体瘤抑制小鼠模型中来源于神经干/祖细胞的恶性星形细胞瘤

浸润和自发分化的致癌细胞

存在R26-lacZ公司在漂浮的肿瘤抑制因子的背景下，记者可以在细胞发生致瘤转化时进行细胞谱系追踪。而正常神经干细胞及其后代主要局限于SVZ-RMS-OB和SGZ-GL(图1B)，如X-gal染色所示，在邻近的大脑区域，包括皮层和纹状体，发现了由诱导型突变小鼠引起的肿瘤(图2A). cre转基因在小脑中表达，但在小脑中只发现一个肿瘤，它类似于星形细胞瘤，而不是髓母细胞瘤，髓母细胞瘤是该脑区的独特型肿瘤。β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞与星形细胞瘤标志物Gfap、nestin和血小板衍生生长因子α（PDGFRα；图2A). 因此，突变干细胞或其子代在肿瘤发展过程中从正常的生态位迁移并侵入实质。

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图2

肿瘤发生过程中癌细胞的浸润和分化

A.β-半乳糖苷酶阳性突变细胞渗入邻近的大脑结构，远离正常的神经干/祖细胞生态位。一个典型的X-染色脑肿瘤切片来自嵌套-核心^T2段;1号机组^{弗洛克斯/+};第53页^{flox/flox公司};铂族^{弗洛克斯/+};R26-lacZ公司抑癌基因失活8个月后，小鼠在SVZ/SGZ小生境中的原始位置以外发现肿瘤细胞（与之相比图1B). β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞表达Gfap、nestin和PDGFRα，发现于前脑的其他部位，如皮层和纹状体。在肿瘤中发现有标记的星形细胞瘤细胞表达多谱系标记物。诱导突变小鼠的β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞，如图所示，在丘脑中表达神经元（Tuj1）和胶质细胞（S100β和APC）分化标记。Toto-3标记细胞核。

星形细胞瘤是一种异质性肿瘤，具有不同的细胞形态，并且存在所有神经谱系的未成熟和成熟标记物。在检查肿瘤体积时，我们发现多种β-半乳糖苷酶阳性细胞共同表达分化细胞亚群的标记物，如神经元标记物Tuj1、胶质标记物S100β和腺瘤性息肉病大肠杆菌或APC，如图2B这些免疫反应性肿瘤细胞在形态上与成熟神经元、星形胶质细胞和髓鞘少突胶质细胞相似。与表现出丰富Pten表达的正常CNS细胞相比(Kwon等人，2008年)，这些标记阳性细胞为铂阴性(补充图2C)证实这些“分化”细胞确实是癌细胞。这些数据提供了正式证据，证明肿瘤细胞具有干/祖细胞退出细胞周期的能力，至少可以部分分化就地这可能解释了与高级别星形细胞瘤典型相关的肿瘤细胞类型的异质性。

立体定向病毒介导SVZ靶向诱导星形细胞瘤形成

作为一种将cre重组酶靶向SVZ神经原性生态位的独立方法，我们采用了立体定向注射方法。许多研究使用立体定向靶向技术，通过将染料、生长因子或病毒颗粒直接送入SVZ来研究神经干细胞的功能、谱系和特性(Doetsch等人，1999年;Merkle等人，2007年;Merkle等人，2004年;Yoon等人，1996年). 将表达cre重组酶的腺病毒注射入猪的SVZR26-lacZ公司报告小鼠单独在SVZ及其后代中产生标记的神经干细胞，因为它们穿过RMS并进入OB(图3A，右侧面板）。相反，将cre腺病毒注射到非神经原性区域，如皮层或纹状体，只在注射区域引起局部标记，而在RMS或OB中没有标记(图3A，左侧面板）。在这两种情况下，沿针道也可以发现限制性染色。

