摩尔癌症研究。作者手稿；PMC 2009年8月1日提供。
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钙粘附素-11促进前列腺癌细胞向骨转移
,2 ,6 ,1 ,1 ,2 ,7 ,5 ,4 ,4 ,三 ,2和1,2
Khoi Chu公司
2得克萨斯大学M.D.Anderson癌症中心泌尿生殖医学肿瘤系，得克萨斯州休斯顿，邮编77030
香苍叶
1德克萨斯大学安德森癌症中心分子病理学系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
李宇晨
1德克萨斯大学安德森癌症中心分子病理学系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
阿马多·J·苏里塔
2得克萨斯大学安德森癌症中心泌尿生殖医学肿瘤系，得克萨斯州休斯顿77030
Dung-Tsa Chen先生
7佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学莫菲特癌症中心和研究所生物统计部
李元裕
5德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院医学系，邮编77030
隋章
4德克萨斯大学安德森癌症中心心脏科，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
爱德华·T·叶
4德克萨斯大学安德森癌症中心心脏科，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
米奇·C·T·胡
三德克萨斯大学分子和细胞肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿M.D.安德森癌症中心，邮编77030
克里斯托弗·洛戈塞提斯
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心泌尿生殖医学肿瘤系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
苏华林
1德克萨斯大学安德森癌症中心分子病理学系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心泌尿生殖医学肿瘤系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
1德克萨斯大学安德森癌症中心分子病理学系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
2德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心泌尿生殖医学肿瘤系，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
三德克萨斯大学分子和细胞肿瘤学系，德克萨斯州休斯顿M.D.安德森癌症中心，邮编77030
4德克萨斯大学安德森癌症中心心脏科，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
5德克萨斯州休斯顿市贝勒医学院医学系，邮编77030
6台北医科大学及医院病理科，台北，台湾
7佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学莫菲特癌症中心和研究所生物统计部
通讯员：科伊·朱，德克萨斯大学安德森癌症中心泌尿生殖医学肿瘤系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号，邮编77030。电话：713-794-1560；传真：713-834-6084；gro.nosrednadm@uhck公司或Sue-Hwa Lin，分子病理学系，德克萨斯州休斯顿霍尔科姆大道1515号德克萨斯大学安德森癌症中心89单元，邮编77030。电话：713-794-1559；传真：713-834-6084；gro.nosrednadm@尼尔斯 摘要
骨是前列腺癌最常见的转移部位。前列腺癌细胞转移到骨骼的机制尚不完全清楚，但前列腺癌细胞和骨骼细胞之间的相互作用被认为会启动转移细胞在该部位的定植。在这里，我们发现钙粘蛋白-11（也称为成骨细胞-钙粘蛋白）在来自骨转移的前列腺癌细胞系中高度表达，并且与重组钙粘蛋白11有很强的亲同性结合在体外利用钙粘蛋白-11特异性shRNA（PC3-shCad-11）下调骨转移衍生PC3细胞中钙粘蛋白11的表达，显著降低这些细胞与钙粘素-11的粘附在体外在转移小鼠模型中，心内注射PC3细胞导致这些细胞向骨转移。然而，当这些细胞的钙粘蛋白-11表达被沉默时，该模型中PC3向骨转移的发生率大大降低。通过检测前列腺癌标本中钙粘蛋白-11的表达，进一步研究了钙粘蛋白11在前列腺癌转移中的临床相关性。正常前列腺上皮细胞不表达Cadherin-11，但在前列腺癌中检测到，其在淋巴结尤其是骨的原发性到转移性疾病中的表达增加。在其他器官发生的转移病灶中未检测到Cadherin-11的表达。总之，这些发现表明钙粘附素-11参与前列腺癌细胞向骨的转移。
