叶绿体蛋白激酶Stt7在状态转换过程中的分析

Stt7水平在延长状态1条件下降低

免疫印迹图1A表明状态2的Stt7水平显著高于状态1。为了进一步验证这一点，在状态2条件下将含有Stt7-HA的细胞培养2小时，并在状态2或状态1条件下继续培养4小时(图2). 在不同的时间点，用HA和Cyt处理小份细胞进行免疫印迹分析（f）抗体。虽然在连续状态2条件下Stt7的水平保持不变，但在切换到状态1条件后1 h，其水平逐渐下降。2小时后下降4倍，4小时后超过20倍(图2C） ●●●●。在将细胞切换到状态2后，Stt7水平在2小时后增加了2倍，但没有达到其初始值（未公布的数据）。添加环己酰亚胺不会影响Stt7的下降，表明此过程中没有新合成的蛋白酶(图2D） ●●●●。然而，在状态1条件下，向细胞中添加蛋白酶抑制剂混合物可消除Stt7的降解(图2E） ●●●●。

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图2

在长期状态1条件下和强光下Stt7水平降低

细胞在状态2条件下生长120分钟，随后保持在状态2（黑暗+厌氧）或状态1条件（光+强曝气）或强光（900μmol光子⁻²秒⁻¹)240分钟。在不同的时间间隔，提取总蛋白，并用HA抗血清免疫印迹法测定Stt7-HA的量。塞浦路斯（f）用作加载控件。顶部：实验条件概述（有关详细信息，请参阅材料和方法).

（A） 细胞保持在连续状态2条件下。

（B） 与（A）相同，但在初始培养物在状态2下保持120分钟后添加环己酰亚胺。

（C） 状态2的细胞在120分钟后接受状态1条件。

（D） 与（C）相同，但在120分钟后添加环己酰亚胺。

（E） 与（C）相同，但在120分钟后添加蛋白酶抑制剂。

（F） 将处于状态2的细胞置于强光下。分别用抗D1和PsaA的抗体通过免疫印迹法评估PSII和PSI的水平。

（G） 与（F）相同，但添加leupeptin。用HA和Cyt免疫印迹法检测总蛋白（f）抗体。

（H） 如（C）所示，在不同的时间测试切换到状态1条件的细胞是否从状态1过渡到状态2。在这种情况下，通过添加5μM FCCP诱导向状态2过渡，并在15分钟后通过测量每个时间点的低温荧光发射光谱进行分析。

（一） 用HA抗血清免疫印迹法测定（H）中所用细胞的Stt7水平。

用HA抗血清进行免疫印迹监测，Stt7-HA在延长状态2条件下的降解可能是由于从Stt7中去除了HA标签。为了测试这种可能性，我们使用Stt7和HA抗血清对Stt7-HA菌株重复了该实验。在这两种情况下，在状态2条件下证实Stt7激酶下降(图S3A） ●●●●。我们检查了未标记Stt7也会出现这种下降(图S3B） ●●●●。为了确定涉及的蛋白酶类型，在上述相同条件下测试不同蛋白酶抑制剂：ACA（ɛ-氨基己酸）（Sigma）（50 mM）、AEBSF（4-（2-氨基乙基）-苯磺酰基氟化物盐酸盐）（罗氏）（5 mM），NEM(N个-乙基马来酰亚胺）（Sigma）（10 mM）、苯甲烷磺酰氟（Sigma-）（5mM）和EDTA（50 mM）。亮肽和NEM也在不同浓度下使用（参见图S4). 在不同的时间点采集样品并进行分析。虽然NEM完全阻止了Stt7的分解，但丝氨酸蛋白酶抑制剂ACA和AEBSF没有作用，EDTA增强了这一过程(图S4A和S4系列B） ●●●●。除NEM外，其他半胱氨酸蛋白酶抑制剂，如E64和leupeptin，可在长期状态1条件下阻止Stt7降解(图S4C、，S4系列D、 和S4系列E） ●●●●。虽然没有令人信服的证据证明叶绿体Cys蛋白酶的存在，但不能排除它们的存在。家蚕质体Cys蛋白酶的生物信息学研究拟南芥没有透露任何令人信服的候选人（参见文本S1).