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图3

立体定向病毒介导的靶向SVZ诱导星形细胞瘤的形成，而靶向非神经原性区域则不会

A.病毒cre注射实验示意图和典型的X-gal染色图像。对，cre腺病毒靶向的SVZR26-lacZ公司报告小鼠在RMS（箭头）和OB中标记神经干/祖细胞及其后代。左图，将cre病毒注射到非神经原性区域，如纹状体，会在注射部位引起局部标记，但在RMS或OB处没有标记。比例尺，2毫米B.SVZ靶向突变小鼠发展为组织学可识别的高级星形细胞瘤。将Cre腺病毒立体定向注射到抑癌小鼠的SVZ中(1号机组^{flox/flox公司};第53页^{flox/flox公司},1号机组^{flox/flox公司};第53页^flox/−或1号机组^{弗洛克斯/+};第53页^{flox/flox公司};铂族^{弗洛克斯/+}). 通过H&E染色对注射的小鼠大脑进行分析，发现SVZ注射的突变小鼠（cre→SVZ）中存在浸润性肿瘤细胞，而注射到其他非神经原性脑区的小鼠不会发生肿瘤（cre？other）。SVZ靶向突变小鼠的肿瘤表现出高级星形细胞瘤的典型组织病理学特征，包括肿瘤（T）侵入正常（非肿瘤，NT）区域、核异型性和有丝分裂（箭头）、微血管增殖（MP）和坏死（N）。比例尺，200μm。C.SVZ靶向肿瘤抑制小鼠的肿瘤R26-lacZ公司报告者显示星形细胞瘤相关标记物Ki67、Gfap和nestin的特征性表达。比例尺，200μm。

我们将cre腺病毒注射到三种抑癌小鼠的SVZ中(1号机组^{flox/flox公司};第53页^{flox/flox公司},1号机组^{flox/flox公司};第53页^flox/−，或1号机组^{弗洛克斯/+};p53基因^{flox/flox公司};铂族^{弗洛克斯/+})出生后1-2天或成年（4-8周）。我们发现，在出生后早期和成年时，SVZ中病毒C介导的肿瘤抑制因子失活都会诱导星形细胞瘤的形成(图3,表1). 注射突变小鼠在注射后6个月开始发生III级或IV级星形细胞瘤(补充图3A，补充表2). 这些肿瘤表现出高级星形细胞瘤的组织病理学特征，包括弥漫浸润、核异型性、有丝分裂、微血管增生和坏死(图3B)与我们之前的研究没有区别(Kwon等人，2008年;Zhu等人，2005a). 肿瘤对Ki67、Gfap和nestin呈免疫反应(图3C)以及Olig2、pErk和pAkt(补充图3B). 我们进一步通过β-半乳糖苷酶免疫染色证实肿瘤发生了cre重组(图3C). 这些研究中的内部控制和验证是后部验证计划注入SVZ导致拉奇SVZ-RMS-OB轴的谱系追踪。我们观察到，只有成功的SVZ-RMS-OB靶向注射，肿瘤体、SVZ和嗅球的X-gal染色证明了这一点(图4A)以及β-半乳糖苷酶免疫组化（数据未显示）生成星形细胞瘤。我们还通过PCR基因分型证实了肿瘤中肿瘤抑制等位基因的丢失(图4A).

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图4

SVZ靶向突变小鼠产生的肿瘤显示浸润和自发分化

A.出生后早期和成年时，将cre腺病毒靶向SVZ的突变小鼠的代表性X-gal染色脑切片显示大量肿瘤形成，脑实质内肿瘤细胞广泛浸润和迁移，以及SVZ-RMS-OB轴的标记。分离出LacZ阳性肿瘤（T）和LacZ阴性非肿瘤（NT）区域进行PCR基因分型，这表明肿瘤抑制因子的重组增加，在本例中，flox1号机组肿瘤中的等位基因（G=尾部基因组DNA，F=漂浮，Δ=重组，+=WT=野生型等位基因）。靶向纹状体等非神经原性区域的小鼠脑切片显示，注射部位和针道有局部染色，但没有肿瘤形成。对lacZ阳性（lacZ+）和lacZ阴性（lacZ−）区域的PCR基因分型证实了lacZ＋样本中漂浮等位基因的成功重组。比例尺，2毫米C。来自注入病毒的突变大脑的肿瘤细胞表现出多谱系分化。SVZ靶向抑癌小鼠高级别星形细胞瘤的代表性免疫染色图像R26-lacZ报告人在出生后早期和成年时注射显示成熟分化标记物在β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞亚群中的表达，包括星形胶质细胞的Gfap、少突胶质细胞的髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经元的NeuN。肿瘤体积内的大多数标记阳性细胞，在本例中为NeuN阳性细胞，也是Pten阴性细胞。皮质附近少数β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞的钙结合蛋白呈阳性，钙结合蛋白是来源于SVZ神经干/祖细胞的分化OB神经元亚群的标记物。比例尺，200μm。插图显示β-半乳糖苷酶/钙结合蛋白双阳性细胞。比例尺，10μm。

与巢蛋白诱导的突变小鼠相似，肿瘤遍布大多数脑实质(图4A). 与成年注射突变小鼠相比，出生后早期注射突变小鼠似乎发展出更广泛的肿瘤，后者发展出更局限的，尽管仍具有侵袭性的高级别星形细胞瘤。远离SVZ的肿瘤，如皮层、海马体和丘脑中的肿瘤，清楚地证明了肿瘤的迁移。在这两个病例中，我们发现肿瘤区域以及SVZ-RMS-OB中的X-gal染色很强(图4A).