关键词：前列腺癌，骨转移，钙粘蛋白-11，成骨细胞
介绍
前列腺癌是男性中最常见的癌症。这种疾病的死亡率主要是由于肿瘤细胞转移到次要部位，尤其是骨骼。前列腺癌转移到骨骼的频率很高，导致显著的发病率和死亡率(1). 雅各布斯等。(2)据报道，80%的前列腺癌患者尸检时有骨转移。最近的一项快速尸检研究也报告称，约80%死于前列腺癌的患者有骨转移(三)进一步证实前列腺癌骨转移的发生率。阐明前列腺癌细胞对骨倾向的生物学基础可能会导致预防或治疗前列腺癌转移的策略。
癌细胞向远处转移是一个多步骤的过程，包括癌细胞从原发部位移出，在循环中存活，附着到远处的靶器官，并在靶器官中生长(4,5). 目前尚不清楚循环中的癌细胞是如何传播到特定器官部位的。介导转移癌细胞与靶器官中细胞之间相互作用的粘附分子可能在癌细胞传播中发挥中心作用。前列腺癌细胞对骨的嗜性表明，前列腺癌细胞可能优先与骨微环境（6-48）中的特定细胞相互作用，其中最可能的候选细胞是成骨细胞。具体而言，播散性前列腺癌细胞与成骨细胞的相互作用可能是导致前列腺癌细胞定植骨的步骤之一。
为了寻找与骨转移有关的分子，我们进行了基因阵列分析，以确定前列腺腺泡癌和前列腺导管癌之间差异表达的基因，前者倾向于向骨转移，后者倾向于向其他器官部位转移(9). 我们发现，包括钙粘蛋白-11（也称为成骨细胞钙粘蛋白或OB-cadherin）在内的一系列成骨细胞相关基因在腺泡PCa标本中上调。由于钙粘蛋白-11是一种最初在成骨细胞中发现的亲同细胞粘附分子，因此我们推测，表达钙粘蛋白11的PCa细胞可能与成骨细胞相互作用的能力增强。
Cadherin-11，也称为成骨细胞粘附素，是一种黏附分子，在原代成骨细胞中高度表达，但在脑、肺和睾丸组织中检测到微弱信号(10). 钙粘附素-11以钙依赖的方式介导嗜同性细胞粘附(10). 其表达与成骨细胞分化相关，并可能在成骨细胞成熟过程中的细胞分选、迁移和排列中发挥作用(11).
E-cadherin是另一种介导分化上皮细胞间粘附的钙粘蛋白，其表达的改变与前列腺癌的进展有关。具体地说，E-cadherin在正常前列腺组织中高水平表达，在低级别（高分化）肿瘤中低水平表达，而在高级别（低分化）前列腺癌中最低水平表达(12). 事实上，其他人已经发现E-钙粘蛋白表达的缺失与前列腺癌的侵袭性以及E-钙粘蛋白与基质金属蛋白酶9的比例有关，以预测转移潜力(13). 尽管有一份报告(14)表明E-cadherin表达的缺失伴随着晚期前列腺癌淋巴结转移灶内前列腺癌细胞中cadherin-11的上调，而cadherin11在前列腺癌骨转移中的作用尚不清楚。我们假设钙粘蛋白-11通过介导转移性前列腺癌细胞和成骨细胞的粘附，参与前列腺癌细胞向骨的扩散。在本研究中，我们发现骨源性前列腺癌细胞系（PC3）表达高水平的钙粘蛋白-11，并且在小鼠心脏内注射后经常转移到骨骼。敲低PC3细胞中的钙粘蛋白-11抑制了这一过程。这些结果表明，钙粘附素-11在前列腺癌细胞向骨转移中发挥作用。
结果
钙粘蛋白-11在人前列腺癌细胞系中的表达
为了评估各种解剖转移的前列腺癌细胞系中钙粘蛋白-11的内源性表达，我们使用northern blot分析，发现钙粘蛋白11转录物仅存在于人骨转移（PC3）前列腺癌细胞中，而不存在于淋巴结转移（LNCaP）中及其衍生物（C4、C4-2、C4-2B）或脑转移瘤（DU145）().
钙粘附素-11在前列腺癌细胞系中的表达A、，北方印迹，B、，western印迹，以及C类免疫细胞化学染色。Cadherin-11在PC3和C4-2B细胞的细胞间接触区域的细胞膜中表达。D类，前列腺癌细胞系与钙粘蛋白-11-Fc包被孔的结合，通过荧光素酶活性与细胞数量的关系图显示。骨源性PC3细胞表现出最强的结合力。E类分析PC3与不同基质的结合。观察到PC3与钙粘蛋白11-Fc的强结合，并且这种结合被添加5 mM EDTA抑制。PC3与BSA、钙粘附素12-Fc或未涂层的结合最小。
接下来，我们使用钙粘附素-11特异的单克隆抗体检测了钙粘附素11蛋白的表达(). Western blotting显示PC3中有一条表观分子量约为100 kDa的单一条带。western blot检测到C4-2B细胞中钙粘附素-11蛋白水平很低。通过western印迹而不是通过Northern印迹检测钙粘蛋白-11，表明western印迹测定相对于Northern印迹具有更高的灵敏度，或者表明蛋白质相对于转录物具有更高的稳定性。
用于定位细胞内钙粘蛋白-11的免疫细胞化学染色显示，在PC3中，钙粘蛋白11蛋白在细胞膜上表达，主要在细胞与细胞接触的部位(). 与Western blot中观察到的结果类似，在C4-2B细胞中检测到钙粘蛋白-11的弱染色。未发现正常小鼠IgG的非特异性染色().