众所周知，强光处理会导致LHCII蛋白激酶失活[23,24]，我们测试了Stt7在这些条件下是否稳定。对适应状态2的细胞进行强光处理（900μmol m⁻²秒⁻¹)在不同时间用免疫印迹法测定Stt7水平。在这些条件下，观察到Stt7稳步下降(图2F） ，可以通过添加亮肽来完全预防(图2G） ●●●●。在相同的光照条件下，PSII和PSI水平几乎不受影响(图2F） ●●●●。然而，变量（Fv）与最大花期（Fv/Fmax）之比的测量结果表明，该比值从0.7降至0.2，表明光损伤对PSII没有明显降低D1蛋白水平。

Stt7催化量

我们利用Stt7在延长状态1条件下的下降来测试细胞在这些条件下是否仍然能够从状态1切换到状态2。细胞首先在状态1条件下生长，如所示图2在不同的时间段后，收集细胞并使用解偶联剂FCCP（羰基氰化物对氟甲氧基苯腙）分析状态转换，FCCP是一种已知的状态转换诱导剂[13]. 在状态1和状态2条件下测量了低温荧光发射光谱和Stt7水平。图2H表明，在状态1条件下4小时后收集的这些细胞很容易过渡到状态2，尽管Stt7蛋白激酶的量减少了20倍(图2一） ●●●●。这表明Stt7激酶具有催化作用。

Stt7与细胞色素相互作用b条 ₆ （f）复合体、LHCII和PSI

LHCII激酶的激活主要取决于细胞色素b条 ₆ （f）复杂[4]. 此外，这种激酶可能与其假定的底物LHCII相互作用。测试Stt7激酶是否与细胞色素相互作用b条 ₆ （f）用十二烷基麦芽糖苷溶解状态1或状态2的Stt7-HA菌株的复合物和/或LHCII、类囊体膜，并用HA抗血清进行免疫沉淀。免疫沉淀物通过SDS-PAGE进行分离，并用几种已知类囊体蛋白的抗体进行免疫印迹。图3A显示LHCII蛋白P13、P11、P17、CP29、CP26和Lhcbm5与Stt7激酶共免疫沉淀。使用CP29获得的信号仅在状态2条件下可检测到。Cyt也观察到信号（f）和Rieske蛋白以及PSI亚单位PsaA。相反，在PSII的Stt7和D1之间以及与ATP合成酶亚单位α之间未观察到相互作用(图3A） 表明检测到的Stt7-HA与其他光合蛋白之间的相互作用是特异性的。此外，未标记野生型菌株未观察到信号(图3A） ●●●●。与PsaA、Cyt相互免疫沉淀（f）和P11抗体证实了这些蛋白与Stt7的相互作用(图3B） ●●●●。

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图3

Stt7与细胞色素LHCII的协同免疫沉淀b条 ₆ （f）复杂和PSI

（A） 右侧面板：类囊体膜stt7（stt7）用正十二烷基-β-麦芽糖苷溶解补充Stt7-HA和状态1和状态2野生型（WT）细胞的突变株，并用HA抗体共同免疫沉淀蛋白质（CoIP）。用SDS-PAGE分离免疫沉淀物，并用所示抗体进行免疫印迹。左侧面板：显示输入，代表用于联合免疫沉淀的10%样本。

（B） Stt7-HA或野生型（WT）菌株的类囊体膜按上述方法处理，并与PsaA、Cyt共免疫沉淀（f）、D1和AtpA抗体。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物，并用HA抗体进行免疫印迹。

为了进一步测试Stt7与细胞色素的相互作用b条 ₆ （f）复合物，将Stt7-HA菌株转化为宠物A3′端有一个His标签[25]. 在测试转化菌株的同质状态后宠物——他的，类囊体膜被分离、溶解，细胞色素b条 ₆ （f）复合物在Ni-NTA柱上纯化。清洗柱后，洗脱部分的免疫印迹显示，一小部分Stt7激酶与标记的细胞色素有关b条 ₆ （f）复杂，但不是没有标记的应变(图4A） ●●●●。确定细胞色素的哪些亚基b条 ₆ （f）复合物与Stt7相互作用，这是一种与GST-Stt7和溶解的纯化细胞色素的下拉测定b条 ₆ （f）进行复合体。结果(图4B） 表明Rieske蛋白，但不是Cyt（f），可以从GST-Stt7柱中洗脱，表明Stt7与Rieske蛋白相互作用。

