分子细胞生物学。2009年3月；29(6): 1411–1420.
磷酸对mTORC1和mTORC2复合物组装的调节：与雷帕霉素的竞争▿
, , , , ,和*
阿尔弗雷多·托斯基
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
埃文·李
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
徐丽梅
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
阿瓦隆·加西亚
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
诺加·加迪尔
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
大卫·A·福斯特
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
纽约城市大学亨特学院生物科学系，纽约州纽约市，邮编：10065
收到日期：2008年5月15日；2008年7月14日修订；2008年12月17日接受。
摘要
mTOR是雷帕霉素的哺乳动物靶点，是控制细胞生长和生存的关键节点，广泛参与癌症生存信号。mTOR存在于两种复合物中：mTORC1和mTORC2。磷脂酶D（PLD）及其代谢产物磷脂酸（PA）参与mTOR的调节；然而，他们的作用一直存在争议。我们在此报告，PLD抑制可阻止Thr389处mTORC1底物S6激酶（S6K）和Ser473处mTORC底物Akt的磷酸化。PLD的抑制还阻断了Ser473处胰岛素刺激的Akt磷酸化和PRAS40的mTORC2依赖性磷酸化。重要的是，需要PA才能使mTOR与猛禽联合形成mTORC1，而mTOR和Rictor联合形成mTORC2。PA的作用与雷帕霉素相竞争，与PA-mTORC1相互作用相比，雷帕霉素的浓度要高得多。抑制PA生成显著增加了mTORC2对雷帕霉素的敏感性。这里提供的数据证明了稳定mTORC1和mTORC2复合物的PA需求，并揭示了雷帕霉素对mTOR的抑制作用机制。该研究还表明，通过抑制PLD活性，雷帕霉素可以靶向治疗mTORC2。
在过去十年中，肿瘤进展的一个关键方面是抑制默认的凋亡程序，这可能是最重要的抗癌保护措施。抑制凋亡的细胞信号被称为“生存信号”。生存信号的一个常见节点是mTOR，雷帕霉素的哺乳动物靶点(5,13,14,25). mTOR存在于两种不同的复合物中，即mTORC1和mTORC2(21)它们的亚基组成和对雷帕霉素的敏感性不同。mTORC1由一个包含mTOR的复合物和一个称为Raptor的蛋白质（mTOR调节相关蛋白）组成，而mTORC2由一个包括mTOR和一个名为Rictor的蛋白质的复合物组成(13,14). 还有mTORC2复合物可以通过与mSin1的不同亚型结合来区分(9). 虽然人们对mTORC1的调节了解很多(21)，对mTORC2的调节知之甚少。
mTORC1对雷帕霉素高度敏感，而mTORC2对雷帕霉素相对不敏感(21). 然而，最近有报道称，长期接触雷帕霉素可阻止mTORC2复合物的形成，并阻止mTORC底物Akt在Ser473的磷酸化(24,38). 据报道，雷帕霉素与FK506结合蛋白12（FKBP12）结合，以与磷脂酶D（PLD）代谢产物磷酸（PA）竞争的方式与mTOR相互作用(2,4). PLD和mTOR一样，与几种人类癌细胞系的生存信号有关(1,10,11,27,32,39). 由于雷帕霉素-FKBP12与PA竞争结合mTOR，因此mTORC2复合物形成对雷帕霉素的敏感性表明PA促进mTORC2-的组装并最终激活mTORC2。我们在此报告，mTORC1和mTORC2复合物的组装依赖于PLD及其代谢物PA。该研究还提供了雷帕霉素如何影响mTOR介导的信号以及PLD如何通过促进mTOR复合物的形成来调节mTOR的机制。
材料和方法
细胞、细胞培养条件和转染。
786-O和MDA-MB-231细胞来自美国型培养物收集。所有细胞均保存在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中。根据供应商的说明，使用Lipofectamine LTX进行质粒转染或使用Lipofectamine RNAiMAX进行小干扰RNA（siRNA）转染。通过转染表达绿色荧光蛋白的pEGFP-C1来确定转染效率。绿色细胞的百分比通过显微镜测定，通常超过90%。为了转染DNA质粒，将细胞以5×105/60-mm平板，对于siRNAs，细胞以2×10的较低密度进行平板5/60-mm板，以允许该方法抑制的现有蛋白质的周转。
材料。
试剂来自以下来源。蛋白质G-Sepharose珠购自Amersham；抗mTOR、Rictor和Raptor的抗体来自Santa Cruz Biotechnology；以及抗Akt、P-Akt（Ser473）、P-Akt（Thr308）、S6激酶、P-S6激酶（Thr389）、PRAS40和P-PRAS40（Thr246）的抗体从细胞信号学中获得。靶向猛禽、Rictor、mTOR、PLD1和PLD2的siRNA来自Sigma-Aldrich。转染试剂Lipofectamine LTX和Lipofectamine RNAiMAX来自Invitrogen。雷帕霉素和FK506购自Calbiochem。氯仿中的PA（1-棕榈酰-2-油酰基）购自Avanti-Polaris Lipids。胰岛素来自Sigma-Aldrich。
质粒。
pcDNA3.1控制质粒来自Invitrogen。从克隆泰克获得绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP。催化失活突变PLD1和PLD2蛋白（pCGN-PLD1-K898R和pCGN-PLC D2-K758R）的质粒表达载体(29,30)是Michael Frohman（纽约州立大学石溪分校）慷慨赠送的礼物。
蛋白质印迹分析。
如前所述，使用ECL系统（Amersham）从培养细胞中提取蛋白质并对提取的蛋白质进行Western blot分析(26,32).
