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神经科学方法杂志。作者手稿；PMC 2010年4月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经科学方法杂志。2009年4月15日；178(2): 323–326.
2008年12月27日在线发布。 doi（操作界面）：2016年10月10日/j.pneumeth.2008.12.021
PMCID公司：项目经理2649987
NIHMSID公司：NIHMS85015标准
PMID：19150629

使用EthoVision软件对恐惧相关行为进行自动评分

乔恩·范,1 萨拉·卡布雷拉,1,2 卡尔斯·桑奇斯·塞古拉,1,三和马塞洛·A·伍德1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

恐惧条件反射是评估啮齿动物学习和记忆的常用范式。传统上，研究人员依赖于人类观察对恐惧相关行为的评分，这可能是困难和主观的，因此研究人员之间存在差异。本研究的目的是评估EthoVision跟踪软件（Noldus Information Technology，Inc.）对小鼠恐惧相关行为进行可靠和准确评分的能力。具体来说，我们对它在情境和线索恐惧条件作用期间准确追踪老鼠并将静止作为恐惧相关行为评分的能力感兴趣。在装有网格地板的改良PhenoTyper腔室（Noldus Information Technology，Inc.）中进行情境和线索恐惧调节，以提供惊扰性足部电击。我们的结果表明，我们已经确定了EthoVision中的参数，这些参数可以准确跟踪小鼠，并用于对静止不动进行自动评分，这与人类观察的评分几乎相同。EthoVision软件和改进的PhenoTyper腔室共同提供了一个优秀的系统，以高吞吐量的方式可靠、准确地测量与恐惧相关的行为。

介绍

背景和线索恐惧条件反射是巴甫洛夫式或经典条件反射任务，动物在其中学习厌恶事件和预测厌恶事件的外部刺激之间的关系。恐惧条件反射被广泛用于在分子、细胞、系统和行为水平上研究学习和记忆的神经生物学（见Maren和Quirk，2004年). 我们的目标是研究EthoVision软件准确跟踪和测量受情境和线索恐惧条件作用的小鼠静止不动的能力。

由人类观察者测量与恐惧相关的行为可能很困难，尤其是当试图在大型实验中分析多个笼子的行为时。人类观察者对恐惧相关行为的主观测量也可能存在细微但显著的差异。这种可变性可能掩盖恐惧条件作用中的重要表现差异。此外，人类观察员评分非常耗时，不适合需要高通量分析的科学研究。最后，尽管人类评分是由盲人观察者进行的，但在某些情况下，不同的组很容易被识别（例如，当比较不同毛色的菌株时，药物治疗会导致行为、损伤等方面的明显变化），这损害了人类评分的客观性。由于使用人类观察者对行为进行评分的缺点，自动评分软件包的流行程度和数量迅速增加。因此，一些研究集中于利用自动评分软件来衡量这一范式中与恐惧相关的行为。在这项研究中，我们检查了一个商用且专门设计用于共同操作的硬件和软件包（PhenoTyper腔室和EthoVision软件；Noldus Information Technology，Inc.）是否可以用于测量恐惧相关行为。我们发现，当使用适当的配置时，EthoVision能够实现出色的跟踪质量，匹配人类对恐惧相关行为的评分，并且与改进的PhenoTyper室结合使用，可以用于对受到情境或线索恐惧条件作用的小鼠的静止不动进行可靠和精确的自动评分。这里报告了测量恐惧条件反射中每个相关识别参数的准确值。

材料和方法

动物

大多数实验中使用了在我们的动物设施中从Jackson Laboratories获得的雄性C57BL/6J小鼠。小鼠8-16周大，可以在家中自由获取食物和水。灯光维持在12:12小时的亮/暗周期，所有行为测试均在周期的亮部分进行。所有实验都是根据美国国家卫生研究院动物护理和使用指南进行的，并得到了加州大学欧文分校动物护理与使用委员会的批准。