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图4

Stt7与细胞色素共分馏b条 ₆ （f）复杂

（A） 含有Stt7-HA和Stt7-HA与His-tagged Cyt的菌株的类囊体膜（f）（PetA-His）用n-十二烷基-β-麦芽糖苷溶解并通过Ni-NTA色谱分离。E1、E2洗脱液（300 mM咪唑）用PAGE和免疫印迹法分析所示抗体。FT，流通；五十、 负载（10 mM咪唑）；W1–W5，洗涤液（20 mM咪唑）。

（B） Stt7与Rieske蛋白相互作用。GST和GST-Stt7融合蛋白分别与纯化的可溶性细胞色素孵育b条 ₆ （f）来自野生型细胞的复合物。通过PAGE和Rieske和Cyt免疫印迹分析洗脱液（E）（100 mM DTT，2%SDS）（f）抗体。FT，流通；一、 输入；W1–W4，洗涤液（PBS）。

类囊体膜中Stt7激酶的定位

虽然Stt7内的假定跨膜结构域由几种算法预测[21]，该域中存在四个Pro残基提出了一些问题，需要考虑两个模型。首先，Stt7的N末端通过跨膜结构域与Stt7大催化结构域分离。在第二种模型中，Stt7可以完全定位在类囊体膜的一侧。为了区分这些可能性，分别在Stt7蛋白的N端和C端用FLAG和HA标记。应该注意的是，FLAG-Stt7-HA没有功能，但它稳定地积聚在类囊体膜中（见下文）。由于Stt7激酶的假定底物位于类囊体膜的基质侧，因此预计Stt7的激酶结构域也位于基质侧。这是通过从含有Stt7-HA或FLAG-Stt7-HA的菌株中分离出完整的类囊体膜，并用蛋白酶V8对类囊体薄膜进行温和消化来进行测试的。然后，使用针对HA、FLAG、PsaD和OEE2的抗体，通过PAGE和免疫印迹检测所得蛋白提取物。已知PsaD部分暴露于基质侧，而OEE2完全位于类囊体膜的腔侧。因此，OEE2和PsaD的主体预计会受到任何外部蛋白酶的保护。在蛋白质水解轻微影响OEE2蛋白并导致PsaD部分消化的条件下（75μg/ml V8），用HA抗体测定Stt7水平显著降低，证实激酶结构域位于膜的基质侧(图5A） ●●●●。Stt7-HA也获得了类似的结果（未公布的数据）。相反，当使用针对FLAG的抗体时，检测到更小的产物，表明Stt7的N末端位于类囊体膜的腔侧(图5A） ●●●●。类囊体膜的超声处理以及V8蛋白酶处理表明，与管腔蛋白OEE2一样，用FLAG抗体检测到的受保护片段的水平显著降低(图5A） ●●●●。超声波还导致Stt7的HA-tag降解增强，可能是因为在这些条件下，蛋白酶更容易接触到暴露在基质中的激酶结构域，和/或类囊体膜受损。相反，在有和没有超声处理的情况下，没有观察到PsaD的差异。

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图5

Stt7包含一个跨膜区，其N末端位于类胸腺内腔

（A） 含有FLAG-Stt7-HA的菌株的类囊体膜在室温下经受V8蛋白酶浓度的增加，经受PAGE，并用HA、FLAG、PsaD和OEE2抗体进行免疫印迹。星号（*）表示FLAG抗血清中显示的Stt7降解产物。

（B） 使用泛素的C末端半（Cub）与Stt7的N或C末端融合，以及ER蛋白Alg5在其C末端与泛素的N末端半（Nub）融合，进行泛素分裂分析。酵母菌落分别用10倍和两个5倍连续稀释液涂布在允许（-L-W）和选择性（-Ade-H-L-W”）培养基上。

用酵母分裂-泛素系统进一步测试Stt7的取向[26]. 泛素（Cub）的C末端片段融合到Stt7的N末端或C末端，并与融合到内质网（ER）蛋白Alg5的C末端的泛素（Nub）的N末端一起在酵母中表达，后者将Nub放置在膜的细胞质侧。泛素只与Cub融合到Stt7的C末端的结构体重组，而与N末端融合时没有重组(图5B） ●●●●。由于膜蛋白通常与其管腔结构域一起插入酵母的周质空间，因此双杂交结果与蛋白酶保护研究得出的Stt7拓扑结构完全一致。