免疫沉淀。
细胞生长在直径为10-cm的平板中。在裂解之前，用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗培养板一次，并在500μl冰镇3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲基氨]-1-丙磺酸（CHAPS）免疫沉淀缓冲液（40 mM HEPES[pH 7.5]中的冰上裂解20分钟、120 mM NaCl、1 mM EDTA、10 mM焦磷酸、10 mM甘油磷酸、50 mM NaF、0.5 mM原钒酸盐、无EDTA蛋白酶抑制剂[罗氏]），含0.3%CHAPS。然后将500μg蛋白质样品与适当的抗体孵育，16小时后用蛋白g-Sepharose回收免疫沉淀。然后对免疫沉淀物和40μg总细胞裂解物进行Western blot分析。
交叉链接分析。
如所述制备细胞用于免疫沉淀。在溶出之前，用冷磷酸盐缓冲盐水冲洗培养板一次，并在25 mg/ml二硫代双（琥珀酰亚胺）丙酸盐（DSP；Sigma-Aldrich）存在下，用500μl CHAPS免疫沉淀缓冲液在冰上溶出30分钟。在冰上孵育30分钟后，添加100μl 1 M Tris-HCl（pH 7.4）以淬灭交联，并将裂解液在冰上再放置30分钟。然后将500μg蛋白质样品与mTOR抗体孵育过夜，回收免疫沉淀物，连同40μg总细胞裂解物进行Western blot分析。
小干扰RNA。
将细胞以2×10的比例放置在12孔板上5/在含有10%血清且不含抗生素的培养基中的60mm平板。1天后，根据制造商的说明，用脂质体内酰胺RNAiMAX转染siRNA细胞。24小时后，将培养基换成含有10%血清的新鲜培养基，2天后对细胞进行裂解并进行Western blotting分析。
PLD活性测定。
细胞被标记为[三H] 肉豆蔻酸（60 Ci/mmol；1.5μCi/ml；Perkin-Elmer）4 H。收集脂质前20 min添加1-丁醇（1-BtOH；0.8%或如指示）。在冰镇磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中清洗细胞两次，然后添加500μl冰镇甲醇-6N HCl（50:2）。刮取细胞并将其置于含有155μl 1 M NaCl和500μl冰镇氯仿的第一个提取管中。然后将这些管旋转30秒，并在4°C下以13000 rpm离心3分钟。丢弃上层水层，将下层有机相转移到含有350μl水、115μl甲醇和115μl 1N NaCl的第二提取管中，然后如上所述对其进行涡旋和离心。大部分上层水相被去除，只剩下足以覆盖下层有机相的部分。然后通过闪烁计数测定每个样品有机层中的放射性，以及5×105将每个样品中的cpm用氮气干燥10分钟。将样品重新悬浮在30μl斑点溶液（氯仿-甲醇，9:1）中。然后将样品（每次10μl）点在硅胶G 60A薄层色谱（TLC）板（Whatman）上，并放置在含有100 ml流动相溶液（乙酸乙酯-异辛烷-冰乙酸-H）的室中2O、 88:40:16:80）持续2小时。让平板风干20分钟，并喷洒En三Hancer（Perkin-Elmer），并密封在聚乙烯袋中以保护硅胶。然后将板放置在带有X射线胶片的暴露盒中，并在−80°C下3-5天后显影。
抑制PA生成的酒精陷阱试验。
PLD优先使用初级醇而不是H2O在反磷脂酰化反应中生成磷脂酰醇，并以PA为代价。这是因为原醇可以在膜中定位其疏水尾，其羟基与磷脂上的磷酸基相邻，尽管H浓度较高，但亲核攻击的发生效率高于水解反应2O.叔醇，例如叔丁基-BtOH不起作用，因为它们不会以使羟基靠近磷酸盐的方式插入膜中，因此可以用作阴性对照。
在60mm的板中进行酒精治疗，在板中加入适量的1-BtOH或叔丁基-将BtOH添加到Dulbecco改良的Eagle培养基中，通过剧烈混合获得所需浓度。由于BtOH的高挥发性，在处理期间，用Parafily或小培养瓶密封平板，以防止酒精蒸发。为了保持实验条件的一致性，还密封了未经处理的对照品。密封平板长达8小时不会影响观察到的表型。
PA的制备。
在使用前，适当量的PA在N下干燥2并通过在150 mM NaCl-10 mM Tris-Cl（pH 8.0）中涡流2分钟重新悬浮。将产生的PA悬浮液立即添加到细胞培养物中，使其最终浓度达到100μM。由于PA的半衰期短，在整个治疗过程中每45分钟重复一次这一过程。
结果
mTORC1和mTORC2的激活取决于PLD和PA。
我们以前报道过，HIF2α在786-O细胞中的表达依赖于PLD(32)HIF2α依赖于mTORC2(33). 这些研究表明PLD和mTORC2之间存在联系。PLD通过其代谢物PA参与雷帕霉素敏感mTORC1的激活，PA与雷帕霉素竞争结合mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合域（FRB）（参见参考文献7以供审查）。抑制PLD活性可减少Thr389处mTORC1底物S6激酶的磷酸化(2)，表示mTORC1的PLD依赖性。最近，Sabatini及其同事报道雷帕霉素抑制mTORC2复合物的组装(24,38). 这一发现表明，如果雷帕霉素与PA竞争mTOR，那么PA也可能需要激活mTORC2。mTORC2在Ser473磷酸化Akt(16,23)可作为mTORC2活性的指标。为了在786-O细胞中验证这一点，我们检测了Ser473的Akt磷酸化对mTOR和Rictor（mTORC2的关键成分）的依赖性。我们还检测了S6激酶磷酸化对mTOR和Raptor（mTORC1的关键成分）的依赖性。如图所示。，786-O细胞中Akt在Ser473的磷酸化被mTOR和Rictor的siRNA抑制，但不被Raptor抑制，并且S6激酶在Thr389的磷酸化被mTOR和Raptor的siRNA抑制，但不被Rictor抑制。这些数据表明，Ser473的Akt磷酸化依赖于依赖于Rictor的mTORC2，而S6激酶磷酸化则依赖于依赖Raptor的mTORC。
786-O细胞中Akt在Ser473的磷酸化依赖于mTORC2。786-O细胞在2×10的条件下进行电镀5/60-mm板。20小时后，细胞被转染猛禽、Rictor或mTOR的siRNA或材料和方法中描述的打乱siRNA。20小时后，用含有10%血清的新鲜培养基对细胞进行额外48小时的处理。然后收集细胞并分析其在Ser473（P-Akt S）磷酸化的mTOR、Raptor、Rictor和Akt水平473)，Akt，S6激酶在T398磷酸化（P-S6K T389)和S6激酶（S6K）。所有显示的数据都代表了至少三个独立实验。