为了检测PC3细胞中表达的钙粘蛋白-11是否能够介导粘附，我们使用细胞-底物粘附试验来评估前列腺癌细胞与96细胞板上涂层的重组钙粘蛋白11-Fc结合的能力。前列腺癌细胞用含有吕克这样细胞就可以根据Luc活性进行量化。PC3细胞对钙粘蛋白-11-Fc的粘附活性高，C4-2B细胞对钙黏蛋白-11-Fc的粘附活性低；DU145、C4和C4-2细胞没有检测到粘附活性(). 我们进一步研究了PC3与钙粘蛋白结合的特异性(). EDTA取消了这种结合，表明这种结合是Ca2+-依赖。此外，PC3没有与钙粘蛋白-12-Fc结合，这表明这种结合是特异性的。因此，前列腺癌细胞与钙粘蛋白-11-Fc结合的能力与细胞中钙粘蛋白11的表达水平相关。总之，这些观察结果表明，在PC3和C4-2B细胞中表达的钙粘蛋白-11作为嗜同性细胞粘附分子发挥作用。
心内注射后PC3细胞向骨扩散
鉴于我们发现钙粘蛋白-11由PC3细胞表达，我们接下来测试钙粘蛋白11是否参与前列腺癌细胞向骨的转移体内采用SCID小鼠心内注射PC3肿瘤细胞的实验性转移模型。这种方法模拟了癌细胞的血行播散，并允许检查不同器官部位的转移定植过程。在它们在远处器官部位的初始粘附之后，播散的肿瘤细胞必须能够在那里增殖，以便存在足够的肿瘤细胞用于随后的检测。我们用含有以下基因的逆转录病毒载体转导PC3细胞吕克和GFP公司并检测了注射到雄性SCID小鼠左心室后产生的PC3-Luc细胞转移到骨骼的能力。通过生物发光成像跟踪PC3细胞在各个器官的分布及其在其中的生长。仅在注射后30分钟显示PC3-Luc细胞全身分布的小鼠用于进一步分析。尽管早在注射后30分钟，PC3-Luc细胞就在全身扩散，但生物发光信号在注射后60分钟显著减弱（未显示），在24小时后无法检测到()表明大多数PC3-Luc细胞无法在循环中存活体内只有一小部分扩散到组织中。值得注意的是，PC3-Luc细胞在后腿的骨室中建立了菌落(). 事实上，通过生物发光和GFP成像检测到股骨和胫骨肿瘤()发光强度在第3周和第4周之间呈指数增长(). 生物发光成像显示，在成功注射PC3-Luc细胞的三只小鼠中，有两只小鼠的骨转移定植率为67%。组织学分析表明，股骨或胫骨肿瘤通常占据了骨的原发性海绵（小梁骨骺）区域，并使骨髓细胞移位(). PC3-Luc细胞也在其他几个器官部位检测到，包括舌下腺、下颌和肾上腺(). 这些观察结果表明，心内注射PC3-Luc细胞是研究前列腺癌细胞骨归巢的模型。
PC3细胞转移体内心内注射后。用荧光素酶[Luc]和绿色荧光蛋白[GFP]基因转导PC3-Luc细胞，并注入小鼠左心室。A、，单个小鼠接种肿瘤细胞后不同时间的生物发光图像。B、，两只小鼠的生物发光轨迹显示，后腿的Luc活性呈指数级增加。C、 体外生物发光（BLI）和GFP成像检测小鼠股骨肿瘤。D类、低骨密度骨肿瘤的组织学分析（左）和高（右）放大倍数。
PC3细胞中钙粘蛋白-11的敲除抑制其向骨的传播
为了测试钙粘蛋白-11是否参与前列腺癌细胞向骨骼的扩散，我们使用shRNA的逆转录病毒递送来下调PC3-Luc细胞中的钙粘蛋白-11。然后用嘌呤霉素筛选细胞以富集转导的细胞，并合并嘌呤菌素耐药细胞池。我们发现，经western blotting分析，PC3-shCad-11细胞与对照PC3-shCont细胞相比，钙粘蛋白-11的表达减少了约65%(). 同样，免疫染色显示PC3-shCad-11细胞质膜中的钙粘蛋白-11明显少于对照PC3-shCont细胞(). 敲除钙粘蛋白-11不影响细胞增殖(). 为了检测钙粘蛋白-11的表达是否对肿瘤-骨相互作用有影响，我们将PC3-shCont或PC3-shCad-11细胞与成骨细胞系MC3T3-E1共同培养。我们发现，当这些细胞与MC3T3-E1细胞共同培养时，生长速度没有显著差异(). 然而，与PC3-shCont细胞相比，PC3-shCad-11细胞对钙粘蛋白-11的敲除伴随着对钙粘蛋白11-Fc的粘附性较低(). PC3-shCont细胞的粘附活性与PC3-Luc细胞相似（数据未显示）。钙粘蛋白-11-Fc的结合特异性被钙粘蛋白-12-Fc的缺乏所证实(). 此外，在EDTA存在下，与钙粘蛋白-11-Fc的结合被取消，这一发现与嗜同性结合所需的钙一致。