Stt7在状态1条件下不太丰富

一个显著的特点是，州1的Stt7水平显著低于州2。通过状态2–状态1时间过程实验对此进行了进一步研究(图2). 在从状态2转换到状态1条件后的2小时内，Stt7的水平下降到状态2水平的四分之一。在状态1下4小时后，Stt7的水平进一步下降至状态2水平的2%-5%，表明Stt7在长期状态1条件下不稳定。因此，Stt7在其活跃的条件下更加丰富和稳定。在状态1条件下，可以通过向完整细胞添加Cys蛋白酶抑制剂来阻止Stt7的降低。因此，在状态2条件下，Stt7可能因翻译后修饰（例如磷酸化）或与其他蛋白质的结合而受到蛋白酶的保护。虽然在叶绿体中存在半胱氨酸蛋白酶的实验证据很弱，但不能排除它们的存在及其在Stt7转换中的作用。这一过程可能涉及其他蛋白酶，如FtsH和Deg蛋白酶，这些蛋白酶已知可降解类囊体膜蛋白[28]. 一些Deg蛋白酶确实对NEM敏感[29].

我们注意到Stt7只有在状态1中持续一段时间后才会降低，而状态转换是在几分钟内发生的短期适应反应。因此，控制Stt7水平可能是长期适应反应的一部分。确实有证据表明拟南芥在这样的过程中[30].

强光下Stt7水平降低

强光下Stt7水平降低。在相同条件下，PSII水平保持不变。在陆地植物中，已知LHCII激酶在强光下通过铁氧还蛋白-硫氧还蛋白系统失活[31]. 因此，可以想象，当激酶长时间处于非活性状态（由状态1条件或强光诱导）时，其稳定性较差。尽管质体醌池的氧化还原状态对激酶的激活至关重要，但它并不仅仅决定Stt7的水平。在状态1条件下，plastoquinone池被氧化，而在强光下预计会被还原。

Stt7与细胞色素相互作用b条 ₆ （f）复合物、LHCII和PSI

Stt7与细胞色素的密切相互作用b条 ₆ （f）从共免疫沉淀结果可以明显看出复合物。已知该复合物在从状态1到状态2的转换过程中对激酶的激活起着关键作用[32]. 细胞色素缺陷突变体b条 ₆ （f）复合物不能磷酸化LHCII并被阻断在状态1[32].

原始状态转换模型假设，通过细胞色素激活Stt7激酶b条 ₆ （f）复合物，激酶从复合物中释放出来磷酸化LHCII。然而，我们发现Stt7激酶与细胞色素的结合b条 ₆ （f）复合物在状态1和状态2之间没有明显变化。一种可能是另一个下游激酶被Stt7磷酸化，进而磷酸化LHCII。或者，Stt7激酶可能是包含细胞色素的大型超复合物的一部分b条 ₆ （f）复合物和PSII-LHCII复合物。我们还无法检测到这种复合物，尽管它们可能只是暂时形成的。的PetO亚单位C.莱因哈迪b ₆ （f）已知复合物在状态转换期间被磷酸化[33]. 尽管进行了几次尝试，但基于共免疫沉淀或酵母双杂交筛选，我们无法检测到Stt7和PetO之间的任何相互作用。PetO的磷酸化是否依赖于Stt7还有待观察。

确定细胞色素的哪个亚单位b条 ₆ （f）进行了与Stt7相互作用的复合物下拉实验。Rieske蛋白被鉴定为一种相互作用物(图4B） ●●●●。基于线粒体的结构研究公元前1和叶绿体b条 ₆ （f）复合物，Qo位点质体醌与细胞色素之间的电子转移（f）（周期（f）)由Rieske蛋白介导，当质醇占据Qo位点时，Rieske蛋白质从近端位置移动到Qo位点未被占据时的远端位置[25,34,35]. 有人认为，Rieske蛋白的这种动态行为可能与Stt7激酶的激活有关[36–38]. 这种动态模型与Stt7激酶的低丰度相一致，其与细胞色素的摩尔比为1:20b条 ₆ （f）本研究中发现的复合物。假设一个细胞色素b条 ₆ （f）每个PSII反应中心一个PSII核心复合物和平均十个LHCII蛋白的复合物[39]Stt7激酶与LHCII蛋白的摩尔比可以估计为1:200。乍一看，该激酶必须磷酸化几个LHCII底物，并可能经历多轮激活。有可能Stt7激酶首先作用于位于基粒边缘的LHCII，并且这种磷酸化诱导类囊体膜的广泛重塑，最近有报道称，类囊体的状态转换发生在拟南芥[19]. 这些变化可能有助于Stt7进入颗粒核心的LHCII。另外，在状态2条件下观察到的强烈LHCII磷酸化可能是由于PSII-LHCII超复合体在基粒核心和基粒边缘的非常灵活的运动。