为了研究mTORC2是否依赖于PLD活性，我们通过“醇陷阱”反磷酸化反应（即伯醇生成磷脂酰醇而牺牲PA的生成）检查了mTORC2-dependent Ser473位点Akt的磷酸化是否依赖PLD活性(26). PLD在转磷酸酰化反应中不使用叔醇，并作为阴性对照。如图所示。（上图），1-BtOH浓度的增加导致反磷脂酰化产物磷脂酰-BtOH（PBt）的浓度增加，而叔丁基-BtOH未产生可检测的PBt。PBt水平的增加表明，1-BtOH以剂量依赖的方式抑制PA的生成。研究了1-BtOH浓度增加对Ser473处Akt和Thr389处S6激酶磷酸化的影响，如图的下部所示。,-BtOH从0.4%开始抑制Ser473的Akt磷酸化，而在0.8%1-BtOH.时则完全抑制。值得注意的是，Thr389的S6激酶磷酸化对1-BtOH比Akt磷酸化更敏感。1-BtOH对Thr308处Akt磷酸化的影响较小，Thr308-mTORC2未磷酸化该位点(13). 我们发现1-BtOH可以抑制PDK1（磷脂酰肌醇依赖性激酶1）的表达，PDK1是在T308磷酸化Akt的激酶（我们的未发表的结果），这可能解释了高浓度1-Bt氢氧化物导致该位点Akt磷酸化水平轻微降低的原因。叔丁基-1%的BtOH对这里检测的底物的磷酸化没有影响，表明这种影响是由于PLD抑制PA的生成。1-BtOH的作用是可逆的，并且在提供缺乏1-BtOH的新鲜培养基后2小时内，Akt在Ser473的磷酸化被恢复（图。). 如果将PA添加到用1-BtOH处理的细胞培养物中，则Ser473的Akt磷酸化和Thr389的S6激酶磷酸化的抑制被逆转（图。). 这一观察表明，正是PLD产生的PA刺激Akt磷酸化。为了进一步确定1-BtOH对Akt磷酸化的影响是由于对PLD的影响，我们暂时引入了PLD1和PLD2的催化失活突变形式(29,30)，已被证明有效地充当显性阴性突变PLD(26,32). 如图所示。，突变PLD的存在强烈抑制了Akt在Ser473的磷酸化，而对Thr308的磷酸化影响较小。突变PLD也抑制S6激酶磷酸化。我们想研究PA是否可以克服显性阴性突变PLD的影响，但由于外源性PA小泡对最近用Lipofectamine处理过的细胞的毒性作用，这证明存在问题。因此，我们对PLD1和PLD2使用siRNA，这需要几天的时间来抑制PLD表达(32). 如图所示。PLD siRNAs显著降低了Ser473的Akt磷酸化水平，重要的是，这种作用被PA逆转（图。). 图中的数据。表明Ser473处Akt的mTORC2依赖性磷酸化和Thr389处S6激酶的mTORC依赖性磷酸化均依赖于PLD及其代谢物PA。
mTORC2的激活依赖于PLD和PA。（A）786-O细胞在5×105/60-mm平板放置24h，然后转移至含有0.5%血清的培养基。1-BtOH或叔丁基-然后在显示的浓度下添加BtOH。2小时后，按照材料和方法中的描述，收集细胞并通过TLC分析转磷脂酰化产物PBt的水平。TLC板的PBt带显示在顶部。还评估了细胞在Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)，Akt在Thr308磷酸化（P-Akt T308)，Akt，S6激酶在T398磷酸化（P-S6K T389)和S6激酶（S6K）。（B） 如面板A所示，对786-O电池进行电镀。然后在指定位置添加1-BtOH（0.8%）。2小时后，按照指示收获细胞或将细胞置于新鲜培养基中1或2小时，然后收获细胞并分析其在Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)，Akt在Thr308磷酸化（P-Akt T308)和Akt（如图A所示）。制备（C）786-O细胞，并用0.8%的1-BtOH处理，如图B所示。按照材料和方法中的说明制备PA（100μM），并与1-Bt氢氧化物一起添加。2小时后，收集细胞并分析Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)、Akt、S6激酶在Thr389（P-S6K T）磷酸化389)（D）786-O细胞在5×105/60-mm板。20小时后，用表达PLD1或PLD2的催化非活性显性阴性（DN）突变形式的载体转染细胞。以亲本载体pcDNA3.1作为对照。20小时后，用含10%血清的新鲜培养基处理细胞，再处理24小时。对照细胞用转染培养基处理，但不转染。然后收集细胞并分析Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)，在Thr308磷酸化的Akt（P-Akt T308)、Akt、S6激酶在Thr389（P-S6K T）磷酸化389)（E）786-O细胞在2×105/60-mm板。20小时后，用PLD1和PLD2的siRNA或如图所示的打乱siRNA转染细胞。对照细胞用转染介质处理，但不使用转染试剂。48小时后，用含有10%血清的新鲜培养基处理细胞。然后用含有10%血清的新鲜培养基处理细胞额外24小时，并将其置于含有0.5%培养基的培养基中24小时。如有指示，用100μM PA处理细胞3小时。然后收集细胞并分析其在Ser473（P-Akt S）磷酸化的PLD1、PLD2和Akt水平473)和Akt，如面板A所示。所有显示的数据都代表了至少两个独立实验。
形成mTOR复合物的PLD要求。
Sabatini及其同事报告称，长期雷帕霉素治疗可阻止mTORC2复合物的形成(24,38)表明PA在mTOR结合方面与雷帕霉素竞争(2,4)mTORC2复合体的组装可能需要。为了解决这个问题，我们研究了PLD活性对mTOR与Rictor和Raptor共免疫沉淀能力的影响。用增加浓度的1-BtOH处理786-O细胞，并评估与mTOR共免疫沉淀的Rictor和Raptor水平。如图所示。，用增加浓度的1-BtOH处理786-O细胞抑制了与mTOR共免疫沉淀的Rictor和Raptor的水平。重要的是，抑制Ser473的Akt磷酸化所需的1-BtOH水平与抑制与Rictor共免疫沉淀mTOR所需的水平相关，而抑制S6激酶磷酸化所需要的1-Bt OH水平则与抑制与Raptor共免疫沉淀m TOR所需要的水平相关（图。). 如果添加PA，1-BtOH对mTOR与猛禽和Rictor之间关联的影响是相反的（图。). 我们还研究了显性阴性突变PLD对猛禽和Rictor之间关联的影响。如图所示。PLD1和PLD2均抑制了mTOR与猛禽和Rictor之间的关联。值得注意的是，mTOR和Raptor之间的关联对突变的PLD更敏感，这与这种关联对1-BtOH更敏感一致，如图所示。Sabatini及其同事此前报告称，雷帕霉素破坏了mTOR和猛禽之间的相互作用，但如果在免疫沉淀过程中向裂解液中添加交联试剂，则在mTOR免疫沉淀中发现猛禽(17). 这表明雷帕霉素没有完全分解mTOR复合物。因此，我们研究了当使用交联剂时，用1-BtOH降低PA水平是否具有类似的效果。如图所示。交联试剂DSP逆转了雷帕霉素诱导的mTOR解离。然而，当用1-BtOH降低PA水平时，DSP并没有恢复与猛禽或立克次体的mTOR共免疫沉淀。这一观察结果表明，在没有PA的情况下，mTOR复合物比雷帕霉素取代PA时更完全地被分解。提示PLD/PA对mTOR活性的要求是促进或稳定mTOR复合物的组装。数据与报道的PA和雷帕霉素-FKBP12之间的竞争一致(2,4)雷帕霉素抑制mTORC2复合物的形成(24,38). PA的缺乏明显比雷帕霉素更能完全分解复合物。