如三苯氧胺诱导的肿瘤所述，β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞具有分化CNS细胞的形态学特征，并表达成熟标记物，包括星形细胞标记物Gfap、少突胶质细胞标记物髓鞘碱性蛋白（MBP）和神经元标记物NeuN(图4C). 作为确认这些标记阳性细胞确实是肿瘤细胞的一种独立方法，我们对这些肿瘤进行了Pten染色，这在高级别星形细胞瘤中经常受到抑制。我们发现这些“分化”的细胞中有许多是Pten阴性的(图4C). 我们还发现皮质附近有罕见的表达钙结合蛋白的β-半乳糖苷酶阳性肿瘤细胞(图4C)，通常由SVZ神经干/祖细胞产生的OB神经元子集表达(Merkle等人，2007年). 这些数据表明，致癌细胞或其后代有能力在肿瘤发展过程中迁移至整个实质、种子肿瘤，并产生分化的细胞类型。

病毒介导的靶向成人非神经原性脑区不会诱导肿瘤形成

上述结果表明，SVZ中的祖细胞具有引起星形细胞瘤的能力。然而，这些研究并不排除额外的实质细胞也可能具有这种能力，或者肿瘤可能是由沿着注射路径感染cre腺病毒的少数细胞引起的。以前的研究，使用其他实验系统，包括在体外操纵或致癌转化，表明成熟的星形胶质细胞也能引起胶质瘤(Bachoo等人，2002年;Dai等人，2001年;Uhrbom等人，2002年). 为了靶向SVZ外的细胞（包括星形胶质细胞）灭活肿瘤抑制因子体内，我们将cre腺病毒立体定向注射到20只4至8周龄的成年抑癌小鼠的皮层或纹状体中，同时注射SVZ。与成功注射SVZ（100%的小鼠发生肿瘤）相反，在皮层或纹状体注射的动物中没有一只有肿瘤形成的证据(图3B,表1)尽管X-gal染色和PCR基因分型证明了成功感染cre腺病毒的明确证据(图4B)或β-半乳糖苷酶免疫组化(补充图4). H&E染色显示注射部位的皮质或纹状体结构紊乱(图3B)免疫染色显示存在Gfap阳性但Ki67阴性的细胞(补充图4)表明纤维化和星形胶质细胞增生(Zhu等人，2005年b). 注射部位附近的细胞同样巢蛋白和波形蛋白染色阳性(补充图4)与反应性星形细胞增多症一致(Correa-Cerro和Mandell，2007年;Sofroniew，2005年)，与GFP腺病毒注射对照脑相似的表型（数据未显示）。

非SVZ区域也针对出生后早期，这些小鼠中的大多数不会发展成胶质瘤(表1). 然而，我们确实发现了十二分之一的非SVZ靶向新生小鼠在注射后7个月发生肿瘤。这与先前关于出生后早期脑细胞致癌转化的报道一致。非SVZ注射突变小鼠肿瘤诱导的罕见性与出生后早期仍存在的皮质或纹状体神经前体细胞的罕见靶向性一致(Seaberg等人，2005年)或者，罕见的放射状胶质细胞靶向投射到实质中，是SVZ成体干细胞的祖细胞(Merkle等人，2007年). 总的来说，这些数据表明，尽管靶向SVZ神经干/祖细胞的肿瘤抑制因子容易诱导高级别星形细胞瘤的形成，但通过本研究中评估的肿瘤抑制突变，分化程度较高的细胞类型不太容易发生恶性转化。

恶性星形细胞瘤中的肿瘤干细胞

一些或多种形式的癌症可能由肿瘤增殖细胞的一个子集和不能增殖肿瘤的另一个子集组成的概念最近受到了越来越多的关注(Reya等人，2001年). Dirks及其同事最初表明，人类GBM异种移植到免疫缺陷小鼠体内有一种可识别的致癌细胞亚群或“癌症干细胞”(Singh等人，2004年). 因此，癌症干细胞的技术定义是体内连续移植的肿瘤起始能力，并依赖于这些自我更新细胞的回顾性分离(Dalerba等人，2007年). 因此，有理由认为这些癌症干细胞与干细胞具有共同的特征，但是否正常的干细胞是这些肿瘤的起源细胞，有待实验建立。我们的数据最终表明，正常的神经干/祖细胞是致癌细胞，并容易引起高级别星形细胞瘤。

