癌症研究。作者手稿；于2009年2月23日在PMC上市。
以最终编辑形式发布为：
PMCID公司：PMC2646404型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院74393
氨基二磷酸介导的MMP-9抑制打破肿瘤骨髓轴，该轴负责髓源性抑制细胞扩张和肿瘤基质中巨噬细胞浸润
,1 ,1 ,1 ,2和1
塞西莉亚·梅拉尼
1意大利米兰Ricovero e Cura Carattere Scientifico Istituto Nazionale dei Tumori基金会实验肿瘤系免疫治疗和基因治疗部门
萨宾娜·桑加莱蒂
1意大利米兰国家肿瘤研究所实验肿瘤科免疫治疗和基因治疗室
弗朗西丝卡·M·巴拉泽塔
1意大利米兰国家肿瘤研究所实验肿瘤科免疫治疗和基因治疗室
泽纳·韦布
2加利福尼亚大学解剖与生物医学科学项目系，加利福尼亚州旧金山
马里奥·P·科伦坡
1意大利米兰国家肿瘤研究所实验肿瘤科免疫治疗和基因治疗室
1意大利米兰国家肿瘤研究所实验肿瘤科免疫治疗和基因治疗室
2加利福尼亚大学解剖与生物医学科学项目系，加利福尼亚州旧金山
转载请求：Cecilia Melani，免疫治疗和基因治疗单位，Fondazione Istituto Ricovero e Cura Carattere Scientifico Istituto-Nazionale dei Tumori，通过G.Venezian，120133 Milan，Italy。电话：39-0223902212；传真：39-0223902630；电子邮件：ti.im.iromutotutisi@inalem.alicec - 补充资料
GUID:378EB7C0-9E89-48AB-808E-39001AE02C14
摘要
表达活化大鼠的BALB-neuT小鼠c-erbB-2/neu小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列下的转基因由于肿瘤分泌的血管内皮生长因子（VEGF）而表现出增强的造血和骨髓来源的抑制细胞（MDSC）的高产量。在这里，我们发现肿瘤和基质细胞都表达基质金属蛋白酶-9（MMP-9），从而增加了荷瘤小鼠血清中前MMP-9的水平。氨基二磷酸钠治疗可抑制肿瘤生长，显著降低MMP-9的表达和肿瘤基质中巨噬细胞的数量，并通过降低血清前MMP-9和VEGF减少骨髓和外周血MDSC的扩张。我们通过将MMP-9基因敲除小鼠的骨髓移植到BALB-neuT小鼠，从基质白细胞分泌的MMP-9中分离出肿瘤衍生MMP-9的作用。尽管骨髓祖细胞衍生的MMP-9在推动MDSC扩张方面起着主要作用，但骨髓嵌合体的氨基-二磷酸钠治疗进一步降低了骨髓生成和支持性肿瘤基质，从而增强了肿瘤坏死。此外，通过减少MDSC，氨基二磷酸盐克服了肿瘤诱导的免疫抑制，改善了p185/HER-2免疫诱导的抗肿瘤免疫反应的产生和维持。我们的数据表明，MMP-9活性的抑制打破了连接肿瘤生长和髓细胞扩张的恶性循环，从而减少免疫抑制。氨基二膦酸盐揭示了一种特定的MMP-9抑制活性，这可能会扩大其应用范围，超过其当前用途。
介绍
骨髓造血和免疫反应的改变几乎总是伴随着肿瘤的生长。髓样细胞扩张通常是对促进骨髓活动的肿瘤分泌细胞因子和生长因子的反应(1,2). 这种扩张的髓样细胞有助于肿瘤的进展，同时提供支持基质和免疫逃避(三-8). 在肿瘤基质中，它们提供生长因子、细胞外基质蛋白和基质降解酶，通过重塑邻近组织和促进转移过程和血管生成，为肿瘤生长创造新的空间。此外，它们通过抑制淋巴细胞活化来促进免疫逃逸(7,9-11)和抗原识别(12).
表达转化大鼠癌基因的转基因雌性小鼠c-erbB-2型(HER-2/neu型)在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子（BALB-neuT）的作用下，乳腺癌自发发展，进展与人类乳腺癌相似。在BALB-neuT小鼠中，肿瘤释放的血管内皮生长因子（VEGF）是促使造血朝着Gr1/CD11b双阳性未成熟髓细胞群大规模扩张的主要因素(2). 这些细胞抑制T淋巴细胞增殖，以响应异基因和T细胞抗原受体介导的刺激，由于其免疫抑制活性，它们被命名为髓源性抑制细胞（MDSC；参考文献。13). 在荷瘤动物中，MDSC扩张是一种可逆现象，因为肿瘤切除或增生骨髓移植到无瘤小鼠中可导致正常造血和免疫应答的恢复(2).
MDSC的功能需要基质金属蛋白酶-9（MMP-9）(5). 此外，MMP-9是一种基质因子，通过溶解膜结合形式的c-KitL，调节造血干细胞从骨髓生态位的动员(14,15). 由于MMP-9通过使VEGF可用于内皮细胞上的VEGFR-2/flk受体，重塑细胞外基质，促进新生血管的萌芽和生长，因此它也是肿瘤进展的关键(15-18).