形成mTOR复合物需要PLD。（A） 786-O细胞在5×10的条件下进行电镀5/60-mm平板放置24h，然后转移至含有0.5%血清的培养基。然后以所指示的浓度加入1-BtOH。3小时后，制备裂解物，并用抗mTOR抗体免疫沉淀过夜，然后用mTOR免疫沉淀（IP:mTOR）和裂解物对Rictor、Raptor和mTOR进行Western blot分析。还对裂解产物进行了Akt水平分析，Akt在Ser473磷酸化（P-Akt S473)、S6激酶和S6激酶在Thr389（P-S6K T）磷酸化389). （B） 如图A所示制备786-O细胞，然后用1-BtOH处理，叔丁基-BtOH和PA如图所示。制备裂解物并用抗mTOR抗体进行免疫沉淀过夜，然后对mTOR免疫沉淀物和裂解物进行Western印迹分析，如图A所示。（C）786-O细胞以5×105/60-mm板。20小时后，用表达PLD1和PLD2的催化非活性显性阴性（DN）突变形式的载体或如图所示的亲本载体pcDNA3.1转染细胞。20小时后，用含10%血清的新鲜培养基处理细胞，再处理24小时。对照细胞用转染培养基处理，但不转染。然后制备裂解产物并用抗mTOR抗体免疫沉淀过夜，然后用mTOR免疫沉淀（IP:mTOR）和裂解产物对Rictor、Raptor和mTOR进行Western blot分析。（D） 按照面板A中的方法制备细胞，并将其放置在含有0.5%血清的培养基上过夜。用指定的醇（0.8%）或200 nM雷帕霉素（Rap）处理细胞2小时。然后，按照材料和方法中的描述，在无DSP或有DSP的情况下对细胞进行裂解。将裂解液与抗mTOR抗体免疫沉淀过夜，然后将mTOR免疫沉淀与全细胞裂解液一起进行mTOR、Raptor和Rictor的Western blot分析，如图所示。所有显示的数据都代表了至少两个独立的实验。
mTORC1和mTORC2对雷帕霉素的差异敏感性。
我们之前证明，PLD活性升高使乳腺癌细胞对雷帕霉素产生耐药性(2). 如果PLD活性较高，则需要较高剂量的雷帕霉素来抑制细胞增殖和S6激酶磷酸化(2). 有趣的是，抑制细胞增殖所需的雷帕霉素浓度高于抑制S6激酶磷酸化所需的浓度。这些数据可以用mTORC1和mTORC2对雷帕霉素的不同敏感性来解释。为了验证这一假设，我们研究了雷帕霉素浓度增加对Ser473的Akt磷酸化和Thr389的S6激酶磷酸化的影响。如图所示。S6激酶磷酸化对低纳米范围内的雷帕霉素浓度敏感，50%的抑制浓度约为20 nM。相反，Ser473的Akt磷酸化对高达20μM的雷帕霉素浓度具有抵抗力。
mTORC1和mTORC2活性对雷帕霉素和1-BtOH的敏感性差异。（A） 786-O细胞在5×10的条件下进行电镀5/60-mm平板置于含有10%血清的培养基中，培养24h。然后将细胞移到含有0.5%血清的培养液中过夜。在指定浓度下添加雷帕霉素（Rap）。8小时后收获细胞，Akt水平在Ser473（P-Akt S）磷酸化473)、Akt、S6激酶在Thr389（P-S6K T）磷酸化389)Western blot分析检测S6激酶（S6K）。（B） 如图A所示，在没有或存在0.25%或0.5%1-BtOH的情况下，按照指示的浓度添加雷帕霉素。8小时后，收集细胞，并在Ser473（P-Akt S）磷酸化Akt水平473)Western blot分析测定Akt。（C） 如图A所示，对786-O细胞进行电镀。如图所示，在不存在或存在0.5%1-BtOH的情况下，以指定浓度添加雷帕霉素。将FK506（10μM）与雷帕霉素和1-BtOH一起添加到指定位置。8小时后，收集细胞，并在Ser473（P-Akt S）磷酸化Akt水平473)和Akt通过蛋白质印迹分析进行测定。（D） 如图所示，制备786-O细胞，并用0.5%1-BtOH和200 nM雷帕霉素处理。PA（100μM）与1-BtOH一起添加到指定位置。8小时后，收集细胞并分析Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)、Akt、S6激酶在Thr389（P-S6K T）磷酸化389)和S6激酶，如面板A所示。所有显示的数据均代表至少两个独立实验。
图中的数据。发现抑制Ser473的Akt磷酸化（mTORC2）需要比抑制S6激酶磷酸化（m TORC1）更高的1-BtOH浓度。这一发现表明，在mTORC2活性降低之前，PA的浓度必须大大降低，这表明PA与mTORC1的相互作用比与mTORC 1的作用更强（见讨论）。观察结果还表明，雷帕霉素-FKBP12在较低浓度下会破坏PA和mTORC1之间较弱的相互作用，而不是破坏PA与mTORC2之间较强的相互作用所需的浓度。如果这是真的，那么降低PA浓度应该可以使雷帕霉素抑制mTORC2。为了研究这一点，我们检测了在1-BtOH浓度增加的情况下雷帕霉素对Ser473的Akt磷酸化的影响，这降低了PA的水平。0.25%或0.5%1-BtOH的存在对Ser473的Akt磷酸化几乎没有影响。然而，在存在1-BtOH的情况下，Akt磷酸化对200 nM雷帕霉素敏感。为了验证雷帕霉素对Akt磷酸化的影响是由于对mTOR的影响，我们检测了在FK506存在下雷帕霉素对Akt磷酸化的影响，FK506与雷帕霉素竞争结合FKBP12。如图所示。FK506逆转了雷帕霉素对Akt和S6激酶的抑制作用。我们还检查了PA是否可以逆转这种效应，如图所示。，PA恢复了Ser473的Akt和Thr389的S6激酶的磷酸化。
Ser473的Akt磷酸化对0.5%1-BtOH和200 nM雷帕霉素的敏感性表明，这种影响是由于对mTORC2的影响。因此，我们检测了在存在1-BtOH的情况下，mTOR与Rictor对雷帕霉素的敏感性。如图所示。mTOR和Rictor之间的关联对0.5%1-BtOH中200 nM雷帕霉素敏感。与Akt磷酸化一样，雷帕霉素和1-BtOH对mTORC2和Rictor之间关联的影响被PA逆转，PA-诱导1-BtOH对PLD生成的PA的影响。这些数据支持以下假设：mTOR复合物的形成是由PA介导的，雷帕霉素-FKBP12干扰PA和mTOR之间的相互作用。
mTORC1和mTORC2复合物形成对雷帕霉素和1-BtOH的敏感性差异。（A） 786-O细胞在5×10的条件下进行电镀5/60-mm平板，培养24h，然后转移到含有0.5%血清的培养基。按照指示添加1-BtOH（0.25%）和指示浓度的雷帕霉素（Rap）。6小时后，制备裂解产物并用抗mTOR抗体免疫沉淀过夜，然后将mTOR免疫沉淀（IP:mTOR）与裂解产物一起进行Rictor和Raptor的Western blot分析。还分析了裂解产物中Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)、Akt、S6激酶在Thr389（P-S6K T）磷酸化389)和S6激酶（S6K）。（B） 如图A所示，制备786-O细胞，并用0.5%1-BtOH和200 nM雷帕霉素处理。PA（100μM）与1-BtOH一起添加到指定位置。6小时后，制备裂解产物，并用抗mTOR抗体进行免疫沉淀过夜，然后将mTOR免疫沉淀与裂解产物一起进行Rictor的Western blot分析。所显示的数据代表了三个独立的实验。