肿瘤干/祖细胞异常迁移和分化体内

星形细胞瘤因其浸润能力而臭名昭著，这一特性在临床上妨碍了完整的手术切除。我们在这里表明，与严格限制在SVZ或SGZ的正常成人神经干细胞相比，这些细胞或其后代产生的肿瘤并不局限于这些龛位，而是从其正常位置迁移出去，从而解释了前脑其他部位包括皮层存在肿瘤的原因，纹状体、海马和丘脑。这也可以解释肿瘤在以下区域的存在：hGFAP-核心转基因在条件突变小鼠模型中不表达(Kwon等人，2008年;Zhu等人，2005a). 人类星形细胞瘤的另一个明显特征是这些肿瘤内细胞类型的异质性。由于其浸润性，一种解释是存在“多样性”非肿瘤细胞并被肿瘤细胞包围。这种情况在某种程度上可能是这样的，因为原发性肿瘤组织的基因分型会产生微弱的野生型或非重组带(图4A而大多数表达成熟分化标记的细胞是β-半乳糖苷酶阴性的(图2B,​，4C），4厘米)表明正常细胞被困在肿瘤体内。另一种选择是肿瘤本身具有肿瘤衍生细胞的异质成分。这一替代方案得到了几条证据的间接支持，包括在体外向免疫缺陷小鼠进行分化和异种移植。然而，直接证明现场，原发肿瘤是异质性的一直缺乏。小鼠遗传学的力量允许在cre依赖性lacZ报告基因转基因的背景下，神经干/祖细胞室特异性肿瘤抑制因子失活。因此，通过对lacZ阳性和Pten阴性肿瘤细胞的形态学评估，结合血统特异性标记物的标记，我们发现肿瘤衍生细胞的一个子集具有星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的特性。我们甚至发现一种罕见的lacZ阳性肿瘤细胞亚群表达钙结合蛋白，钙结合蛋白通常由SVZ神经干细胞/祖细胞产生的OB神经元亚群表达，这表明这些致癌干细胞/前体细胞的分化能力在肿瘤发展过程中得以保留。

单个肿瘤细胞之间以及不同个体肿瘤之间的分化程度是不同的。然而，由于这些“成熟”细胞可能代表较低侵袭性的肿瘤细胞群体，这一观察结果表明，分化治疗可能提供了一种可行的方法来阻止肿瘤生长，同时避免杀死旁观者正常细胞。总之，星形细胞瘤的临床相关迁移和分化能力与此处发现的神经干/祖细胞来源非常吻合。

小鼠和人胶质瘤的起源细胞

其他星形细胞瘤小鼠模型使用致癌过度表达和/或肿瘤抑制因子失活的组合来诱导肿瘤形成。一些报告表明，nestin启动子驱动的肿瘤发生在出生后早期可导致星形细胞瘤，而GFAP启动子驱动肿瘤发生根据起始突变降低外显率(Holland等人，2000年;Uhrbom等人，2002年). 这些研究中的肿瘤细胞来源是推断出来的，但没有直接检查。体外培养的神经干细胞或新生星形胶质细胞扩增后移植到免疫缺陷小鼠体内也会导致星形细胞瘤(Bachoo等人，2002年;Dai等人，2001年). 因此，到目前为止，靶向转化的细胞来源于胚胎或出生后早期的脑细胞。此外，我体外试验建立致瘤性的操作同样存在问题，因为细胞培养明显改变了细胞的正常生物学行为。使用致癌突变的研究也可能提供激活致癌基因的超生理水平。根据目前的研究，我们认为这些小鼠模型可能以胚胎新生儿大脑中存在的前体细胞，其区别在于我们的模型同样针对这些前体细胞成人干/祖细胞并诱导高级别星形细胞瘤，同时抑制因子失活。另一方面，癌症基因组图谱项目描述了表皮生长因子受体受体突变与NF1型胶质瘤的突变。因此，神经干/祖细胞的其他突变也可能导致胶质瘤，或者具有不同遗传特征的胶质瘤可能起源于不同的细胞亚型。发现SVZ含有一组不同的神经干细胞，可产生特定的祖细胞亚型(Merkle等人，2007年)提供了一些线索。这些异质性干细胞群体是否易受相同突变的影响，或产生不同的肿瘤亚型，还有待研究。本文描述的实验方法将有助于使用GBM特征突变或通路确定其他模型的起源细胞。

