淋巴结的形成不需要淋巴囊

免疫荧光

胚胎冷冻切片（7μm）后，将切片固定在脱水丙酮中2分钟，然后风干15分钟。内源性亲和素被亲和素-生物素阻断剂阻断（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）。然后将切片在补充有5%（v/v）小鼠血清的PBS中预孵育10分钟。用一级抗体孵育45分钟，然后用Alexa-Flur-labeled共轭物（荷兰布雷达Invitrogen）孵育30分钟。所有培养均在室温下进行。切片用Hoechst 33342（Invitrogen）复染10分钟，并在Leica TCS SP2共焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems，Rijswijk，荷兰）上进行分析。

淋巴囊不需要启动淋巴结形成

接下来，我们确定与LN anlagen中最早的LTi细胞簇共定位的LEC是否提供了形成这些簇所需的某种类型的诱导信号。为此，为了最终确定LECs/淋巴囊是否调节哺乳动物LN发育的启动，我们利用现有的探头1^-/-小鼠胚胎(威格尔和奥利弗，1999年).探头1活性是鉴定胚胎主静脉中静脉内皮细胞LEC表型所必需的(Wigle等人，2002年). 根据PROX1对LEC表型的说明，并符合Sabin的原始建议(萨宾，1902年)，LEC祖细胞离开主静脉，形成原始淋巴囊，随后形成整个淋巴网络(威格尔和奥利弗，1999年;Wigle等人，2002年). 在探头1-无胚胎，LEC规范未发生；因此，这些突变胚胎缺乏所有LEC衍生物，如淋巴囊和淋巴管(威格尔和奥利弗，1999年;Wigle等人，2002年).

如上所述，E14.5中LN原体的存在探头1^-/-通过筛选CD45簇分析胚胎⁺CD4细胞⁺与MAdCAM1密切接触的LTi细胞⁺基质细胞和内皮细胞。在E14.5进行分析，此时可以清楚地检测到LN anlagen，如探头1^-/-胚胎不能存活超过这个阶段(威格尔和奥利弗，1999年). 该分析表明，在LEC和淋巴囊缺陷的E14.5中，LTi细胞和表达MAdCAM1的基质细胞的积累没有受到影响探头1-无胚胎(图2C、F、I). 这一结果表明，在导致LN形成的初始阶段，不需要LEC和/或原始淋巴囊。然而，MAdCAM1的组织⁺突变体LN anlagen中的细胞似乎受到影响。通常，在这个阶段，MAdCAM1⁺细胞包裹造血细胞(图2G，箭头）；相反，在探头1-空胚，MAdCAM1⁺细胞与造血细胞混合，不包裹造血簇(图2I，箭头）。此外，与野生型胚胎相比，E14.5探头1^-/-胚胎似乎不含腹股沟和腘窝淋巴结无蛋白。由于这些anlagen通常最后形成，它们的缺失可能是由于探头1-无胚胎。

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图2。

淋巴结无淋巴管存在于探头1^-/-小鼠胚胎。MAdCAM1（绿色）、CD4（红色）和CD45（蓝色）的联合染色表明大多数LN无蛋白存在于E14.5中探头1^-/-胚胎。所示为(A-C公司)肠系膜淋巴结(D-F型)肾脏LN和(G-I公司)野生型腋窝淋巴结，探头1^+/-和探头1^-/-胚胎。箭头表示MAdCAM1⁺封装造血细胞（G）或造血细胞和MAdCAM1无组织簇的细胞⁺单元格（I）。比例尺：A-I为75μm。

接下来，我们确认CD45的簇⁺CD4细胞⁺检测到的单元格探头1-空胚对应于LTi细胞，因此真正代表了最早的LN无核细胞。为此，我们对E14.5的部分进行了免疫染色探头1-生成LTi细胞所需的核孤儿受体RORγt（RORC）的零胚(Eberl等人，2004年). 聚集性CD45⁺CD4细胞⁺早期LN anlagen中的造血细胞表达RORγt，从而确认其LTi细胞身份（参见补充材料). 这一初步分析最终证明，与公认的教条相反，哺乳动物淋巴结形成的开始并不需要淋巴囊。