Ser473的胰岛素刺激Akt磷酸化依赖于PLD活性。
胰岛素可以刺激Ser473的Akt磷酸化(9,16). 因此，我们想研究胰岛素刺激的Akt磷酸化对PLD的依赖性。上述实验中使用的786-O细胞在Ser473的Akt磷酸化水平显著升高。因此，我们使用MDA-MB-231细胞，该细胞在该位点具有低水平的基础Akt磷酸化(1). 如图所示。，胰岛素强烈诱导Ser473的Akt磷酸化增加。这种增加被0.8%的1-BtOH抑制；然而，如果添加PA，1-BtOH的作用被逆转，表明PA需要胰岛素诱导的Ser473的Akt磷酸化增加。如果MDA-MB-231细胞表达显性阴性突变蛋白PLD1和PLD2，则胰岛素诱导的Ser473的Akt磷酸化增加也受到抑制。我们还检测了胰岛素诱导的Akt磷酸化增加对雷帕霉素的敏感性。如图所示。，胰岛素诱导的Akt磷酸化增加对20μM的雷帕霉素浓度具有抵抗力。然而，在对Akt磷酸化几乎没有影响的0.25%1-BtOH的存在下，雷帕霉素能够在200 nM下抑制胰岛素诱导的Akt磷酸化（图。). 这些数据进一步支持了这样的假设，即mTORC2可以通过降低PLD生成的PA的浓度而使雷帕霉素敏感。
Ser473的胰岛素刺激Akt磷酸化依赖于PLD活性。（A） MDA-MB-231细胞在5×10的条件下进行培养5/60-mm平板置于含有10%血清的培养基中，培养24h。然后将细胞移到含有0.5%血清的培养液中过夜。然后按照指示添加胰岛素（100 nM）、1-BtOH（0.8%）和PA（100μM）。2小时后收获细胞，Akt水平在Ser473（P-Akt S）磷酸化473)Western blot分析测定Akt。（B） MDA-MB-231细胞在5×10的条件下进行培养5/60-mm板，如图所示。二十小时后，用表达PLD1和PLD2的催化失活显性阴性（DN）突变形式的载体或如图所示的亲本载体pcDNA3.1转染细胞。20小时后，用含有10%血清的新鲜培养基对细胞进行额外24小时的处理。然后收集细胞并分析其在Ser473（P-Akt S）磷酸化的Akt水平473)和Akt，如图A所示。（C）MDA-MB-231细胞按图A所述进行电镀。如图所示，在不存在或存在0.25%1-BtOH的情况下，以指示浓度添加雷帕霉素（Rap）。六小时后，采集细胞，并按照面板A中的方法测定磷酸化Akt和Akt的水平。显示的数据是两个独立实验的代表性数据。
抑制PLD会增加mTOR和mTOR抑制蛋白PRAS40之间的关联。
PRAS40（富含脯氨酸的40 kDa Akt底物）是作为mTORC2底物的mTORC1的抑制剂(22,34,37). PRAS40的磷酸化可防止与mTOR相关。因此，我们研究了1-BtOH和雷帕霉素对PRAS40与mTOR的关联以及PRAS40的磷酸化状态的影响。如图所示。（顶部），0.5%1-BtOH和200 nM雷帕霉素均未影响PRAS40与mTOR共免疫沉淀的能力。然而，0.5%1-BtOH和200nM雷帕霉素的组合强烈增加了mTOR和PRAS40之间的关联。这种1-BtOH和雷帕霉素的组合是抑制Ser473的mTORC2和Akt磷酸化所必需的（图。). 这种1-BtOH和雷帕霉素的组合也抑制了Thr246的Akt位点PRAS40的磷酸化（图。，底部）。PA克服了1-BtOH对mTOR和PRAS40之间关联的影响以及对PRAS40磷酸化的影响（图。). 我们还研究了显性阴性突变PLD对mTOR和PRAS40之间关联的影响，如图所示。，显性阴性突变PLD抑制PRAS40磷酸化并增加与mTOR的关联。这些数据进一步支持PLD在mTORC2的调节中的作用以及通过抑制PRAS40抑制对mTORC1的正反馈。
抑制PLD会增加mTOR和mTOR抑制蛋白PRAS40之间的关联。（A） 786-O细胞在5×10的条件下进行电镀5/60-mm平板，培养24h，然后转移到含有0.5%血清的培养基。如图所示，添加1-BtOH（0.5%）和雷帕霉素（200 nM）。6 h后，制备裂解产物并用抗mTOR抗体免疫沉淀过夜，然后将mTOR免疫沉淀（IP:mTOR）与裂解产物一起进行Western blot分析，以检测在Thr246（P-PRAS40）磷酸化的mTOR、PRAS40和PRAS40。（B） 如图A所示，将786-O细胞接种。20小时后，用表达PLD1和PLD2的催化失活显性阴性（DN）突变形式的载体或如图所示的亲本载体pcDNA3.1转染细胞。20小时后，用含有10%血清的新鲜培养基对细胞进行额外24小时的处理。然后收集细胞并分析mTOR免疫沉淀物中的mTOR和PRAS40，以及裂解物中Thr246磷酸化的PRAS40和PRAS四十（P-PRAS40），如图A所示。所显示的数据代表了两个独立的实验。
讨论
在大量人类癌症和人类癌细胞中观察到PLD活性升高(8). PLD活性也与癌细胞的生存信号有关(5,6). PLD代谢物PA与mTOR的激活有关(7)也与癌症生存信号密切相关(13,14). 然而，PLD在mTOR介导的生存信号中的作用尚未被广泛接受。这里提供的数据表明，PLD及其代谢物PA对mTORC1和mTORC2复合物的形成至关重要。这项研究证实了雷帕霉素通过干扰mTOR和PA之间的相互作用来抑制mTOR，并且mTOR可以通过降低PA水平而对雷帕霉素更加敏感。这里提供的数据表明，Ser473处Akt的mTORC2依赖性磷酸化需要PLD活性和PA。Akt和mTOR一样，是癌症生存信号的关键节点，而Ser473的Akt磷酸化与Akt活性升高密切相关(13,19). Ser 473的Akt磷酸化对PLD的依赖性表明PA是Akt介导生存信号的关键调节器。在肾癌细胞中观察到PLD依赖性，其中基础Akt磷酸化升高，在乳腺癌细胞系中也观察到胰岛素刺激的Akt磷酸化增加，Akt磷化水平降低。数据还表明，当PLD活性被抑制时，PRAS40对mTORC1的抑制被逆转。共同地，这些数据坚定地确立了PLD生成的PA在调节人类肿瘤细胞中的mTORC1和mTORC2中的作用，并表明靶向PLD信号是抑制mTOR依赖性生存信号和增强基于雷帕霉素的治疗策略在PLD和mTOR抑制肿瘤失活的癌症中的疗效的一种手段防止癌症的凋亡程序。