因此，合理的癌症治疗方法包括抑制MMP-9。然而，MMP抑制剂在一些临床试验中失败或显示出毒性(19,20). 氨基二膦酸盐提供了一种有趣的替代品。由于其对破骨细胞的毒性作用以及抑制肿瘤与矿化基质的粘附，它们目前在肿瘤治疗中用于治疗骨转移和相关疼痛(21,22). 除这些活性外，氨基二磷酸钠还抑制肿瘤基质细胞表达的MMP-9，从而损害VEGF的可用性，从而减少肿瘤血管生成(23). 这些观察结果表明，氨基二膦酸盐可能被用于抑制某些MMP-9效应，可能没有选择性较低的抑制剂的毒性。在这项研究中，我们通过抑制MMP-9-VEGF环来抑制肿瘤诱导的骨髓增生异常综合征（MDSC）的扩张，从而研究了氨基二磷酸钠是否能够对抗肿瘤诱导的MDSC扩张。为了确定肿瘤和炎性细胞产生的MMP-9的相对作用以及氨基二磷酸钠治疗的相对效果，我们使用骨髓嵌合体来降低成为肿瘤基质微环境一部分的造血来源细胞中MMP-9基因的表达。我们通过结合氨基二磷酸钠和疫苗接种来检测MDSC免疫抑制对肿瘤发生和生长的作用，以及诱导和维持抗r-p185/HER-2抗体反应。
材料和方法
小鼠和治疗
根据国家和机构指南，BALB-neuT小鼠在国家图莫里研究所的动物设施中繁殖和饲养。从Charles River购买8至10周龄正常BALB/c、C57BL/6和FVB小鼠。F1杂交种是通过将BALB neuT雄性与C57BL/6或FVB雌性交配而获得的。半合子转基因雌性在3周龄时通过PCR进行鉴定(24).
基质金属蛋白酶-9+/−Leif Lund博士（丹麦哥本哈根大学实验医学系Panum研究所）好心地提供了C57BL/6背景的小鼠作为N17代。将它们回交到BALB/c和N6代，交叉获得纯合子MMP-9−/−和杂合MMP-9+/−后代用作骨髓捐赠者。
剂量为0.1 mg/kg的唑来膦酸钠（佐美他；诺华Europtis Europharm，Ltd.）或剂量为2 mg/kg的帕米膦酸盐（福鼎制药）在生理盐水中稀释，每周皮下注射5天。每周称重小鼠，并将药物浓度调整为其有效重量。对照组小鼠每天接受0.2 mL生理盐水皮下注射，为了控制治疗肾毒性，在治疗12、17和23周后，用比色Jaffè法监测小鼠血清肌酐水平(25).
从7周开始对（FVB×BALB–neuT）F1雌性大鼠进行免疫治疗，并在9周、11周和13周时重复免疫治疗。编码大鼠p185-HER-2细胞外和跨膜结构域（ECD-TM）的质粒DNA(26)根据制造商的说明，使用EndoFree质粒Giga试剂盒（Qiagen SpA）制备。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下，将0.05 mg DNA注入0.05 mL盐水中的小鼠双耳背侧。一组接受DNA疫苗接种的小鼠从4周龄开始已经接受了唑来膦酸钠0.1 mg/d皮下注射。
每周监测所有接受治疗和对照的转基因雌性的乳腺肿瘤发展和进展以及外周血（PB）中的髓细胞扩增。乳腺肿瘤用卡尺测量，肿瘤体积表示为(我2×L（左）)，其中我表示较短的直径和L（左）更长的那个。单个肿瘤体积的总和代表肿瘤的总体积，而肿瘤的多样性是具有可测量肿瘤的乳腺的数量。
免疫组织化学和细胞荧光分析
对于免疫组化，乳腺肿瘤被纳入最佳切割温度复合物中，并在液氮中快速冷冻。将丙酮固定的5μm低温恒温器切片置于3%H中2O（运行）2/甲醇溶液5分钟以阻断内源性过氧化物酶活性，在PBS中冲洗，在5%FCS中封闭20分钟，并用Abs anti-CD11b/CD18（克隆M1/70.5；BD Bioscience）、anti-Gr-1（克隆RB6-8C5；BD biosciences）、anti F4/80（克隆CI，A3-1；Caltag/Invitrogen）、anti-MMP-9（MAB 13415；Chemicon International）、，抗CD31（血小板/内皮细胞粘附分子1；BD Bioscience）。
清洗后，用生物素化抗鼠或抗鼠抗体（Vector Laboratories）覆盖切片30分钟。通过清洗去除未结合的免疫球蛋白，并用亲和素-过氧化物酶复合物（DAKO）培养载玻片，并用3,3′-二氨基联苯胺（Sigma-Aldrich）显色。切片用迈尔苏木精复染，在分级酒精（70%、95%和100%乙醇）中脱水，并安装在BDH安装介质（默克）中。所有免疫染色用多个切片重复五次，包括阴性对照，以确定背景染色。所有图像均在配备数码相机（DXM1200；尼康）的显微镜（Eclipse E-1000；尼康公司）上进行数字采集，并使用ACT-1软件进行分析。