在小鼠模型中，PC3细胞中钙粘蛋白-11的敲除阻断了这些细胞与钙粘蛋白11的粘附，并降低了后腿转移的发生率。一，，Western blotting显示，经shRNA处理的PC3细胞中钙粘蛋白-11的表达降低至钙粘蛋白11（定量显示为正确的).B、，PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞中钙粘蛋白-11的免疫细胞化学染色。Cy3标记的钙粘蛋白-11位于PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞膜上（左）。用DAPI核染色覆盖Cy3标记的钙粘蛋白-11以定位细胞（中间）。阴性对照鼠IgG染色，DAPI覆盖（右）。C类，PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞的增殖率没有差异体外试验。D类PC3-shCont或PC3-shCad-11与MC3T3-E1成骨细胞共培养。成骨细胞的存在并不影响PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞的增殖。E类细胞-底物分析表明，钙粘蛋白-11的敲除降低了对钙粘蛋白11-Fc的粘附。BSA，牛血清白蛋白。F类经shRNA和钙粘蛋白-11处理的PC3-Luc细胞在心脏内注射后，在小鼠后腿形成的骨骼转移少于经打乱shRNA控制载体处理的细胞。G公司，PC3-shCont和PC3-shCad-11骨的酒石酸盐抗性碱性磷酸酶染色显示，这两种类型的细胞都诱导了溶骨性骨损伤。肿瘤细胞（T）附近的骨表面观察到放大区域，显示存在抗酒石酸碱性磷酸酶阳性细胞（紫色染色，箭头）。
为了研究钙粘蛋白-11对PC3-Luc细胞骨转移能力的影响，我们将PC3-shCad-11和PC3-shCont细胞注射到SCID小鼠的左心室，并用生物发光成像观察这些细胞的分布。约80%的小鼠体内细胞的全身分布表明注射成功。然后在注射后10、23和33天获得图像，以监测肿瘤细胞定植情况，并在第36天对小鼠实施安乐死。如前一节所述，PC-Luc细胞的首选骨骼部位是后肢（股骨或胫骨）。大约67%注射PC3-shCont细胞的小鼠在股骨或胫骨发生肿瘤，但只有25%注射PC3-sh Cad-11细胞的小鼠会在这些部位发生肿瘤(). 注射小鼠后肢的宏观解剖和组织学分析（与注射PC3-Luc细胞的小鼠一样[])证实Luc信号与肿瘤细胞的存在相对应（数据未显示）。PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞系以与PC3-Luc细胞相似的频率在颌下腺、下颌和肾上腺定植(). 这些实验重复了两次，得到了类似的结果。总共，注射PC3-shCont细胞的15只小鼠中有9只（60%）出现了骨转移，而注射PC-shCad-11细胞的13只小鼠中只有3只（23%）出现骨转移(P（P）= 0.049, χ2测试）。我们还收集了注射小鼠的所有显示荧光素酶信号的器官，并检查了组织切片中是否存在肿瘤细胞。我们发现这两种细胞系在舌下腺、下颌骨和肾上腺中的定植频率相似(). 无论钙粘蛋白-11的水平如何，大多数小鼠的胸腔也观察到肿瘤，这可能是由于心脏注射时肿瘤细胞溢出所致。这些观察结果表明，PC3-Luc细胞中钙粘蛋白-11的下调可降低该模型中股骨或胫骨的转移率，但不会降低其他部位的转移率。
表1
| 单元格行 | 后肢 | 肾上腺 | 肝脏 | 胰腺 | 淋巴结 | 舌下腺 | 下颌骨 | 胸腔 |
|---|
| PC3-sh续 | 9/15 (60%) | 10/12 (83%) | 5/12 (42%) | 6/12 (50%) | 1/9 (11%) | 12/12 (100%) | 12/12 (100%) | 6/9 (66%) |
| PC3-shCad-11 | 3/13 (23%) | 7/11 (64%) | 3/9 (33%) | 2/9 (22%) | 1/6 (17%) | 11/11 (100%) | 11/11 (100%) | 7/8 (87%) |
| P值* | 0.049 | 0.28 | 0.7 | 0.19 | 0.76 | 1 | 0.33 | 0.31 |