虽然雷帕霉素对mTOR的特异性已经知道一段时间了，但其作用机制尚未确定。Jie Chen的小组报告称，PA与mTOR的相互作用方式与雷帕霉素竞争，但对mTOR激酶活性没有任何明显影响(4). 我们的小组随后证明，PLD活性升高增加了抑制S6激酶磷酸化和细胞增殖所需的雷帕霉素浓度(2). 最近的结构研究表明，PA与mTOR的FRB结构域相互作用，并引起与雷帕霉素-FKBP12与FRB结构区结合时观察到的结构变化类似的结构变化(35). Sabatini的研究小组最近报告说，雷帕霉素可以阻止mTOR与mTORC2复合物的其他成分的结合。我们的发现是，mTOR和Rictor之间以及mTOR与Raptor之间的复合物的稳定性需要PLD，这与雷帕霉素阻止mTOR2复合物形成以及PA与mTOR以与雷帕霉素竞争的方式相互作用的观察结果一致(2,4,35). 虽然雷帕霉素破坏了mTOR和猛禽之间的相互作用，但mTOR免疫沉淀中存在的交联剂恢复了这种联系(17). 相反，用1-BtOH降低PA水平明显破坏了mTOR复合物，因此交联并没有恢复mTOR与猛禽或立克次体之间的联系，这表明PA的缺乏比雷帕霉素更能破坏mTOR复合体。本研究的主要意义是PLD和PA通过促进mTOR复合物的形成来调节mTOR信号传导，雷帕霉素通过干扰PA-mTOR相互作用来抑制mTOR。
我们之前的研究表明，PLD活性升高会增加抑制S6激酶磷酸化和细胞增殖所需的雷帕霉素剂量(2)揭示了一些令人困惑的东西。抑制细胞增殖所需的雷帕霉素的量大于抑制S6激酶磷酸化所需的量。当使用雷帕霉素耐药突变株mTOR时，大剂量雷帕霉素抑制MDA-MB-231细胞增殖和诱导凋亡的作用被逆转(1)-表明高剂量雷帕霉素的作用与mTOR有关。图中提供的数据。揭示了抑制Ser 473的Akt磷酸化所需的1-BtOH浓度高于抑制S6激酶磷酸化所需要的浓度。这表明抑制mTORC2所需的1-BtOH浓度高于抑制mTORC所需的浓度。这一发现的含义是，mTORC2与PA的结合比mTORC1更强，当PA离解时，细胞内需要较低浓度的PA，以使PA与mTORC_2保持离解状态。这一观察也说明了为什么需要更高浓度的雷帕霉素来竞争与mTORC2的结合，而不是竞争与mTORC1的结合。图中提供的数据。揭示了Ser473处S6激酶磷酸化和Akt磷酸化的雷帕霉素剂量反应差异。S6激酶磷酸化对雷帕霉素的敏感性较高，这与mTORC1的要求一致，后者对PA的亲和力明显低于mTORC2。PA与mTORC1的相关性较弱，意味着PA和mTORC2将更频繁地解离，因此，当解离时，需要较低浓度的雷帕霉素来取代mTORCl上的PA。相反，抑制Ser473处Akt磷酸化所需的雷帕霉素的更高浓度反映了仅对mTORC2的需求，其显然更强烈地结合PA，因此，分离是罕见的，这意味着需要非常高浓度的雷帕霉素才能结合PA与mTORC2分离时获得的低浓度mTOR。因此，PA和mTORC2的离解常数(K（K）d日2)小于mTORC1和PA的离解常数(K（K）d日1). 这在图中mTORC1和mTORC2与PA之间关联强度差异的简化模型中进行了描述。我们认为只有当PA与FRB结构域分离时，雷帕霉素-FKBP12才能与mTOR的FRB结构区结合。然而，由于PA与mTORC2的结合比与mTORC的结合更强，PA与mTORC2的分离频率更低，需要更高浓度的雷帕霉素才能与mTORC2释放的罕见mTOR相互作用。该模型中描述的速率常数仅用于mTOR和PA之间的相互作用，因此该模型过于简化，因为忽略了Rictor和Raptor以及mTORC1和mTORC2复合物的其他组分的参与。然而，该模型确实提供了mTORC1和mTORC2复合物差异稳定性的第一近似值，这与观察到的雷帕霉素和PA的差异敏感性一致。
雷帕霉素（Rap）和1-BtOH对mTORC1和mTORC2的差异效应模型。mTORC1和mTORC2离解常数（KD类s） PA表示离解速率常数的比值（kd日)和地层（k（f）). 这里提供的数据与mTORC1从PA和mTOR（k）中解离的速率常数的模型一致第1天)大于mTORC2从PA和mTOR中解离的速率常数（k第2天). 因此，PA与mTORC2的分离较少。雷帕霉素-FKBP12抑制mTORC1和mTORC2的能力取决于mTOR结合雷帕霉素FKBP12的频率。从mTORC1中分离出来的mTOR比从mTORC 2中分离出来的要多得多，因此，与PA竞争结合从mTORC1中获得的mTORs所需的雷帕霉素更少。相反，mTORC2的罕见分离需要更多的雷帕霉素-FKBP12与PA竞争，以捕获来自mTORC1的罕见mTOR蛋白。降低PA水平将改变平衡，有利于mTOR复合物的离解，从而降低结合和抑制mTOR所需的雷帕霉素-FKBP12的浓度。PC，磷脂酰胆碱。
我们在本研究中使用了两种细胞系，786-O肾癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞，这两种细胞都具有高水平的PLD活性(32,39). MDA-MB-231细胞的PLD活性只有在没有血清的情况下才会高度升高，而786-O细胞的PLD-活性升高则在有血清和没有血清的条件下都会发生。虽然这种差异的意义尚不清楚，但有趣的是，Ser473的Akt磷酸化在786-O细胞中较高，在MDA-MB-231细胞中较低。在没有血清的情况下，MDA-MB-231细胞中Akt磷酸化水平低，PLD活性高(39)，清楚地揭示了PLD活性和PA本身不足以激活mTORC2并导致Akt在Ser473的磷酸化。相反，外源PLD基因的引入确实刺激了S6激酶的磷酸化(1)表明mTORC1可被PA水平升高激活。据报道，外源性PA可刺激S6激酶，但仅在氨基酸存在的情况下(4)或抑制TSC2(31). 因此，PA结合其他输入刺激mTORC1。除了激活PLD的信号外，还需要确定激活mTORC2所需的信号。这里提供的数据表明，胰岛素可以以PLD依赖的方式刺激MDA-MB-231细胞中的Akt磷酸化，这可能为激活mTORC2所需的额外信号提供了线索。胰岛素增加PLD活性(8)MDA-MB-231细胞中已经升高的PLD活性可能使mTORC2的激活需要胰岛素信号的另一方面。最近，Rosen和同事证明mTORC1的抑制导致依赖IGF-1的Ser473的Akt磷酸化增加(20). Wan等人所做的类似观察(36)证明S6激酶的抑制增加了Akt在Ser473的磷酸化。因此，除了PA外，IGF-1和胰岛素信号传导的成分可能是mTORC2激活的重要成分。
有两大类PLD异构体-PLD1和PLD2。我们发现，PLD1和PLD2的显性阴性突变形式抑制S6激酶和Akt磷酸化，同时使用这两种突变形式比单独使用其中一种更有效。这意味着PLD1和PLD2都涉及。我们注意到了受体内吞作用的相同现象(26)和HIFα表达(32). 因此，我们认为这两种PLD亚型都参与其中。在这方面，最近有两份报告支持这一假设，至少是mTORC1。Sung Ho Ryu及其同事报告称，PLD2在功能上与猛禽相关(15)，暗示PLD2参与mTORC1的激活，最近Chen和同事报道PLD1是Rheb的直接靶点(28)，它在mTORC1上游起作用，表示PLD1激活mTORC1。虽然本研究使用PLD2的短发夹RNA来排除PLD2在Rheb诱导的S6激酶磷酸化中的作用，但该过程可能没有充分降低PLD2蛋白水平以完全抑制其作用。我们发现，当使用siRNA方法时，PLD2对下调具有特别的抵抗力(32; 我们未发表的观察结果）。因此，目前有证据支持PLD1和PLD2在mTORC1激活中的作用。这里提供的数据表明，PLD1和PLD2也参与了mTORC2的激活，尽管其机制尚待研究。