细胞色素的有趣成分b条 ₆ （f）复合物是其单一叶绿素一其氯环位于PetD亚基的螺旋F和G之间的分子，而植酸链在Qo位点附近突出[25]. 有趣的是，突变体影响叶绿素结合位点一除了细胞色素减少b条 ₆ （f）营业额，也显示从状态1到状态2的转换速度下降[36]. 因此，该区域可能是Stt7 N末端区域的相互作用位点，也可能作为质体醌在Qo位点存在的传感器，并通过叶绿素启动信号通路一分子朝向类囊体膜基质侧Stt7的催化结构域。

共免疫沉淀实验表明，在状态1和状态2条件下，Stt7在大多数情况下与LHCII相关。LHCII可能是Stt7的直接底物，或者Stt7可能是多激酶复合物的一部分，最终磷酸化LHCII。CP29在状态1和状态2之间的共免疫沉淀中观察到唯一显著差异(图3). CP29特别有趣。首先，该单体LHCII与CP26和Lhcbm5被提议作为LHCII三聚体和二聚PSII反应中心之间的连接物，用于传递激发能[11,39–41]. 第二，在从状态1过渡到状态2的过程中，CP29会发生过度磷酸化：除了在状态1中磷酸化的Thr6和Thr32外，Thr16和Ser102在状态2中磷酸化[10,42]. 第三，缺乏CP29的PSII-LHCII配合物的电子显微镜（EM）分析无法区分C2S2和PSII单体配合物[39]. 第四，在主要进行循环电子流的玉米束鞘细胞中，剩下的少量PSII复合物是单体的[43]. 综上所述，这些结果增加了CP29在状态2下的磷酸化可能作为循环电子流的开关，CP29从PSII及其单体化中分离出来。

共免疫沉淀实验也揭示了Stt7与PSI复合物的相互作用。这一发现令人惊讶，因为人们预计该激酶作用于与PSII结合的LHCII，并且不会与PSI相互作用。然而，在LHCII磷酸化后，PSI-LHCI复合物从基质片层向基粒边缘的移动发生在陆地植物中，并且有人提出，通过PSI-LHCI与源自基粒的磷酸化LHCII的相互作用，PSI吸收横截面在该区域增加[44]. 颗粒边缘可能是Stt7与PSI相互作用的观察平台。当激酶与PSI结合时，它是活性的还是非活性的尚不清楚，这种关联的作用仍有待确定。

Stt7标签。

Stt7-HA由插入Stt7的C末端的HA表位YPYDVPDYA的六个拷贝组成。该HA标签的分子质量为8.4 kDa，Stt7-HA的分子质量是85 kDa。与Stt7-HA相比，FLAG-Stt7-HA还包含插入Stt7的41个氨基酸转运肽后的分子量为3 kDa的FLAG标签RDYKDHDYKDHDIDYKDDDDKS。

状态1和状态2类囊体膜的分析。

培养物在TAP培养基中生长，密度为2×10⁶细胞/ml。细胞随后在HSM培养基中浓缩10倍。状态1由10个培养细胞诱导⁻⁵弱光（10μmol M）下的M DCMU（3-（3,4-二氯苯基）-1,1-二甲基脲）⁻²秒⁻¹)在强通气条件下，通过在黑暗中厌氧条件下培养细胞获得状态2。细胞在6000克10分钟，并以10的密度重新悬浮在缓冲液中⁸细胞/ml，并在1200 psi的法国压力下破碎。按说明制备类囊体膜（0.8 mg/ml）[11]并用0.9%n-十二烷基-β-麦芽糖苷在冰中溶解30分钟，然后在蔗糖密度梯度上分层0.5 ml（0.1–1.3 M蔗糖溶于5 mM Tricine-NaOH[pH8.0]，0.05%n-十二酰-β-麦芽糖苷），并在280000下离心克在SW40贝克曼转子中搅拌16小时。离心后，梯度被分成18个部分，通过SDS/PAGE和免疫印迹分析。使用的抗体针对HA、FLAG、Cyt（f）、PsaA、D1、CP26、CP29、Lhcbm5和P-Thr。