实验仪器和软件

如前所述，使用一组四个改进的诺尔德斯PhenoTyper（3000型）室（弗吉尼亚州利斯堡）进行恐惧调节实验(Lattal等人，2007年). PhenoTyper 3000型试验箱的地板为30×30 cm，高度为40 cm。PhenoTyper室配备了一个顶部单元，包括一个红外LED灯矩阵和一个红外CCD摄像机，以及一个阻挡可见光的高通滤波器。笼子的地板经过改造，包括一个连接到电击发生器（电击扰频器ENV-414S；Med Associates，St.Alvans；VT）的不锈钢格栅（棒间间距：0.9 cm）。使用EthoVision 3.1软件进行自动跟踪和电击传递控制（EthoVision3.1；Noldus Information Technology，Leesburg，VA；Noldus等人，2001年;Spink等人，2001年; 看见http://www.noldus.com/ethovision网站有关EthoVision软件的其他参考和信息）。EthoVision软件是一个对比引擎，通过物体的阴影差异来识别物体。该程序对视频数据进行采样或截屏，并根据受试者和定义的场地之间的对比度差异计算受试者的面积，由每个像素的灰度值指定。检测方法本身可以配置为减法或灰度法。减法使用实验背景的参考图像（不包括受试者），通过从参考图像中减去实时视频数据来计算受试者所在的位置。这种方法适用于实验背景不经常变化的实验。灰度法使用明暗阈值来确定指定实验场地内的受试者。在我们的实验中，我们选择使用灰度缩放方法，因为它提供了最大的灵活性。

每个实验还使用视频捕获软件（Mediacruise、Canopus、San Jose、CA）记录为MPEG-4格式的视频文件。这使我们能够通过EthoVision 3.1软件运行MPEG视频，以优化用于为静止性评分的参数。参数包括：采样率（在结果部分详细描述）；处理和检测方法（灰度）；物体强度（物体总是比背景暗）；静止阈值（5%）；移动阈值强（95%）；迁移平均间隔（20）；腐蚀和膨胀过滤器（腐蚀1个像素，然后膨胀1个像素）。移动平均间隔将当前采样与前19个采样（设置为20时）平均，以调整假采样检测问题。冷冻行为也通过手进行评估(Fanselow，1980年). 冻结的定义是没有检测到运动，并由一名经验丰富的、对实验条件视而不见的单一观察者在整个会话长度内持续监测。

恐惧调节协议

连续处理小鼠三天，每天一分钟。情境和线索恐惧条件反射协议都包括一次条件反射，然后在24小时后进行记忆测试(Vecsey等人，2007年;Wood等人，2005年;Wood等人，2006年). 出于上下文恐惧，在条件反射过程中，将C57BL/6J小鼠放入条件反射室，并在放入条件反射室内2.5分钟、3.5分钟和4.5分钟后接受三次2秒0.75毫安的杂乱脚电击。5分钟后，将小鼠从试验箱中取出。在测试过程中，在没有电击的情况下，小鼠在相同条件下暴露5分钟。对于提示性恐惧条件反射，以与上下文恐惧条件反射相似的方式处理的C57BL/6J小鼠被放置在一个小室中，并在5分钟的条件反射试验中发出3次声音提示（位于PhenoTyper小室中的内置蜂鸣器）。蜂鸣器在放入试验箱后的2分钟、3分钟和4分钟被打开30秒。仅CS-only组只收到这3个声音提示。CS/US组受到相同的3个听觉提示，但每个提示都与2秒0.75毫安的脚电击同时终止（因此3个CS/US配对）。小鼠在首次放置到小室5分钟后被移出小室。第二天进行24小时保留试验。将小鼠引入一个新的环境中进行5分钟的试验（将相同的调节室改造为具有光滑平坦的地板、改变尺寸和新型气味）。恐惧测试在测试期间进行了两次单独的持续时间；前2分钟没有声音提示（Pre-CS），2分钟到5分钟有声音提示（CS）。对于情境和线索恐惧条件反射，EthoVision软件用于通过用户定义的变量控制电击周期/振幅、线索呈现（针对线索恐惧条件作用）和实验参数，如时间试验和测试区。

数据分析/解释

使用SPSS（MAC OS X 13.0版）对数据进行分析。大多数结果通过方差分析进行分析，必要时包括重复测量因子。各组之间的随访采用Student-Newman-Keuls进行多重比较，或在涉及与对照组进行一组比较的情况下，采用Dunnett的事后检验(Seaman等人，1991年).