雷帕霉素和雷帕霉素衍生物已广泛应用于临床试验，结果大多令人失望(25). 最近的一项临床研究集中于胶质母细胞瘤，其中PTEN通常存在缺陷(三). 这项研究表明，雷帕霉素对细胞周期有抑制作用，并对S6激酶磷酸化诱导的mTORC1产生影响。如图所示，mTORC1比mTORC2对雷帕霉素更敏感。然而，Ser473的Akt磷酸化依赖于mTORC2，这表明mTORC1在癌症中可能更为关键，因为Akt可磷酸化许多对癌细胞生存至关重要的关键底物(19). 因此，有效地瞄准mTOR可能需要抑制mTORC2的策略。与这个假设相一致，我们最近发现肾癌细胞中HIF2α的表达需要mTORC2(33).
Kaelin及其同事报道，肾癌细胞形成肿瘤需要HIF2α(18). 这两项研究强化了mTORC2可能是抗癌治疗的重要靶点这一概念。如本研究所示，抑制PLD活性使雷帕霉素能够有效抑制786-O细胞中的mTORC2，这些细胞具有较高的PLD活性(32). 因此，将抑制PLD活性的策略与雷帕霉素相结合可能会提高雷帕霉素的疗效。虽然目前没有药物直接靶向PLD，但靶向增加PLD活性的细胞内信号仍然是可能的。我们最近报道了一种来自荷花玉兰和厚朴酚抑制PLD活性(12)因此可能与雷帕霉素联合使用以抑制mTORC2。因此，确定和厚朴酚是否能提高雷帕霉素对PLD活性升高的癌细胞的疗效将是很有意义的。这项研究为靶向调节PLD活性的信号以提高雷帕霉素的疗效提供了理论基础，雷帕霉素在临床试验中产生了好坏参半的结果。
致谢
我们感谢Michael Oh（多伦多大学）和Paige Yellen对手稿的评论。我们感谢Michael Frohman（纽约州立大学石溪分校）在本研究中使用的PLD基因。
这项工作得到了国家癌症研究所（CA46677）和国家卫生研究院（GM60654）的SCORE资助。国家卫生研究院国家研究资源中心授予少数民族机构研究中心（RCMI）RR-03037奖项，该奖项为亨特学院生物科学系的基础设施和仪器提供支持。A.G.得到了加拿大皇家医学会基因中心的资助。
参考文献
1Chen，Y.、V.Rodrik和D.A.Foster。人类乳腺癌细胞中的替代磷脂酶D/mTOR生存信号。癌基因 24672-679. [公共医学][谷歌学者] 2Chen，Y.，Y.Zheng和D.A.Foster。磷脂酶D使人乳腺癌细胞对雷帕霉素产生耐药性。癌基因 223937-3942. [公共医学][谷歌学者] 三。Cloughesy、T.F.、K.Yoshimoto、P.Nghiemphu、K.Brown、J.Dang、S.Zhu、T.Hsueh、Y.Chen、W.Wang、D.Youngkin、L.Liau、N.Martin、D.Becker、M.Bergsneider、A.Lai、R.Green、T.Oglasy、M.Koleto、J.Trent、S.Horvath、P.S.Mischel、I.K.Mellinghoff和C.L.Sawyers。雷帕霉素对复发性PTEN缺乏性胶质母细胞瘤患者的抗肿瘤作用。公共科学图书馆-医学。 5139-151.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Fang，Y.、M.Villella-Bach、R.Bachmann、A.Flanigan和J.Chen。磷酸介导的mTOR信号的有丝分裂激活。科学类 2941942-1945. [公共医学][谷歌学者] 5Foster，D.A.2004年。在抗癌治疗策略中靶向mTOR介导的生存信号。抗癌治疗实验修订版。 4691-701. [公共医学][谷歌学者] 6Foster，D.A.2006年。磷脂酶D生存信号作为癌症的治疗靶点。货币。信号转导疗法。 1295-303之间。[谷歌学者] 7Foster，D.A.2007年。磷脂酸对mTOR的调节？癌症研究。 671-4. [公共医学][谷歌学者] 8Foster，D.A.和L.Xu。2003.磷脂酶D与细胞增殖和癌症。摩尔癌症研究。 1789-800. [公共医学][谷歌学者] 9弗里亚斯、M.A.、C.C.索林、J.D.杰菲、W.施罗德、T.斯卡利、S.A.卡尔和D.M.萨巴蒂尼。mSin1是Akt/PKB磷酸化所必需的，其亚型定义了三种不同的mTORC2。货币。生物。 161865-1870. [公共医学][谷歌学者] 10N.Gadir、D.Jackson、E.Lee和D.A.Foster。2008年。TGF-β信号缺陷使人癌细胞对雷帕霉素敏感。癌基因 271055-1062. [公共医学][谷歌学者] 11Gadir，N.、E.Lee、A.Garcia、A.Toschi和D.A.Foster。2007.磷脂酶D对转化生长因子-β信号传导的抑制。细胞周期 62840-2845. [公共医学][谷歌学者] 12Garcia，A.、Y.Zheng、C.Zhao、A.Toschi、J.Fan、N.Schreibman、H.A.Brown、D.Bar-Sagi、D.A.Foster和J.Arbiser。2008年。厚朴酚抑制人类癌细胞中Ras依赖性磷脂酶D活性介导的生存信号。临床。癌症研究。 144267-4274.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13D.A.Guertin和D.M.Sabatini。2007.确定mTOR在癌症中的作用。癌细胞 129-22. [公共医学][谷歌学者] 14D.A.Guertin和D.M.Sabatini。2005年，mTOR在癌症中的作用不断扩大。摩尔医学趋势。 11353-361. [公共医学][谷歌学者] 15哈、S.H.、D.H.金、I.S.金、J.H.金，M.N.李、H.J.李、J.H金、S.K.张、P.J.苏和S.H刘。PLD2与mTOR/猛禽形成功能复合物，以传递有丝分裂信号。细胞信号。 182283-2291. [公共医学][谷歌学者] 16Hresko，R.C.和M.Mueckler。mTOR/RICTOR是3T3-L1脂肪细胞中Akt/蛋白激酶B的Ser473激酶。生物学杂志。化学。 28040406-40416. [公共医学][谷歌学者] 17Kim、D.H.、D.D.Sarbassov、S.M.Ali、J.E.King、R.R.Latek、H.Erdjument-Bromage、P.Tempst和D.M.Sabatini。mTOR与猛禽相互作用，形成一种营养敏感复合物，向细胞生长机制发出信号。单元格 110163-175. [公共医学][谷歌学者] 18Kondo，K.、W.Y.Kim、M.Lechpammer和W.G.Kaelin，Jr.2003年。