虽然临床前列腺癌骨转移具有混合溶骨性成分的主要成骨细胞表型，但PC3细胞系主要诱导溶骨性病变，可能是由于DKK1的分泌(15). 为了评估钙粘蛋白-11的敲除是否对PC3细胞的溶骨表型产生影响，我们用PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞评估了小鼠骨骼。对PC3-shCont组和PC3-shCad-11组的股骨/胫骨进行组织学分析和抗酒石酸碱性磷酸酶染色，这是破骨细胞标记物。PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞均诱导了溶骨性损伤，肿瘤附近的骨区域存在破骨细胞(). 这些观察结果表明，钙粘蛋白-11的下调并不影响PC3诱导的溶骨性病变。
人前列腺癌组织中钙粘蛋白-11的表达
Tomita等人的前一份报告(14)表明前列腺癌原发肿瘤和淋巴结转移标本中E-cadherin表达缺失伴随着cadherin-11的上调。为了将这一发现扩展到骨转移，我们通过免疫组织化学染色检测了局限性或转移性前列腺癌男性标本中钙粘蛋白-11的表达。正常人骨和骨肉瘤标本作为阳性对照。正如预期的那样，抗钙粘蛋白-11抗体染色成骨细胞和骨肉瘤细胞。IgG对照抗体未显示染色(,顶行). 在来自患有局限性前列腺癌的男性的50份前列腺组织标本中，7份（14%）上皮细胞中钙粘蛋白-11染色呈阳性；19例淋巴结内前列腺癌细胞标本中，5例（26%）呈钙粘蛋白-11染色；在18例骨内前列腺癌细胞标本中，9例（50%）显示钙粘蛋白-11染色（典型图像如,最下面一行). 在其他器官发生的转移病灶中未检测到Cadherin-11的表达（10个标本）。评估四个样本组（即原发性前列腺肿瘤、淋巴结转移、骨转移和其他转移）之间钙粘蛋白-11表达差异的双侧Fisher精确测试显示(P（P）=0.005）差异，表明至少一个样本组与其他样本组不同。三个事后（post-hoc）然后通过比较原发性前列腺癌和转移性前列腺癌标本，与双侧Fisher精确检测进行比较。只有骨转移瘤（50%）的染色与原发性前列腺癌（14%）的染色有显著差异(P（P）= 0.004) (). 这些观察结果表明，钙粘蛋白-11的表达与前列腺癌骨转移有关。
人前列腺癌标本的钙粘蛋白-11抗体染色。顶行，骨肉瘤标本显示钙粘蛋白-11阳性染色，IgG阴性染色；钙粘蛋白-11也在成骨细胞中表达。最下面一行，钙粘蛋白-11在原发性前列腺癌标本中表达（Gleason评分5+5）。邻近前列腺上皮内瘤变不表达钙粘蛋白-11。钙粘蛋白-11在淋巴结转移性前列腺癌细胞中也很明显，在更大程度上，在骨转移性前列腺肿瘤细胞中也明显存在。
表2
前列腺癌标本的病理特征及Cadherin-11染色
| 试样类型 | 样本来源 | 样品总数 | 样品数量（格里森评分） | Cadherin-11–阳性 | P（P）价值* |
|---|
| 样品数量 | % |
|---|
| 原发性前列腺肿瘤 | 根治性前列腺切除术 | 9 | 4 (6) | 1 | 7/50 (14%) | |
| 1 (7) | 0 |
| 2 (8) | 0 |
| 2 (10) | 0 |
| 经尿道前列腺切除术 | 41 | 8 (6) | 1 |
| 6 (7) | 1 |
| 6 (8) | 1 |
| 15 (9) | 2 |
| 6 (10) | 1 |
| 淋巴转移 | 近端和远端 | 19 | 不适用 | 5 | 5/19 (26%) | P（P）= 0.289 |
| 骨转移癌 | 脊椎和长骨 | 18 | 不适用 | 9 | 9/18 (50%) | P（P）= 0.004 |
| 其他转移瘤 | | 10 | 不适用 | 0 | 0/10 (0%) | P（P）= 0.589 |
讨论
我们的研究结果表明，钙粘蛋白-11可能是前列腺癌骨转移中涉及的几个粘附分子之一。具体而言，钙粘蛋白-11在来自骨转移（PC3）的前列腺癌细胞系中表达，但在来自淋巴结（LNCaP）或脑转移（DU145）的细胞系中不表达；PC3细胞中钙粘蛋白-11主要位于细胞间连接处；PC3细胞对钙粘蛋白-11的粘附性更强在体外与其他前列腺癌细胞系相比。此外，心脏内注射后，表达钙粘蛋白-11的PC3细胞在骨中的定植率很高，但用shRNA敲除这些细胞中的钙粘蛋白11后，定植率降低。最后，人体标本显示，骨中前列腺癌细胞表达钙粘素-11的频率高于淋巴结中的细胞，而其他器官部位的转移癌细胞不表达钙粘蛋白-11。总之，我们的研究结果表明钙粘蛋白-11与前列腺癌向骨的转移有关。