循环MDSC的分析如下所述(2)：从眶后窦收集0.2 mL PB，与等体积的5 mmol/L EDTA混合，在NH中通过低渗休克溶解红细胞4Cl裂解缓冲液和白细胞计数。用10μg/mL大鼠抗鼠CD16/CD32 Ab（克隆2.4G2；BD-PharMinen）阻断细胞，然后用5μg/mL（5μg/10）的大鼠抗小鼠FITC-Gr-1和PE-CD11b Abs（Caltag/Invitrogen）组合染色6细胞）在2%牛血清白蛋白（BSA）中，0.05%叠氮化物在PBS中在冰中放置40分钟。细胞在PBS-2%BSA中洗涤三次，并用FACScalibur（Becton Dickinson）分析双阳性细胞。
为了分析肿瘤基质，将自发性乳腺肿瘤切除，切碎在含有胶原酶D（1 mg/mL）的2 mL Hank’s平衡盐溶液（HBSS）缓冲液中，并在37°C下孵育40 min。用2mL HBBS/5 mol/L EDTA停止酶消化，用注射器轻轻移液，然后通过70μm细胞过滤器过滤，将肿瘤缩小为单细胞悬浮液（Falcon；Becton Dickinson Labware Europe）。如上所述，用PE-CD11b与FITC-Gr-1、FITC-F4/80（均来自Caltag）或FITC-CD11c（克隆HL-3；BD-PharMinen）的组合或FITC-和PE-结合的同型对照（BD-Pharminen）的联合处理和免疫染色细胞。使用FACSCalibur E2551细胞仪（Becton Dickinson）进行分析。数据收集于104活细胞并使用CellQuest软件进行分析。
VEGF和MMP-9原的检测
从眼眶后窦收集经治疗和未经治疗的小鼠的血液，并在室温下凝血2小时。在2000 rpm离心10分钟后，转移、校准血清，并冷冻保存，直到进行分析。根据制造商的说明，分别使用小鼠VEGF开发试剂盒（Peprotech，Inc.）和Quantikine pro–MMP-9 ELISA试剂盒（研发系统），通过夹心ELISA法测定血清VEGF和pro-MMP-9。
骨髓集落形成单位测定
骨髓细胞是通过用1mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM；Life Technologies Invitrogen Corp.）冲洗股骨和胫骨获得的，补充2%热灭活FCS（Bio Whittaker Europe），使用连接在1mL注射器上的22g针头。使用同一注射器轻轻抽吸骨髓细胞数次，以获得单细胞悬浮液，并通过NH低渗溶解去除红细胞4氯缓冲液。
骨髓细胞悬液稀释至2×105将IMDM 2%FCS培养基中的细胞/mL和0.3 mL细胞与3 mL MethoCult GF M3434完全甲基纤维素培养基（StemCell Technologies，Inc.）混合。在35-mm培养皿中以2至2.5×10的比例将细胞培养成两份4细胞/培养皿，并在37°C和5%CO下培养13天2-加湿培养箱。在第7天、第10天和第13天，对集落进行粒细胞-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、集落形成单位粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞（CFU-GEMM）和爆发形成单位红系（BFU-E）形态评分，并将所有三种类型的总和记录为骨髓集落形成单位（CFU）。
骨髓移植
对7-8周龄（C57Bl6xBALB-neuT）F1雌性大鼠进行致死性照射，总剂量为950 cGy，分两次给药，间隔3小时。小鼠静脉注射骨髓细胞（107细胞/小鼠）取自MMP-9−/−或MMP-9+/−老鼠。
骨髓移植用免疫荧光监测MHC H-2K的消失b条和H-2K的表达d日PB淋巴细胞上。未移植的辐照对照小鼠在2周内死亡。
从7周龄开始，一半的移植小鼠每天接受唑来膦酸钠治疗，而另一半每天注射生理盐水。
抗r-p185/HER-2反应的细胞荧光评价
从最后一次DNA疫苗接种后4周开始，每15天从治疗和对照（FVB×BALB-neuT）F1小鼠收集血清。通过流式细胞术分析抗r-p185/HER-2抗体的存在，分别使用r-p185/ER-2阳性和阴性的N202-1A和N202-1E细胞系(27). 电池（5×105)在冰中与0.1 mL用PBS-2%BSA-0.05%叠氮化物稀释的试验血清或对照正常血清孵育30分钟。在同一缓冲液中洗涤后，用1:60稀释的生物素化山羊抗鼠IgG（Amersham）培养细胞30分钟，然后用1:150稀释的链霉亲和素-PE（BD-PharMinen）培养细胞。清洗细胞，将其重新悬浮在PBS-2%BSA中，并使用FACSCalibur E2551细胞仪（Becton Dickinson）进行分析。数据收集于104活细胞并使用CellQuest软件进行分析。仅识别N202-1A而非N202-1E的血清被视为抗r-p185/HER-2抗体反应阳性。
