化物酶偶联的第二抗体（Amersham，Otherfingen，CH）在室温下孵育30分钟。用ECL（Amersham）观察反应，然后用x射线胶片曝光。通过使用成像软件Image J对扫描x射线胶片上的抗体特异性条带进行密度计评估来量化蛋白质表达水平。
RNA提取和分析
使用TRIzol试剂（Invitrogen）从正常细胞系和转化细胞系中分离出总RNA。通过直接观察在1%琼脂糖凝胶上加载1µg总RNA来检查RNA纯度和完整性。总RNA的28S∶18S rRNA比率至少为2.0。通过分光光度计分析进行数量估算。