钙粘蛋白-11如何参与这一过程的确切机制尚不清楚。一种可能性是，钙粘蛋白-11通过增加癌细胞与骨骼中成骨细胞的结合，增加前列腺癌向骨转移的可能性。癌细胞在骨中的滞留增强可以通过旁分泌因子促进癌细胞和成骨细胞之间的分子相互作用，这一过程被认为对前列腺癌细胞在骨骼中的生存和生长至关重要(16,17). 此外，通过钙粘附素-11的粘附很可能使前列腺癌细胞和成骨细胞进行更紧密的物理接触，从而允许配体保持膜结合和不扩散的近交互相作用（例如Notch-Delta信号）。
除粘附外，通过钙粘附素-11的信号转导也有望调节癌细胞、成骨细胞或两者的细胞功能。与其他钙粘蛋白家族成员一样，钙粘蛋白-11含有一个可能与连环蛋白结合的细胞质尾部(18,19). 已经证明，连环蛋白在细胞信号传递中起作用，并将钙粘蛋白与细胞骨架联系起来。一些研究也表明钙粘附素可以调节受体酪氨酸激酶信号(18). 这些研究大多集中于E-钙粘蛋白，在较小程度上，N-钙粘蛋白和VE-钙粘蛋白(20)据报道，在成纤维细胞中，钙粘附素-11介导的细胞-细胞接触诱导了血管内皮生长因子（VEGF）-D的表达。在前列腺癌细胞中测试这种可能性时，我们发现LNCaP细胞中钙粘蛋白-11的过度表达并没有增加VEGF-D的表达（数据未显示）。在乳腺癌细胞中，通过转染钙粘蛋白-11的表达可以增加这些细胞的侵袭性和迁移性在体外(21). 然而，钙粘蛋白-11在LNCaP细胞中的过度表达对这些细胞的侵袭性或迁移特性没有影响，分别通过基质凝胶侵袭试验和伤口愈合试验测定（数据未显示）。这些观察结果表明，钙粘蛋白-11在不同的细胞类型中诱导不同的细胞反应。在成骨细胞中，通过N-cadherin或cadherin-11的细胞间粘附和信号转导与成骨细胞分化有关在体外和体内(19,22). 由于钙粘蛋白的反应因其亚型和表达它们的细胞类型而异，因此钙粘蛋白-11在不同细胞类型（即前列腺癌细胞和成骨细胞）之间的相互作用中如何传递信号尚待确定。
前列腺癌细胞中钙粘蛋白-11表达增加的机制尚不清楚。据报道，前列腺癌细胞从上皮性E-钙粘蛋白表达转变为间质性钙粘蛋白-11表达(14)可能通过肿瘤发生中常见的上皮-间充质转化（EMT）(23). 有趣的是，前列腺癌细胞倾向于表达通常由成骨细胞表达的分子，包括骨钙素(24,25)，骨连蛋白(26)，骨桥蛋白(27–29)，骨唾液蛋白(24,29)NF-κB配体受体激活剂和骨保护素(30). Koeneman等人首次描述了这种被称为仿骨的现象，他们假设这种现象有助于前列腺癌细胞在骨中优先生长(31). EMT由细胞外信号（包括生长因子和细胞外基质）的相互作用触发(32). 在前列腺癌进展过程中，EMT涉及许多因素，因此也涉及许多信号通路，Huang等人(33)最近发现β2-微球蛋白（β2M）是维持前列腺癌细胞骨表型的一个因子。此外，Zayzafoon等人(34)表明Notch激活对前列腺癌细胞获得“成骨样”特性至关重要。β2M、Notch信号或其他因素是否参与前列腺癌细胞中钙粘蛋白-11的表达尚待证实。
转移性前列腺癌细胞和器官特异性内皮细胞之间的相互作用也被认为是器官特异性转移的重要步骤，因为循环中的前列腺癌细胞必须首先通过粘附骨髓内皮细胞而在窦状窦处停滞，然后在进入骨环境之前通过内皮层迁移(6,7). 前列腺癌细胞膜上的整合素有助于这些细胞与骨髓内皮细胞的粘附(5). 另一种膜蛋白CXCR4是基质细胞衍生因子-1（SDF-1或CXCL12）的受体，也由前列腺癌细胞表达(35). 由于内皮细胞、成骨细胞和一些基质细胞表达SDF-1，CXCR4/SDF-1通路可能参与前列腺癌转移。这些观察结果表明，转移性前列腺癌细胞与其他宿主细胞之间的额外相互作用可能有助于循环前列腺癌细胞向骨的取向。在我们的研究中，人类前列腺癌标本的免疫染色显示，只有50%的人类骨转移标本显示钙粘蛋白-11染色。因此，钙粘蛋白-11是前列腺癌细胞骨归巢的众多因素之一。