根据Quaglino等人(28)，如下所示：（试验血清阳性细胞百分比×荧光平均值）−（对照血清阳性细胞%×荧光平均数）×血清稀释度。
统计分析
使用GraphPad Prism软件（GraphPad-software，Inc.）进行统计分析。使用非配对双尾Student’st吨95%置信区间检验和非参数Mann-Whitney检验。当P（P）值<0.05。
结果
MMP-9在BALB-neuT小鼠中的表达及其在乳腺肿瘤中氨基二膦酸盐的下调作用
BALB-neuT小鼠发生多发性、多灶性乳腺癌，其进展与MDSC扩张和血清VEGF水平升高有关(2). 因为VEGF对其受体VEGFR-2/Flk的可用性受MMP-9的调节(17)，我们研究了乳腺肿瘤进展过程中MMP-9的表达。我们通过ELISA检测到BALB-neuT荷瘤女性血清中pro–MMP-9水平升高，而非无瘤女性()免疫组化显示，基质内散布的白细胞中MMP-9表达水平较高，而未经治疗的小鼠肿瘤细胞中MMP-9表达水平较低(). 通过对来源于原发性肿瘤的肿瘤细胞系进行Western blot分析，证实了乳腺肿瘤细胞中MMP-9的表达(补充图S1). 为了测试MMP-9表达、VEGF分泌和MDSC扩张是否相关，我们用氨基二磷酸钠治疗BALB-neuT小鼠，据报道，氨基二磷酸酯通过抑制正常和肿瘤浸润巨噬细胞中的甲羟戊酸途径来减少MMP-9的生成(23,29). 根据其相对疗效(30)帕米膦酸钠和唑膦酸盐分别以2和0.1 mg/kg的剂量给药，从4、7或12周龄开始，每天持续给药至28周龄。尽管长时间服用氨基二磷酸可引起肾毒性，但在治疗12、17和23周后监测的肌酐血清水平和每周体重在治疗组和对照组小鼠之间没有差异（数据未显示），表明按指定剂量反复给药唑来膦酸或帕米膦酸对小鼠无明显毒性。
BALB-neuT小鼠中MMP-9的表达。A类ELISA检测单个BALB-neuT中的前MMP-9血清水平。在三名具有代表性的女性中，血清pro–MMP-9随着年龄和肿瘤的发展而增加。酒吧，SD。B类乳腺肿瘤中MMP-9的免疫组化分析。肿瘤细胞和间质巨噬细胞都产生MMP-9，尽管在不同的水平：肿瘤细胞显示弥漫的细胞质阳性(左下角，插图)而巨噬细胞具有较强的颗粒阳性(左上，插图; 放大倍数，×20；插入放大倍数，×40）。
之前治疗过的小鼠(4周)或者在增生的时候(7周)使用帕米膦酸盐或唑来膦酸钠后，肿瘤发病延迟，转化乳腺数量减少，肿瘤体积缩小。同样在12周时，当老鼠已经有很多就地通过整体分析检测到的癌，该治疗在减少总肿瘤体积方面仍然有效(). 与其他治疗组相比，从4周龄开始接受治疗的小鼠组在任何时间点的总肿瘤体积都有统计学上的显著减少，这表明氨基二磷酸在乳腺细胞转化过程中起作用较早，或者治疗时间越长，肿瘤生长抑制越强(). 在帕米膦酸和唑来膦酸之间没有任何显著差异的情况下，我们继续使用唑来膦酸盐进行研究，并测试其对MMP-9的影响，试图区分肿瘤源性和基质源性MMP-9。
氨基二磷酸钠治疗对BALB-neuT小鼠的影响。BALB-neuT小鼠组每周用唑来膦酸盐或帕米膦酸盐或生理盐水治疗5次(未经处理的)从4、7或12周开始。实验重复两到三次，每组五到六只动物，并将结果合并。A类，与未经治疗的对照组相比，所有治疗组的肿瘤生长（以单个肿瘤体积之和表示）均受到显著抑制，P（P）= 0.01; **,P（P）28周时=0.005；**，P（P）= 0.003; ***,P（P）29周时=0.0001。酒吧，东南。B类每周比较不同治疗方案的肿瘤体积。与较晚开始的两种治疗相比，在4周时开始的治疗显著损害了肿瘤生长；*，P（P）= 0.01; **,P（P）< 0.007; ***,P（P）= 0.0006. 合并了唑来膦酸盐和帕米膦酸钠治疗小鼠的数据。酒吧，东南。
为了测试BALB-neuT小鼠肿瘤中MMP-9的表达是否与血清中可检测到的VEGF增加以及肿瘤进展期间髓样细胞的扩张有关，我们对氨基二磷酸钠治疗的小鼠进行了更详细的检查。无论起始年龄如何，唑来膦酸钠治疗显著降低了前MMP-9(P（P）=0.0009）和血管内皮生长因子(P（P）=0.001）在荷瘤BALB-neuT小鼠的血清中()随着肿瘤大小的减小，表明肿瘤环境中MMP-9的生成受损导致全身可检测到的VEGF减少。这证实了MMP-9在调节同源受体VEGF可用性中的关键作用(17)以及VEGF介导的髓细胞募集到炎症部位(31,32).