淋巴管系统缺陷不影响淋巴结无拉根形成

为了确定探头1我们分析了导致淋巴管缺陷的活动会影响LN anlagen的正常形成探头1-表现出错位和漏淋巴管的杂合小鼠(Harvey等人，2005年). CD45、CD4和IL7Rα（LTi细胞及其前体）、VEGFR1、MECA32和VEGFR2（血管系统）以及PROX1、足蛋白和MAdCAM1（LECs和基质细胞；我们未发表的结果）的表达(库普多等人，2004年;Mebius等人，1996年)在E14.5野生型中进行了比较，探头1^+/-和探头1^-/-胚胎。LTi细胞簇的形态或大小没有明显变化(图3A、B)，出现较大的VEGFR1⁺血管内皮生长因子2⁺MECA32型^-血管(图3D、E，箭头），淋巴管内皮衬里(图3G，H，箭头），或出现较小的VEGFR1^-血管内皮生长因子2⁺MECA32型⁺血管(图3D，E，箭头）介于野生类型和探头1-杂合子同卵双胞胎。相比之下，较大的VEGFR1⁺蔬菜2⁺MECA32型^-血管(图3F)和淋巴管内皮的衬里(图3I)在中未检测到探头1-空室友。

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图3。

淋巴结原质在探头1-杂合子和探头1-使小鼠胚胎无效。为了确定PROX1缺陷是否以剂量依赖性的方式影响LN的发展，我们比较了E14.5野生型LN anlagen，探头1^+/-和探头1^-/-胚胎。(A-C公司)对切片进行CD45（蓝色）、CD4（绿色）和IL7Rα（红色）染色，以识别形成LN anlagen的LTi细胞簇。(D-I公司)相邻切片染色（D-F）VEGFR1（绿色）、MECA32（红色）和VEGFR2（蓝色）以检测内皮细胞，并染色PROX1（G，H，绿色）、β-半乳糖苷酶（β-gal）（I，绿色），足蛋白（G-I，红色）和MAdCAM1（G-I）以检测淋巴管内皮细胞和LN anlagen内的基质细胞。野生型LN anlagen和探头1^+/-胚胎似乎无法区分，尽管淋巴上皮和血内皮在淋巴结内的组织在探头1^-/-胚胎。D和E中的箭头表示血管，箭头表示小血管。G和H中的箭头表示淋巴管内皮的衬里。比例尺：A-I中75μm。

接下来，我们追踪了成人LN形成的进展探头1-杂合小鼠。为此，我们分析了B细胞和T细胞的组织，滤泡树突状细胞的存在，含有纤维母细胞网状细胞的T细胞区，以及外周和肠系膜淋巴结中的高内皮微静脉和中间窦。未观察到野生型对照的明显差异（见图S2补充材料).

Prox1条件突变小鼠LN形成的进展受到影响

在确定LEC和淋巴囊的缺乏探头1-无效胚胎并不影响LN形成的开始，尽管在探头1-杂合子胚胎，LN形成正常，我们研究了LEC数量的大幅减少和初级淋巴囊的缺陷是否会影响LN形成的开始或LTi细胞初始簇进一步发展为真正的LN。为此，我们利用了可用的探头1条件突变胚胎(Harvey等人，2005年)其中探头1从静脉LEC祖细胞中去除活性。弗洛伊德探头1小鼠(Harvey等人，2005年)被一个Tie2-Cre铁路转基因株系。在E10.5左右，Tie2（Tek）在主静脉的内皮细胞中表达(Kisanuki等人，2001年;佐藤等人，1993年;Harvey等人，2005年;Srinivasan等人，2007年). 我们之前已经证明，在PROX1表达后，这些静脉内皮细胞采用LEC表型，并从静脉中萌芽形成初级淋巴囊(Wigle等人，2002年). 因此，我们使用Tie2-Cre铁路生成探头1淋巴管生成严重受损的无条件胚胎(Srinivasan等人，2007年). 虽然可变，但其中一些探头1条件突变胚胎在～E11.5处的前主静脉内或周围仅含有少量表达PROX1的LEC。在E15.5中，它们只表现出一些偶然的、分散的浅层LEC(Srinivasan等人，2007年). 重要的是，一些受影响更严重的突变胚胎没有深层淋巴管(Srinivasan等人，2007年). 总之，尽管标准探头1-空胚完全没有LEC，因此淋巴囊和淋巴管受到严重影响探头1条件突变胚胎表现出小而形态缺陷的淋巴囊（我们未发表的观察结果）(Srinivasan等人，2007年).