就临床应用而言，钙粘附素-11可能是前列腺癌患者骨转移进展诊断的候选标记物。无法预测哪些患者将发展为转移性疾病仍然是前列腺癌管理的一大挑战，导致一些患者治疗过度，而另一些患者治疗延迟或不足。虽然血液中循环前列腺癌细胞的存在表明肿瘤细胞已经从原发部位扩散，但循环肿瘤细胞与骨转移之间的联系的性质仍存在争议(36). 可能只有一部分循环肿瘤细胞具有靶向骨骼的必要特性。我们的研究结果表明，钙粘蛋白-11在前列腺癌向骨转移中发挥作用。钙粘蛋白-11在前列腺癌骨转移临床应用中的进一步发展是有保证的。
材料和方法
细胞，动物
人类前列腺癌细胞系LNCaP和DU145来自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。骨转移细胞系PC3由I.J.Fidler博士（M.D.Anderson癌症中心）善意提供。LNCaP衍生物C4、C4-2和C4-2B(37)是L.Chung博士（埃默里大学）送的礼物。所有前列腺癌细胞系均在37°C和5%CO条件下生长2在含有10%胎牛血清的RPMI培养基（Invitrogen）中。
SCID小鼠从Jackson实验室购买，并在M.D.Anderson的动物设施中饲养。所有涉及动物的实验程序都是按照机构和政府的要求进行的，并得到了M.D.Anderson动物护理和使用委员会的批准。
蛋白质印迹
细胞在细胞裂解缓冲液（10 mM Tris–HCl[pH7.5]，含有0.5%Nonide P-40，0.5 mM CaCl）中进行裂解2和蛋白酶抑制剂（罗氏））。在4%–12%NuPAGE Bis-Tris梯度凝胶（Novex/Invitrogen）上通过凝胶电泳分离全细胞提取物，并转移至Protran硝化纤维素膜（Schleicher&Schnell）。使用小鼠抗Cad11抗体（5B2H5；Invitrogen）进行免疫印迹，并使用化学发光检测试剂盒（Pierce Biotechnology）检测信号。用山羊抗肌动蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology）对膜进行重新探测。
免疫细胞化学分析
细胞在Lab-Tek II室载玻片（Nunc）上生长48 h，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，用冷甲醇固定10 min，用PBS洗涤，用PBS+0.1%Triton X-100渗透10 min，再用PBS洗涤并用5%正常驴血清、1%牛血清白蛋白（BSA）、，和0.01%Triton X-100在PBS中在室温下放置30分钟。将小鼠抗cad11抗体（1:50）置于0.5%正常驴血清和0.01%牛血清白蛋白中，并将小鼠IgG（sc-45051，Santa Cruz Biotechnology）用作对照。细胞在4°C下与一级抗体孵育过夜，然后用含有0.1%Triton X-100的Tris缓冲盐水（pH 7.8）清洗。然后将载玻片与Cy3-结合的驴抗鼠二级抗体孵育（Jackson ImmunoResearch）。载玻片用Vectashield固定介质加4′，6-二氨基-2-苯基吲哚固定，并用奥林巴斯共焦显微镜检查。
逆转录病毒的产生和转导
质粒pBMN-I-GFP（来自斯坦福大学加里·诺兰）是一种双顺反子逆转录病毒载体，允许通过内部核糖体进入位点表达感兴趣的基因和报告基因绿色荧光蛋白（GFP）。pBMN-Luc-I-GFP质粒是一种pBMN-I-GFP载体，在内部核糖体进入位点序列上游含有萤火虫荧光素酶（Luc）。利用Fugene 6（Roche）将基于pBMN的质粒转染到凤凰细胞。为了击倒钙粘蛋白-11，从Open Biosystems（克隆ID V2HS_150474）和Sigma-Aldrich（TRCN0000054334）购买了针对钙粘蛋白11的shRNA。前者以1997-2017年为基础，而后者以2405-2422人钙粘蛋白-11（NM001797）为基础。使用Fugene 6将含有人钙粘蛋白-11 shRNA敲除结构（Open Biosystems）或对照非沉默质粒的小鼠干细胞病毒转染到LinX细胞。同样，使用Fugene 6（Roche）将来自Sigma-Aldrich的shRNA慢病毒与病毒载体DNA（Invitrogen）共同转染到293FT细胞中。48小时后收集含病毒上清液，并使用Centriplus浓缩器（Millipore）进行浓缩。在32°C下，在8μg/μL聚布伦存在下，用重组逆转录病毒转导前列腺癌细胞24小时。通过FACScan（Becton Dickinson）上的荧光激活细胞分选进一步选择用Luc-I-GFP逆转录病毒转导的细胞。用1μg/ml嘌呤霉素进一步筛选转染小鼠干细胞病毒用于敲除研究的细胞14天，并通过western blotting筛选细胞池。