唑来膦酸钠治疗可减少肿瘤分泌因子并改变肿瘤基质的细胞组成和功能。A类、pro–MMP-9和VEGF在肿瘤性BALB-neuT中的评估。治疗后血清(n个=13）和未处理(n个=12）通过ELISA分析BALB-neuT小鼠的前MMP-9和VEGF含量，并与正常BALB/c血清水平进行比较。***，P（P）= 0.0009; **,P（P）= 0.001.酒吧，SD。B类肿瘤基质的细胞荧光分析。原发性肿瘤单细胞悬液(n个=16–19）用CD11b-PE和Gr-1-FITC或F4/80-FITC抗体标记。双阳性细胞的平均百分比显示CD11b/Gr-1（***，P（P）= 0.0003; *,P（P）=0.033）和CD11b/F4/80（*，P（P）=0.04）在治疗组和对照组小鼠的基质中表达巨噬细胞。酒吧，SD。C类，未经治疗的免疫组织化学分析(顶部)并进行了治疗(底部)乳腺肿瘤F4/80染色-(a–d)，等级-1–(b–e类)和MMP-9–特定(c–f)抗体。唑来膦酸降低F4/80阳性巨噬细胞的数量(d日与一)和Gr-1阳性细胞(e（电子）与b条)并显著降低肿瘤和基质细胞中MMP-9的表达(（f）与c（c）). 放大倍数，×10。
事实上，如荧光激活细胞分类分析所示，氨基二磷酸钠治疗还显著减少了肿瘤基质内CD11b、Gr-1和F4/80阳性染色的炎性细胞的浸润(). 免疫染色证实，氨基二磷酸钠可减少肿瘤浸润和基质白细胞，并抑制基质和肿瘤细胞中MMP-9的表达().
然而，尽管VEGF减少，但在接受治疗或未接受治疗的小鼠中，相同大小的乳腺肿瘤的CD31免疫染色在血管数量、分布和组织上没有差异（数据未显示）。这表明VEGF水平的降低本身并不影响肿瘤血管生成，可能是因为肿瘤中存在多余的促血管生成回路(33).
唑来膦酸对肿瘤分泌VEGF驱动造血的影响
基于上述结果，我们接下来研究了氨基二磷酸钠是否对肿瘤诱导的过度活跃骨髓造血有任何活性。唑来膦酸钠治疗开始于4周大，显著降低了外周血髓细胞的扩增(). 然而，当以相同比例添加到CD3刺激的BALB/c脾细胞中时，治疗组小鼠中剩余的Gr-1/CD11b阳性细胞与对照组小鼠中的细胞具有相同的免疫抑制作用，证实了它们的MDSC性质（数据未显示）。
唑来膦酸钠抑制肿瘤增强骨髓(BM公司)造血。A类，与对照组BALB-neuT相比，治疗组PB中Gr-1/CD11b双阳性细胞在肿瘤进展过程中的扩增显著减少。*，P（P）= 0.01; **,P（P）= 0.003;酒吧，东南。B类治疗改变了循环Gr-1/CD11b阳性细胞数与肿瘤总体积之间的比率。治疗组诱导循环MDSC数量相似所需的肿瘤质量比未治疗组大。酒吧，SD。C类，甲基纤维素（CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E）中BALB-neuT获得的骨髓集落总数被唑来膦酸盐显著减少，与无瘤BALB/c.**类似，P（P）= 0.0019; ***,P（P）= 0.0005.酒吧，平均值。D类，慢性唑来膦酸盐治疗对BALB/c小鼠的正常骨髓造血没有毒性作用，这是通过在甲基纤维素中获得的骨髓集落的总和来测量的。酒吧，平均值。
虽然较小的肿瘤会释放较少的调节骨髓的因子，但观察到的减少甚至高于肿瘤尺寸减小时的预期值；值得注意的是，为了获得相同数量的循环Gr-1/CD11b阳性细胞，唑来膦酸盐治疗的肿瘤必须比未治疗的肿瘤大6-8倍(). 这些数据表明，唑来膦酸盐除了对肿瘤大小产生影响外，还破坏了骨髓调节。
为了确定这种抑制作用的性质，我们询问氨基二磷酸是否影响骨髓中存在的克隆形成祖细胞的数量。甲基纤维素培养基中的克隆形成试验显示显著降低(P（P）=0.0005）在治疗组与未治疗组小鼠骨髓中的菌落总数中(). 尤其是治疗组小鼠骨髓中CFU-GM和CFU-GEMM的数量显著减少(P（P）=0.0056和P（P）分别<0.0001；数据未显示）。这些结果证实，氨基二膦酸盐损害骨髓祖细胞的扩增和肿瘤的生长。为了排除氨基二膦酸盐对正常造血前体的任何毒性作用，我们用唑来膦酸盐治疗BALB/c小鼠16周，然后测试其骨髓细胞的集落形成。从治疗组和未治疗组小鼠的骨髓中获得了几乎相同数量的集落，这表明唑来膦酸的作用仅限于肿瘤增强，而非正常造血().