第17.5页探头1条件突变胚胎是由探头1^+/-和Tie2 Cre/前置器1^{弗洛克斯/+}老鼠(Srinivasan等人，2007年). 如前所述(Srinivasan等人，2007年)，在一些严重受累的患者中，仅偶尔出现分散的表面表达PROX1的LECTie2-Cre/Prox1型^{弗洛克斯/-}突变胚胎。用MAdCAM1、CD4和IL7Rα抗体进行免疫染色显示，E17.5中存在所有LN探头1条件突变胚胎（数据未显示）。在受影响最严重的胚胎中（基于切除效率和表达PROX1的LEC数量有限），表达CD4的LTi细胞簇的大小大大减小（数据未显示）。在受影响较轻的胚胎中，有更多表达PROX1的LECs，LTi细胞簇外观正常，与MAdCAM1共定位⁺LYVE1系列⁺观察到细胞(图4B). 然而，对正在发育的LN中基质组织细胞的进一步分析表明，条件突变胚胎中MAdCAM1和VCAM1的表达降低(图4C、D). 这些结果表明，LEC和/或淋巴管系统有助于定位LTi细胞，从而刺激间充质细胞向基质组织者分化。这些条件突变株中LECs和淋巴管数量的减少阻碍了正常间充质细胞的分化。

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图4。

E17.5中显示淋巴结无淋巴结探头1无条件小鼠胚胎。(A、 B)野生型和条件性阴性染色(Tie2-Cre/Prox1型^{flox/flox公司})带有抗LYVE1（绿色）、MAdCAM1（红色）和CD4（蓝色）抗体的肱淋巴结显示⁺共表达MAdCAM1的LECs在LN anlagen中缺失Tie2-Cre/Prox1型^{flox/flox公司}胚胎。(C、 天)用抗MAdCAM1抗体（绿色）、VCAM1抗体（红色）和足蛋白抗体（蓝色）对相邻切片进行染色，结果表明⁺VCAM1公司⁺野生型LN抗原（C）中丰富的基质组织细胞在Tie2-Cre/Prox1型^{flox/flox公司}LN anlagen（D）。比例尺：A-D为75μm。

我们的结果最终证明，LTi细胞的初始聚集不需要LEC、淋巴囊或淋巴管的存在。这个结果推翻了萨宾一个世纪前提出的最初模型，该模型表明淋巴囊最终转化为淋巴结。我们还确定集群LTi细胞的后续组织在探头1-无胚胎，这表明LEC和/或淋巴囊是LN囊形成和造血细胞在发育中LN内定位所必需的。观察到的LN缺乏组织探头1条件突变胚胎可能是由于表达CCL21的LECs缺乏引起的，因为LTi细胞对CCL21产生反应，LECs中CCL21生成可能进一步组织第一批LTi细胞(Honda等人，2001年).

有必要进行额外的分析，以确定在LN将发育的部位吸引和聚集第一批LTi细胞所涉及的诱导信号。我们观察到LN通常发生在血管分叉处；因此，血管分支所需的信号可能会刺激LN的形成。因此，第一个诱导信号应导致趋化因子表达，而趋化因子的表达负责吸引第一个LTi细胞。哪些趋化因子有助于这一过程，以及它们是如何被诱导的，还需要进一步研究。