三苯氧胺诱导

抑癌剂用牙线将含有嵌套-核心^T2段将转基因小鼠腹腔内注射工作浓度为6.7 mg/mL的载体（9:1，葵花籽油：乙醇混合物）（西格玛）或三苯氧胺（西格马）。怀孕妈妈在E13.5时注射1 mg三苯氧酚，而4周龄小鼠则连续5天每天两次注射83.8 mg/kg三苯氧芬(Chen等人，出版).

腺病毒注射

如文献中所述，对4-8周龄或出生后1-2天的抑癌小鼠进行cre-或GFP表达腺病毒注射(Doetsch等人，1999年;Merkle等人，2004年)进行了一些修改。200 nL腺病毒（Ad-Cre，2.0×10¹²pfu/mL，爱荷华大学矢量核心；Ad-GFP，1.0×10¹¹pfu/mL），根据以下坐标-SVZ（0，1.4，1.6；0.5，1.1，1.7；和1，1，2.3），皮层（0，3.5，1.5）和纹状体（0，1.4,2.6）mm，位于前角前部、侧面和背部。对于出生后早期注射，如前所述，在出生后第1天或第2天向幼鼠注射40 nL Ad-Cre或Ad-GFP(Merkle等人，2004年)进行了一些修改。使用了以下新生儿体重范围的坐标：1.4–1.5g（1.5、2.6、1.4）；1.5–1.7克（1.6、2.7、1.4）；1.7–1.9克（1.7、2.9、1.5）；>前角前部、侧面和背部1.9g（1.7、2.9、1.7）mm。跟踪所有注射病毒和他莫昔芬的小鼠，观察其神经系统异常情况，并进行组织学分析。

组织学和肿瘤分析

用4%多聚甲醛对小鼠进行灌注和固定。切取5μm切片，每5张切片用H&E染色。大脑切片由S.A.L.和J.C.以及D.K.B.（一位注册神经病学家）独立检查，肿瘤诊断根据世界卫生组织标准确定(Kleihues等人，2002年). 用于X-gal染色的大脑在2%PFA中固定过夜。半个大脑或50μm振动切片在X-gal溶液中染色，切片用核固红复染，如前所述(Luikart等人，2005年). 在某些情况下，用X-gal染色的一半大脑随后被处理并用于免疫组织化学。如前所述，对于PCR基因分型，使用肿瘤和非肿瘤组织进行DNA提取和PCR(Kwon等人，2008年).

免疫组织化学

石蜡切片脱蜡，再水化，并进行基于柠檬酸的抗原检索。以下主要抗体的使用如下：Gfap（DAKO，1:1000；BD Biosciences，1:200），Ki67（Novocastra，1:100），nestin（BD Biosciences），Olig2（Chemicon，1:1000），β-gal（ICN，1:1000，pERK（细胞信号传导，1:400）、pAKT（细胞信号传导，1:100）、Pten（细胞信号传导，1:100）和PDGFRα（Spring，1:50）。我们使用了使用Cy2、Cy3或Cy5（Jackson Labs，1:400）和生物素-链霉亲和素-Alexa荧光结合二级抗体（分子探针，1:1000）的免疫荧光染色，以及基于辣根过氧化物酶的Vectastain ABC试剂盒（Vector Lab）。使用光学显微镜、荧光显微镜和共焦显微镜（奥林巴斯和蔡司）检查切片。

作者感谢Linda McClellan、Steven McKinnon、Alicia Deshaw、Shawna Kennedy、Jerry Chandler和Patsy Leake提供的技术援助，以及Parada实验室成员，特别是Renee McKay提供的有益建议和讨论。腺病毒由爱荷华大学病毒中心提供。这项工作得到了s.A.L.儿童肿瘤基金会青年研究员奖、美国脑瘤协会基础研究奖学金（纪念Daniel J.Martinelli和Geoffrey J.Cunningham）以及NIH（5P50NS052606）、DAMD（W81XWH-05-1-0265）和ACS（RP0408401）对L.F.P.的拨款的部分支持。L.F.P.是美国癌症学会研究教授。