抑制HIF2α足以抑制pVHL缺陷的肿瘤生长。《公共科学图书馆·生物》。 1439-444中。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19B.D.曼宁和L.C.坎特利。2007年，AKT/PKB信号：向下航行。单元格 1291261-1274.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20O'Reilly，K.E.，F.Rojo，Q.B.She，D.Solit，G.B.Mills，D.Smith，H.Lane，F.Hofmann，D.J.Hicklin，D.L.Ludwig，J.Baselga和N.Rosen。mTOR抑制诱导上游受体酪氨酸激酶信号传导并激活Akt。癌症研究。 661500年至1508年。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Sabatini，D.M.，2006年。mTOR与癌症：对复杂关系的洞察。Nat.Rev.癌症 6729-734. [公共医学][谷歌学者] 22桑卡·Y、C.C.索林、T.R.彼得森、R.A.林德奎斯特、S.A.康、E.斯普纳、S.A.Carr和D.M.萨巴蒂尼。PRAS40是mTORC1蛋白激酶的胰岛素调节抑制剂。分子电池 25903-915. [公共医学][谷歌学者] 23Sarbassov，D.D.、D.A.Guertin、S.M.Ali和D.M.Sabatini。2005.rictor-mTOR复合物对Akt/PKB的磷酸化和调节。科学类 3071098-1101之间。[公共医学][谷歌学者] 24Sarbassov，D.D.、S.M.Ali、S.Sengupta、J.H.Sheen、P.P.Hsu、A.F.Bagley、A.L.Markhard和D.M.Sabatini。2006.长期雷帕霉素治疗抑制mTORC2组装和Akt/PKB。分子电池 22159-168. [公共医学][谷歌学者] 25Sawyers，C.L.2003年。mTOR抑制剂会成为抗癌药物吗？癌细胞 4343-348. [公共医学][谷歌学者] 26Shen，Y.、L.Xu和D.A.Foster。2001.受体介导的内吞作用对磷脂酶D的要求。分子细胞。生物。 21595-602.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Shi，M.、Y.Zheng、A.Garcia和D.A.Foster。2007.磷脂酶D为活化H-Ras或K-Ras的人类癌细胞提供生存信号。癌症快报。 258268-275.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Sun，Y.、Y.Fang、M.S.Yoon、C.Zhang、M.Roccio、F.J.Zwartkruis、M.Armstrong、H.A.Brown和J.Chen。磷脂酶D1是mTOR途径中Rheb的效应器。程序。国家。阿卡德。科学。美国 1058286-8291.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Sung，T.C.、R.L.Roper、Y.Zhang、S.A.Rudge、R.Temel、S.M.Hammond、A.J.Morris、B.Moss、J.Engebrecht和M.A.Frohman。磷脂酶D的突变定义了一个超家族，包括痘病毒致病性所需的反高尔基病毒蛋白。EMBO J。 164519-4530.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Sung，T.C.、Y.M.Altshuller、A.J.Morris和M.A.Frohman。1999.哺乳动物磷脂酶D2的分子分析。生物学杂志。化学。 274494-502. [公共医学][谷歌学者] 31Tee、A.R.、R.Anjum和J.Blenis。2003年。结节性硬化症复合物-1和-2基因产物的失活是通过磷脂酰肌醇3-激酶/Akt-依赖性和非依赖性的结节蛋白磷酸化发生的。生物学杂志。化学。 27837288-37296. [公共医学][谷歌学者] 32Toschi，A.、J.Edelstein、P.Rockwell、M.Oh和D.A.Foster。VHL缺陷肾癌细胞中HIF2α的表达依赖磷脂酶D。癌基因 272746-2753. [公共医学][谷歌学者] 33Toschi，A.、E.Lee、N.Gadir、M.Ohh和D.A.Foster。2008年。HIF1α和HIF2α对mTORC1和mTORC2的差异依赖性。生物学杂志。化学。 28334495-34499.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Vander Haar，E.、S.I.Lee、S.Bandhakavi、T.J.Griffin和D.H.Kim。2007.Akt/PKB底物PRAS40介导的mTOR胰岛素信号传导。自然细胞生物学。 9316-323. [公共医学][谷歌学者] 35Veverka，V.、T.Crabbe、I.Bird、G.Lennie、F.W.Muskett、R.J.Taylor和M.D.Carr。2008年。mTOR与磷脂酸和新型抑制剂相互作用的结构表征：FRB结构域在小分子介导的mTOR调控中发挥中心作用的有力证据。癌基因 27585-595. [公共医学][谷歌学者] 36Wan，X.、B.Harkavy、N.Shen、P.Grohar和L.J.Helman。雷帕霉素通过IGF-1R依赖机制诱导Akt信号的反馈激活。癌基因 261932-1940. [公共医学][谷歌学者] 37Wang，L.、T.E.Harris、R.A.Roth和J.C.Lawrence，Jr.2007年。PRAS40通过作为底物结合的直接抑制剂来调节mTORC1激酶的活性。生物学杂志。化学。 28220036-20044. [公共医学][谷歌学者] 38Zeng，Z.、D.D.Sarbassov、I.J.Samudio、K.W.Yee、M.F.Munsell、C.Ellen Jackson、F.J.Giles、D.M.Sabatini、M.Andreeff和M.Konopleva。雷帕霉素衍生物减少AML中mTORC2信号传导并抑制AKT激活。血液 1093509-3512.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Zheng，Y.、V.Rodrik、A.Toschi、M.Shi、L.Hui、Y.Shen和D.A.Foster。2006.磷脂酶D结合了生存和迁移信号，以应对人类乳腺癌细胞中的压力。生物学杂志。化学。 28115862-15868. [公共医学][谷歌学者] 