细胞-基质粘附试验
为了评估前列腺癌细胞与重组钙粘蛋白-11结合的能力，用PBS中的1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）从板上提取含有Luc基因的前列腺癌细胞，用结合缓冲液（10 mM HEPES[pH7.4]，137 mM NaCl，5.4 mM KCl，0.34 mM Na）洗涤一次2高性能操作45.5 mM葡萄糖和2 mM氯化钙2)，并用于细胞-基质粘附分析，如下所示。将Luc标记细胞稀释至5×105/mL，并镀在涂有Cad11-Fc或Cad12-Fc（研发系统）的96 well板中。在37°C下，允许粘附持续30分钟，然后用结合缓冲液清洗微孔一次，并用光度计（特纳生物系统）测量每个微孔的总Luc。
细胞增殖试验
将PC3-shCont和PC3-shCad-11细胞接种在6孔板中，并用血细胞仪每天计数3天。为了进行共培养研究，PC3-shCont或PC3-shCad-11以1:1的比例与MC3T3-E1共培养，并添加到24孔板中，一式三份。在特定时间点，用200μL被动裂解缓冲液（Promega）裂解细胞，并用5μL测定荧光素酶活性。
转移瘤异种移植模型
心脏内注射前列腺癌细胞体内生物发光成像被用来检测前列腺癌细胞回到骨骼的能力。用异氟醚气体和PC3-Luc、PC3-shCont或PC3-shCad-11细胞（1×10）麻醉雄性SCID小鼠（5-6周龄）6细胞/小鼠）注入左心室。在心内注射30分钟后进行生物发光成像，以检测前列腺癌细胞的分布。通过每周生物发光成像进一步监测显示全身生物发光信号的小鼠。小鼠腹腔注射150μL D-荧光素溶液（150mg/ml）。使用IVIS 200成像系统（Xenogen）采集图像并进行分析。体外还获得了尸检时从小鼠身上切除的带有肿瘤的组织的图像。
小鼠组织的组织学分析
将肿瘤组织固定在4%低温多聚甲醛中。实验结束时，组织学分析用于进一步确认特定器官中是否存在肿瘤细胞。骨标本用10%EDTA在PBS中脱钙14天。脱钙骨在中点切割并嵌入石蜡块中。连续石蜡切片用苏木精和伊红染色。按照制造商的说明，使用酸性磷酸酶试剂盒（Sigma-Aldrich，386A-1KT）进行抗酒石酸碱性磷酸酶染色。
前列腺癌标本的免疫染色
福尔马林固定石蜡包埋组织样本代表局部和转移性前列腺癌的光谱，包括根治性或经尿道前列腺切除术、淋巴结和前列腺癌转移骨的样本()来自前列腺癌组织库（由得克萨斯大学安德森癌症中心卓越研究专业计划支持）或台北医科大学和医院。
抗钙粘蛋白-11胞外结构域的山羊抗钙粘素-11抗体（R&D系统）用于免疫组化分析，如下所示。用二甲苯对四个μm厚的切片进行脱蜡，在分级浓度的乙醇中重新水化，用3%过氧化氢在甲醇中处理15分钟，用PBS清洗，用正常马血清封闭30分钟，并用抗钙粘蛋白-11（2μg/ml）在4°C下孵育过夜。用标记的链霉亲和素-生物素试剂盒以3，3′-二氨基联苯胺为显色剂（DAKO）检测抗体结合。苏木精用作副染色。当超过10%的肿瘤细胞呈免疫反应时，认为免疫染色阳性。
统计分析
采用双面Fisher精确试验检测不同器官部位（原发性前列腺肿瘤、淋巴结转移、骨转移和其他转移）的人类标本中钙粘蛋白-11表达的显著差异。P（P）小于0.05的值被认为具有统计学意义。
致谢
我们感谢安德森癌症中心科学出版部的克里斯汀·沃根编辑了这份手稿。这项工作得到了美国国立卫生研究院（CA111479、P50 CA90270和DK53176）、前列腺癌基金会、美国国防部（PC061279）的资助，以及美国临床肿瘤学会（a.J.Zurita）的青年研究员奖。
工具书类
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