骨髓基质细胞MMP-9基因消融研究唑来膦酸盐对肿瘤生长和骨髓造血的影响
探讨肿瘤细胞（几乎每个细胞都表达低水平）和基质白细胞（仅在散布于肿瘤中的少数细胞中表达高水平）产生的MMP-9的不同作用；)在肿瘤发展和造血调节过程中，我们产生了骨髓嵌合体。来自MMP-9敲除物（MMP-9）的骨髓细胞−/−)或合格（MMP-9+/−)将小鼠移植到转基因小鼠体内，监测肿瘤的发生、发展以及骨髓调节。在这两种嵌合体中，肿瘤衍生的MMP-9都存在。
骨髓嵌合体移植MMP-9后发生自发性乳腺肿瘤−/−或MMP-9+/−骨髓，具有相似的动力学和进展(;打开的符号). 免疫组织化学显示两种嵌合体肿瘤中CD11b和F4/80阳性细胞的数量和分布相当(补充图S2A–B). 与肿瘤发展平行，MMP-9+/−>neuT嵌合体小鼠经过造血扩增后，骨髓集落数量增加，而MMP-9−/−>neuT嵌合体，克隆数与正常BALB/c小鼠骨髓无显著差异(;打开的符号). 这些数据表明，白细胞产生的MMP-9对浸润、基质组织和外生长是不必要的()但有必要通过VEGF的可用性触发骨髓增生性造血().
骨髓嵌合体中肿瘤和基质MMP-9功能和唑来膦酸盐反应的解剖。A类，用MMP-9骨髓移植的经致命照射的转基因小鼠−/−或MMP-9+/−供体接受唑来膦酸盐或生理盐水治疗(未经处理的)并监测肿瘤生长。实验重复两次，每组六只小鼠，并将结果合并。骨髓基质细胞MMP-9的表达与肿瘤的发生和生长无关(打开的符号)和唑来膦酸抑制两种骨髓嵌合体中的肿瘤生长(填充符号).酒吧，东南。B类，在移植MMP-9的小鼠中，肿瘤生长与造血增加相关+/−(P（P）=0.005），但不适用于MMP-9−/−骨髓，如甲基纤维素中骨髓集落总数所示。唑来膦酸钠治疗显著减少了两种嵌合体中的骨髓集落数，使肿瘤携带者的造血正常化，P（P）=0.002至0.003。酒吧，平均值。C类和D类用ELISA法检测唑来膦酸盐或生理盐水处理的荷瘤骨髓嵌合体血清中pro–MMP-9和VEGF的水平(未经处理的). 唑来膦酸钠降低了接受MMP-9的嵌合体小鼠中pro–MMP-9和VEGF的水平+/−但不是MMP-9−/−供者骨髓*，P（P）= 0.01.酒吧，平均值。
事实上，在携带肿瘤的MMP-9中，前MMP-9和VEGF血清水平升高+/−>neuT嵌合体，但不存在于MMP-9中−/−>neuT嵌合体(;打开的符号). 在MMP-9中−/−>neuT嵌合体，肿瘤细胞产生的少量MMP-9不足以将VEGF的可用性提高到激活肿瘤增强骨髓造血所需的阈值。在这些小鼠中，骨髓中的抗辐射基质产生足够的MMP-9来支持造血干细胞的正常增殖和分化(; 参考文献。15,34).
唑来膦酸钠治疗抑制MMP-9的肿瘤生长+/−>neuT和MMP-9−/−>neuT骨髓嵌合体(;填充符号)并显著减少肿瘤基质内CD11b和F4/80阳性细胞的数量(补充图S2C–D类). 无论基质细胞的MMP-9基因型如何，治疗后的肿瘤都是坏死的。在MMP-9中+/−>唑来膦酸钠显著降低neuT小鼠血清前MMP-9(P（P）=0.011）和VEGF(P（P）= 0.018;并减少骨髓甲基纤维素菌落的数量(P（P）= 0.002;).
在MMP-9中−/−>唑来膦酸钠处理的neuT嵌合体，pro–MMP-9和VEGF的正常水平没有降低()但骨髓CFU数量明显减少(P（P）= 0.003;)，表明唑来膦酸盐对耐辐射骨髓基质产生的MMP-9有一定影响(34).
因为骨髓消融后骨髓恢复需要MMP-9，所以我们测试了氨基二磷酸对正常造血是否有任何抑制作用。我们用唑来膦酸钠治疗BALB-neuT和BALB/c小鼠，然后用5-氟尿嘧啶（5FU）消融骨髓。5FU治疗6天内严重减少外周血、脾脏和骨髓中的细胞数，以及甲基纤维素中的骨髓和脾脏菌落。14天后，无论唑来膦酸钠治疗如何，BALB/c小鼠的骨髓集落（CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E）恢复正常，而治疗后的BALB-neuT小鼠的这种恢复受损(补充图S3). 这些数据证实，唑来膦酸盐对正常造血没有抑制作用，尽管它可以降低肿瘤部位产生过量MMP-9的影响。
唑来膦酸钠治疗通过减少MDSC改善免疫治疗结果
MMP-9/VEGF环诱导MDSC，唑来膦酸钠治疗可降低MDSC。因此，我们询问这种MDSC减少是否可以改善免疫治疗的反应。为了评估唑来膦酸盐和免疫治疗之间是否存在协同作用，我们使用了单独免疫治疗不足以预防肿瘤发病的条件。BALB-neuT小鼠与FVB杂交，因为这种F1杂交加快了肿瘤发生。（FVB×BALB-neuT）F1雌性大鼠组从4周龄开始接受唑来膦酸治疗或不接受唑来磷酸酯治疗，并在7、9、11和13周龄时接种编码大鼠p185/Her-2 ECD-TM的质粒DNA四次。
单独使用唑来膦酸盐可减少肿瘤生长，证实了在不同的遗传背景下。此外，作为单一治疗的免疫治疗虽然不能保护小鼠免受肿瘤生长的影响，但延迟了肿瘤的发生（数据未显示）。
与未经治疗的对照组相比，唑来膦酸盐联合免疫治疗可进一步延迟肿瘤发病，并在任何时间点显著抑制肿瘤生长(P（P）= 0.002–0.004; 数据未显示）。虽然唑来膦酸钠并没有改善使用该方案的疫苗接种结果，但在观察期间，接受联合治疗的小鼠数量越多，肿瘤质量越小(). 对具有相同数量转化乳腺的小鼠组的评估表明，与单独接种DNA疫苗的小鼠相比，接受唑来膦酸钠和DNA疫苗接种的小鼠的累积肿瘤体积明显更小，而与小鼠年龄无关().