通过Pearson相关指数和组内相关性评估自动和训练观察者冻结/条件恐惧评分之间的协方差和一致性(Shrut和Fleixx，1979年)和偏差系数（根据Bland-Altman图得出；布兰德和奥尔特曼，1986年)分别是。类内相关系数是一种欧米伽型统计，用于衡量评判者之间的信度，因为它估计了因组间差异而导致的数据方差比例。这是因为与皮尔逊相关性相反，皮尔逊相关性将感兴趣的变量建模为两个不同的特征，每个特征的平均值和方差分别估计（因此，两个变量都不共享其度量或方差），在组内相关性中，性状的均值和方差来自所有组所有成员的集合估计。因此，虽然皮尔逊给出了一对中两个成员之间的共享方差的比例，而不考虑组成员，但组内相关性给出了方差的比例与组差异有关，而不是与法官、法官x受试者交互作用或错误的差异有关(McGraw和Wong，1996年). 另一方面，当比较测量同一变量的两种不同方法时，Bland-Altman图是临床研究中使用的标准统计方法(McCluskey和Gaaliq，2007年)因为它既提供了两种方法之间的平均差异指数（偏差），也提供了对研究样本的单独处理

结果

在第一个实验中，目的是在EthoVision中建立参数，以准确地评分受情境恐惧条件作用影响的C57BL/6J小鼠的恐惧行为。为了对恐惧相关行为进行评分，我们在EthoVision上使用了移动性检测功能，该功能有一个较低的阈值来区分静止和移动性，以及一个较高的阈值来分离移动性和强移动性。将较低的阈值设置为5.0%，以对静止性进行评分，这意味着在当前样本和之前的样本之间，检测到的对象的像素变化不得超过5.0%（参见EthoVision 3.1参考手册第12.3.3节）。调整自动计分以匹配我们的手动计分的另一个重要因素是将平均间隔设置为20.0。平均间隔将平滑机动性参数，这意味着跟踪的潜在问题将被消除。

使用这些参数（在方法一节中有更详细的描述），我们研究了不同采样率对EthoVision软件提供的评分准确度的影响，并与经验丰富的人类观察者评估同一组小鼠的评分准确率进行了比较(图1). 采样率的增加导致冷冻评分的提高。通过方差分析（ANOVA）证实了这一效果，这在组间产生了显著差异（F(3,20)=17.0，p<0.0001）。根据Dunnett的事后比较，低到中等采样率（1个采样/6秒或1个采样/秒）导致对冻结的识别较差，即显著低于人类观察员提供的分数（p<0.01）。然而，当采样率提高到每秒6个样本时，自动评分和手动评分之间没有差异(图1A).

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使用EthoVision建立静止不动的自动评分

A） 小鼠接受情境恐惧条件反射，然后在条件反射环境中接受24小时记忆测试。保留测试持续5分钟，在此期间，使用EthoVision对静止状态进行评分，并与人类观察的评分进行比较。在保留测试期间生成MPEG视频，以便通过EthoVision多次运行，以优化参数以匹配人类观察所得的性能。采样率配置包括每6秒1个样品、每1秒1个样本和每秒钟6个样本。数值为平均值±SEM。

这些结果与手工取芯和EthoVision软件提供的分数之间的协方差增加一致，分数是采样率的函数（r=0.49，p=.41；r=0.81，p=0.05；r=0.96，p=0.003，分别对应于1个样本/6秒、1个样本/秒和6个样本/s）。然而，协变并不一定意味着一致，仅使用这种协变指数比较两种测量相同变量的方法可能会产生误导（即两种方法可以在样本受试者的相对分配中显示出明显的一致性，但在被测变量的总体估计中几乎没有一致性）因此，我们计算了在每个采样率下获得的冻结EthoVision软件分数与人类观察者获得的分数之间的组内相关性。我们再次观察到，增加采样率可以使EthoVision得分达到人类观察得分（组内相关指数分别为0.024，p=0.266；0.239，p=0.01；0.909，p=0.001，分别为1个样本/6秒，1个样本/秒，6个样本/秒钟）。最后，我们构造了不同的Bland-Altman图，并计算了该方法提供的偏差指数。更具体地说，偏差（平均差异）是通过平均每个人通过手工评分和软件在每个采样率下获得的分数之间的差异来计算的。图1B描述了偏差如何作为采样率的函数而减少。通过方差分析[F（2,10）=105.656，p<0.0001]和随后的SNK事后多重比较证实了这一效果，结果表明样本率越高，偏差越低（1个样本/6秒对1个样本/1秒，p<0.05；1个样本+6秒对6个样本/1秒钟，p<0.01）。综上所述，这些数据表明，在适当的采样率下，EthoVision系统获得的冻结分数与训练有素的人类观察员获得的分数类似。