状态转换期间的蛋白质稳定性测量。

培养物在TAP培养基中生长，密度为2×10⁶细胞/ml。在10倍浓度后，细胞在HSM培养基中在黑暗厌氧条件下培养2小时。然后细胞在状态2条件下保持或在弱光下强曝气培养（状态1条件）。在某些情况下，在状态1条件开始之前添加环己酰亚胺（10μg/ml）或蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）（2倍制造商建议的浓度）。

荧光测量。

使用Jasco FP-750荧光光谱仪记录叶绿素荧光发射光谱，使用浓度为10的完整细胞⁶在液氮中冷冻的细胞/ml。激发光具有435nm的波长，并且从650至800nm检测到发射。在室温下用Hansatech PAM荧光计进行Fv和Fmax测量。

状态转换期间磷酸化蛋白质的免疫印迹分析。

从状态1或状态2的细胞中分离的类囊体膜蛋白质在15%的SDS-聚丙烯酰胺6 M尿素凝胶上分离，并转移到硝化纤维素膜。用牛血清白蛋白封闭膜，并用兔抗磷脂苏氨酸抗体孵育（细胞信号技术）。

免疫沉淀和下拉实验。

用n-十二烷基-β-麦芽糖苷在冰中溶解类囊体膜（0.8 mg/ml）30分钟，并在12000℃离心去除不溶解物质克在4°C下保持10分钟。将50微升的抗-HA亲和性基质添加到0.3 mg的溶解膜叶绿素中，并在4°C下培养过夜。将小球在TBS-BSA（100 mM Tris/HCl[pH7.5]，150 mM NaCl，0.05%BSA）中洗涤五次，并在40μl 2×SDS负载缓冲液（100 mM-Tris/HCl[pH6.8]，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油）中在室温下洗脱结合蛋白30 min。免疫沉淀蛋白用抗光合作用复合物亚单位抗体进行免疫印迹分析。

在pGEX-4T-1表达载体（Amersham Pharmacia Biotech）中克隆了全长Stt7 cDNA。蛋白质表达于大肠杆菌GST融合并用GST融合系统试剂盒（Amersham Pharmacia Biotech）纯化。将两微克GST融合蛋白固定在谷胱甘肽Sepharose 4B珠上（在4°C下培养2小时），并与50μg可溶性类囊体提取物混合在0.5 ml PBS中。在4°C下在旋转摇床上培养过夜后，用相同的缓冲液将珠洗四次，在30μl SDS凝胶负载缓冲液（100 mM DTT，2%SDS）中重新悬浮，用SDS-PAGE对洗脱液进行分级。

类囊体膜的蛋白质水解。

在50 mM Hepes（pH 7.4）和0.3 M蔗糖中清洗类囊体三次[49]无蛋白酶抑制剂并在NH中重新悬浮₄HCO公司_三25 mM。样品在水浴式声波发生器中进行声波处理，声波处理时间为1分钟，冷却时间为30秒，共五次。在室温下，将指示浓度的内皮蛋白酶GLU-C（Sigma）以0.3 mg/ml的叶绿素浓度添加到类囊体膜中15分钟。通过TCA沉淀阻止消化，并将样品重新悬浮在含有8 M尿素的1×负载缓冲液中。通过SDS-PAGE和免疫印迹法对样品进行进一步分析。

细胞色素的分离b条 ₆ （f）复杂。

所有步骤均在4°C下进行，在所有缓冲液中使用1 mM AEBSF（罗氏）作为蛋白酶抑制剂。在用0.9%n-十二烷基-β-麦芽糖苷溶解后，640μg类囊体膜（叶绿素当量）与Ni-NTA基质（Qiagen）在200 mM NaCl和10 mM咪唑存在下孵育2 h。在洗涤缓冲液（TBS，200 mM NaCl，20 mM咪唑）中洗涤基质五次，并在2×1 ml洗脱缓冲液（TB S，250 mM NaCl，300 mM咪唑啉）中洗脱结合蛋白。用抗光合作用复合物亚单位抗体的免疫印迹法分析洗脱的蛋白质。

我们感谢N.Roggli的艺术品，Stefano Cazzaniga的技术援助，Michel Schneider的生物信息分析，F.-A.Wollman的细胞色素（f）、亚单位V、Rieske antisra和M.Goldschmidt-Clermont，用于批判性阅读手稿。