唑来膦酸盐对抗肿瘤免疫治疗的辅助作用。（FVB×BALB-neuT）F1雌鼠接受了四个周期的DNA疫苗接种(DNA vax)有或没有唑来膦酸盐处理。监测肿瘤生长、MDSC扩张和抗r-HER-2抗体反应，并与未经治疗的对照组进行比较。A类在晚期肿瘤阶段，年龄在18至22周之间，接种唑来膦酸钠并接受治疗的小鼠的肿瘤体积比单独接种疫苗的小鼠小。酒吧，中位数。B类，分析携带相同数量转化乳腺的治疗小鼠的累积肿瘤体积。在DNA疫苗中添加唑来膦酸盐显著减小了肿瘤的总体大小。*，P（P）=0.01至0.04；**，P（P）=0.003至0.005；酒吧，东南。C类，肿瘤体积与PB中Gr-1/CD11b阳性细胞百分比之间的相关性突出表明，与接种疫苗和未接种对照的小鼠相比，接受唑来膦酸钠和疫苗治疗的小鼠MDSC显著降低。**，P（P）=0.006至0.008。酒吧，SD。D类，抗体介导的对r-HER-2的免疫反应，测量为对r-p185/HER-2阳性肿瘤细胞系的血清结合潜力。唑来膦酸钠治疗和接种的小鼠的抗r-HER-2抗体滴度显著高于单独接种或未接种的小鼠。酒吧，标准差。
与未经治疗的对照组相比，所有经治疗的小鼠外周血中MDSC的数量显著减少(P（P）= 0.01–0.0004). 当循环MDSC的百分比与肿瘤体积相关时，接种唑来膦酸钠并进行治疗的小鼠MDSC水平下降幅度不成比例，因此，需要显著增大肿瘤大小才能诱导与未治疗小鼠相同百分比的循环MDSC(P（P）=0.008）或接种疫苗的小鼠(P（P）= 0.006;).
因为在这个免疫治疗模型中，DNA疫苗接种诱导了对大鼠p185/HER-2的抗体反应，所以对小鼠进行了识别HER-2抗原的抗体的检测。正如预期的那样，在最后一次免疫后的3周内，仅免疫治疗就诱导了体液抗鼠p185/HER-2反应。在DNA疫苗中添加唑来膦酸可显著提高抗r-p185/HER-2抗体的滴度(). 这一结果表明，唑来膦酸诱导的MMP-9下调可抑制MDSC的生成，从而改善DNA疫苗引发的抗肿瘤免疫反应。
讨论
在本研究中，我们为恶性循环提供了证据，该循环通过MMP-9连接肿瘤和骨髓，MMP-9主要由骨髓来源的基质细胞在肿瘤微环境中产生。MMP-9使VEGF可用于骨髓，以动员造血干细胞促进骨髓造血。我们的数据显示，MMP-9随着肿瘤的进展而增加，同时血清中VEGF的水平也在增加。抑制肿瘤部位MMP-9的表达打破了这个循环，使造血正常化，从而减少了对肿瘤基质和MDSC生成的骨髓支持。作为MMP-9抑制剂，我们使用了氨基二膦酸盐，即帕米膦酸和唑来膦酸。这类二膦酸盐干扰蛋白质的丙烯基化以及甲羟戊酸转化为合成胆固醇所必需的香叶基香叶基焦磷酸(29). 因此，它们作用于多种代谢途径，并根据细胞类型具有不同的作用：诱导细胞凋亡，损害细胞迁移和对矿化支架的粘附在体外(22,35)，抑制转移，尤其是骨转移(36,37)，并通过削弱基质巨噬细胞的VEGF信号和MMP-9表达来抑制肿瘤新生血管生成(23)体内.