接下来，我们检查了EthoVision在情境和线索恐惧条件反射实验中为恐惧相关行为评分的能力。对于情境恐惧条件反射，一组（CS）只接受情境暴露，但没有受到电击。另一组在条件反射期间接受三对CS-US配对。CS组和CS-US组在24小时滞留试验中存在显著差异（F(3,28)=23.0，p<0.0001）。无论是CS组还是CS-US组，我们都没有观察到静止性自动评分和手部评分之间的差异(图2)，使用每秒6个样本的采样率。重要的是，每秒15个样本的更高采样率会导致更高的假阳性评分（数据未显示）。对于提示性恐惧条件反射，一组（CS）只接受语境和语调的暴露，但没有受到电击。另一组在条件反射期间接受了三个CS-US配对，其中CS是一个30秒的音调，与脚部电击同时终止。在一个新的环境中进行的24小时保持测试包括一个CS前时段（在保持测试期间音调开始之前的时间间隔）和一个CS后时段（在保留测试中音调开始的时间间隔”）。CS组和CS-US组在CS后保留试验期间存在显著差异（F(7,46)=52.0，p<0.0001）。仅CS组在CS前和CS后的静止性方面没有差异。这些结果表明，改进的PhenoTyper笼可以用于情境恐惧条件反射，EthoVision软件参数可以设置为可靠且准确地匹配人类恐惧相关行为的评分。

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改良的PhenoTyper室结合EthoVision软件可用于情境和线索恐惧条件反射

A） 小鼠接受情境恐惧条件反射，然后在条件反射环境中接受24小时记忆测试。一组在没有电击的情况下暴露于环境中（仅CS-组）。另一组接受三对CS-US配对（CS-US组）。EthoVision对静止性的评分与人类观察的评分几乎相同。B） 小鼠接受线索恐惧条件反射，然后在一个新的环境中接受24小时记忆测试。保留测试持续了五分钟，包括一段时间，在没有音调的新环境中（前-CS），然后是音调开始（后-CS）。一组收到了提示音，但没有受到震动（仅限CS）。另一组接受三对CS-US配对（CS-US组）。同样，EthoVision对静止性的评分与人类观察的评分非常相似。此外，这些结果还证明了PhenoTyper室在情境和线索恐惧条件作用中的作用。数值为平均值±SEM。*p<0.05。

讨论

本研究的主要结论是，在适当的软件配置下，使用PhenoTyper-EthoVision提供的硬件-软件串联，可以完全自动化、可靠和精确地量化受到情境或线索恐惧条件作用的小鼠的静止不动。在这方面，该系统的使用可能会提供一个标准化的高通量自动化设置，以测量不同实验室之间的恐惧相关行为。在当前试图识别学习和记忆过程的分子、细胞和生理机制的尝试中，当试图比较来自不同来源的结果时，这样的标准显然是有利的。

与许多系统不同，EthoVision软件与PhenoTyper腔室直接接口，以操作腔室，并对行为进行评分。此外，可以同时录制MPEG视频，以便可以重放视频以对其他感兴趣的行为进行多轮额外评分。因此，硬件操作和动物行为评分可以通过相同的计算机软件系统进行微调。EthoVision允许对用户定义的行为自动评分参数进行精细控制，允许实验者调整跟踪灵敏度和行为评分，以实现与训练有素的人类观察员报告的测量结果几乎相同的测量结果。重要的是，无论冰冻程度如何，人类观察者和EthoVision评分之间的密切匹配都保持不变（例如，在低水平和高水平冰冻时观察到相同程度的一致性；参见图2).

与人类观察员相比，PhenoTyper-EthoVision系统提供了几个额外的优势。首先，该系统允许同时监测多个腔室，这在这个耗时的过程中提高了生产率和数据采集。其次，因为它可以在红外条件下工作，我们观察到，PhenoTyper-EthoVision系统可以在各种条件下提供相同的可靠分数，包括全暗条件（数据未显示）。对于越来越多的研究来说，这可能是一个关键特征，这些研究涉及学习和记忆以及许多其他行为领域中的昼夜节律(Eckel Mahan等人，2008年;Perreau-Lenz等人，2007年;Zueger等人，2006年). 第三，由于EthoVision软件处理数字视频，只要使用数字摄像机捕获视频，行为设置几乎可以在任何位置运行，然后EthoVisiom就可以处理视频。

我们的研究结果扩展了之前关于该设备用于测量啮齿动物运动行为的不同可能应用的报告(de Visser等人，2005年,2006,2007;Dalm等人，2008年). 总之，本研究表明，将PhenoTyper室与EthoVision软件包结合使用，可以提供一个集成系统，能够快速、可靠和灵活地测量恐惧条件反射产生的恐惧相关行为。

致谢

这项工作得到了白厅基金会和NIMH（R01MH081004）（M.A.W.）以及Alicia Kopolitz基金会奖学金（C.S-S.）的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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