氨基二磷酸钠治疗可诱导BALB-neuT小鼠侵袭性自体肿瘤发生模型的生长抑制。除了抑制MMP-9的表达外，氨基二磷酸钠还减少肿瘤基质中CD11b-和F4/80阳性白细胞的数量，从而使肿瘤失去巨噬细胞提供的营养作用。巨噬细胞对癌前乳腺病变的侵袭先于血管生成性转换，是PyMT模型中肿瘤进展所必需的(38). 这与肿瘤培养巨噬细胞通过分泌生长因子、细胞因子、基质金属蛋白酶和一氧化氮促进增殖和血管生成来促进肿瘤进展的观点相吻合(39-41). 即使通过腺病毒介导的趋化因子基因表达在肿瘤内招募的巨噬细胞也获得了与先前存在的巨噬细胞相同的M2表型，肿瘤相关的巨噬细胞被视为癌症治疗的靶点(42).
我们的研究表明，降低前MMP-9血清水平会降低血管生成和骨髓生成中VEGF的可用性。有趣的是，对骨髓造血的影响似乎先于对肿瘤生长的影响。事实上，为了获得相同数量的循环MDSC，用唑来膦酸钠治疗的小鼠的肿瘤质量应该是未治疗小鼠的六到八倍。MDSC的减少是由于造血功能正常化所致，通过对治疗的荷瘤小鼠骨髓中甲基纤维素菌落的计数可以看出：尤其是循环MDSC的CFU-GM和CFU-GEMM前体细胞明显减少(P（P）=0.005和P（P）分别<0.0001）。
有趣的是，唑来膦酸钠对正常造血没有影响，因为慢性治疗的BALB/c小鼠骨髓CFU数量和类型正常，并且显示了细胞毒药物5-FU诱导的暂时性再生障碍的正常恢复。出乎意料，与宫颈癌模型的结果相反(23)肿瘤部位MMP-9和VEGF的降低并不影响血管生成。促血管生成回路的冗余可能通过上调肿瘤和内皮细胞产生的成纤维细胞生长因子、肾上腺素和血管生成素-1来绕过VEGF的阻断(33).
为了分析造血来源的肿瘤或基质细胞产生的MMP-9的作用及其对唑来膦酸的相对敏感性，我们使用骨髓嵌合体敲除骨髓源性细胞中的MMP-9。无论供体基因型如何，BALB-neuT嵌合体都会发展成具有类似发病和进展的肿瘤。肿瘤在浸润F4/80-CD11b细胞方面也显示出类似的基质组成。因此，肿瘤细胞产生的MMP-9可能足以促进局部组织重塑和血管生成。相反，浸润肿瘤的髓系细胞产生的较高量的MMP-9对骨髓有远处的影响；在MMP-9中被击倒−/−>neuT嵌合体降低了VEGF血清水平和正常造血。
唑来膦酸钠抑制MMP-9的肿瘤生长−/−和MMP-9+/−>BALB-neuT嵌合体，减少肿瘤内巨噬细胞的数量，打破肿瘤基质与骨髓之间的恶性循环。在MMP-9中−/−嵌合体，唑来膦酸盐进一步减少了从骨髓中获得的CFU数量，但对正常造血没有毒性，唑来磷酸酯对造血也没有毒性，也没有挽救5FU诱导的暂时性再生障碍。由于肿瘤负责增强荷瘤小鼠的造血功能，骨髓CFU的正常化表明唑来膦酸盐优先作用于肿瘤，同时保留骨髓造血干细胞。
最后，外周血和次级淋巴器官中MDSC的减少有助于疫苗免疫治疗后免疫反应的诱导。
各种MMP抑制剂（MMPI）的临床试验大多不成功(16,19). 由于几种基质金属蛋白酶对肿瘤不同发展阶段的作用不同，因此基质金属蛋白酶抑制剂在肿瘤早期和晚期的作用可能会有很大差异。由于这个特殊的原因，MMP-9被重新考虑作为药物抑制剂的一个更特异的靶点(16,20). 氨基二膦酸盐是一类具有良好安全性和耐受性的MMPI(43)显示出MMP-9抑制以外的治疗效果。在癌症患者中，单剂量帕米膦酸钠和唑来膦酸盐可降低血清VEGF、血小板衍生生长因子、转化生长因子β和MMP-2的水平(44-46); 从而支持了它们从阻断破骨细胞骨吸收和CXCR-4引导的转移到抑制MMP-9和激活γ-δT淋巴细胞的多因素作用的观点(47-49). 此处所述的肿瘤生长抑制可能与氨基二磷酸的几种作用机制有关。我们的研究重点是氨基二磷酸对BALB-neuT模型中负责肿瘤-骨髓环路的MMP-9的影响。小鼠对长期治疗和可能对人类有毒的累积剂量没有表现出毒性(50). 未来的实验将在临床安全的方案中使用唑来膦酸盐，以测试我们的研究结果的有效临床前价值。然而，在自发性乳腺癌的BALB-neuT模型中，我们可以得出这样的结论：MMP-9的抑制通过相互提供生长因子（VEGF）和促进肿瘤生长（巨噬细胞）和免疫抑制（MDSC）的细胞，打破了连接肿瘤和骨髓的恶性循环，氨基二磷酸钠可以用作MMPI。我们的结果表明，可以使用氨基-二磷酸MMPI活性作为佐剂来对比肿瘤诱导的造血和免疫障碍。
致谢
拨款支持：意大利癌症协会（Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro）和意大利卫生部以及国家癌症研究所（National Cancer Institute）资助P01 CA072006和U01 CA105379（Z.Werb）。
工具书类
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