美国呼吸细胞分子生物学杂志。2006年12月;35(6):662–667。
白细胞衍生的IL-10减少与慢性吸入内毒素相关的上皮下纤维化
北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心肺、过敏和危重病护理医学部;和北卡罗来纳州三角研究园国家环境健康科学研究所
信件和重印请求应发送至Stavros Garantziotis,M.D.,Duke University Medical Center,Box 3683,Durham,NC 27710,肺、过敏和重症监护医学部。电子邮件:ude.ekud.cm@100narag 摘要
内毒素(LPS)是一种革兰氏阴性细胞壁成分,具有强大的促炎特性。急性LPS暴露引起气道炎症;长期接触会导致气道高反应性和重塑。IL-10是一种重要的抗炎细胞因子,在哮喘和囊性纤维化等气道疾病患者中降低。探讨IL-10在急性和慢性脂多糖诱导的气道疾病中的生理和治疗作用。小鼠每天或一次接触雾化LPS,持续4周。终点是气道炎症、对乙酰甲胆碱的气道反应性、细胞外基质蛋白表达和组织学分析。与慢性吸入LPS的C57BL/6小鼠相比,IL-10缺陷小鼠的气道细胞数和重塑显著增加。然而,他们发现气道高反应性与较高的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型NOS(eNOS)和肺灌洗液亚硝酸盐水平有关。在骨髓移植模型中,IL-10的抗炎作用依赖于造血,而不依赖于实质IL-10的表达。诱导的上皮细胞人类IL-10表达可保护其免受LPS影响,并导致胶原蛋白生成减少。IL-10可减轻LPS诱导的慢性气道炎症和重塑。生理上,IL-10的抗炎作用是由造血细胞介导的。治疗上,腺病毒驱动的人IL-10在气道上皮中的表达足以对炎症和重塑起到保护作用。IL-10在气道高反应性中的作用是复杂的:IL-10缺乏可防止LPS诱导的高反应性,并与较高的eNOS、iNOS和气道硝酸盐水平相关。
关键词:气道高反应性、气道重塑、内毒素、IL-10
临床相关性
本研究阐明了LPS诱导的慢性气道炎症和重塑的机制,并对IL-10的作用提供了见解。IL-10被认为是一种潜在的治疗LPS诱导的慢性气道炎症和重塑的药物。
内毒素(LPS)是革兰氏阴性菌壁的一种成分,具有显著的促炎特性,在有机粉尘中浓度很高(1)和空气污染(2). 长期职业性接触LPS导致气道炎症和持续阻塞(三),而城市家庭中LPS浓度与过敏性哮喘的临床严重程度相关(4). 在动物模型中,急性吸入LPS会导致中性粒细胞性气道炎症、释放促炎细胞因子和气道高反应性(5,6)而慢性吸入LPS会导致气道炎症、持续气道高反应性和气道重塑,并伴有上皮下间隙增厚(7). 调节吸入LPS的生物反应是一个复杂的过程,需要多种细胞类型的相互作用,包括肺泡巨噬细胞(8),气道上皮(9)和平滑肌(10). 调节这一过程并最终导致气道重塑的特定细胞相互作用仍有待阐明。
IL-10是一种有效的抗炎细胞因子,对巨噬细胞和中性粒细胞具有直接的抗炎活性(11,12). IL-10通过下调细胞因子、CC趋化因子、自由基和凝血因子的释放,显著降低静脉注射LPS的炎症反应(13–15). IL-10也可能在哮喘中作为内源性抗炎剂发挥作用(16,17)和囊性纤维化(18,19). 过敏性哮喘卵清蛋白模型气道IL-10过度表达抑制气道炎症(20)以及减轻吸入LPS引起的急性肺损伤(21)和谷物粉尘暴露(22). 然而,IL-10表达在慢性炎症(临床上更相关的情况)中的作用尚未得到研究。
阐明IL-10在慢性脂多糖诱导的气道疾病中的作用将有助于更好地了解慢性炎症性气道疾病(如哮喘和囊性纤维化)的性质和机制。此外,由于气道重塑被认为是慢性炎症的后遗症,可能适合抗炎治疗,因此IL-10可能是这些疾病的有效治疗选择。我们假设IL-10可以最大限度地减少小鼠长期吸入LPS的影响,并且IL-10可以用于治疗以减少慢性LPS对气道的影响。为了验证这个假设,我们比较了IL-10缺乏(C57BL/6-IL10)患者的生物和生理反应tm1校准)急性和慢性吸入LPS后的野生型(WT;C57BL/6)小鼠。我们还使用腺病毒表达载体诱导小鼠气道中人IL-10(hIL-10)的表达,并研究了相同的终点。最后,我们使用骨髓移植来确定造血细胞衍生的IL-10或来自肺实质的IL-10是否参与调节吸入LPS的反应。
材料和方法
实验动物
C57BL/6J和C57BL/6-IL10tm1校准这些老鼠是从Jackson Laboratories(马萨诸塞州巴尔港)购买的。实验方案由杜克动物保护和使用委员会批准,并按照美国动物福利法案标准执行。
Ad5RSVhIL-10的气管内给药
Ad5RSVhIL-10(携带RSV启动子和hIL-10基因的腺病毒)购自爱荷华大学载体核心设施。总计5×108将病毒的斑块形成单位置于50μl 3%蔗糖/PBS的气管内一次。气管内感染后腺病毒载体介导的表达通常在2–3周后减弱,不足以持续4周的慢性LPS暴露。因此,对于长期接触LPS的小鼠,在气管内滴注−3、0、+3和+6天时,腹腔注射100μg抗鼠CD40L。这种处理将载体介导的表达延长到42天以上(参考文献。23以及我们的观察结果)。对照小鼠接受携带β-半乳糖苷酶基因的腺病毒(Ad5RSVLacZ)。腺病毒滴注后7天进行急性LPS暴露(未使用CD40L)。腺病毒滴注后14天开始慢性LPS暴露,以避免抗CD40L对免疫反应的影响。免疫组织化学染色显示,在急性和慢性暴露结束时,支气管和肺泡上皮细胞中存在hIL-10,但肺泡巨噬细胞中不存在。
骨髓移植
通过对6-8周龄受体小鼠进行致死性照射(1050 rad),然后接受4×106静脉注射供者骨髓细胞。嵌合组为:C57BL/6-IL10tm1校准骨髓转化为C57BL/6-IL10tm1校准收件人,C57BL/6-IL10tm1校准到C57BL/6,到C57PL/6到C57BI/6-IL10tm1校准,并将C57BL/6转换为C57BL-6。使用CD45.1阳性C57BL/6小鼠与CD45.2阳性C57B/6-IL10小鼠进行区分tm1校准移植后6周证实植入。流式细胞术检测B淋巴细胞外周植入率>99%,T淋巴细胞外周移植率83%。移植后8周开始接触LPS。
LPS暴露
冻干、重组LPS(大肠杆菌血清型0111:B4;西格玛,密苏里州圣路易斯)。LPS气溶胶的生成如前所述(7). 简单地说,我们在35 psi的恒压下使用了六喷嘴雾化器(9306型;TSI公司,明尼苏达州Shoreview)。小鼠暴露2.5小时(急性暴露),或2.5小时/天、5天/周、4周(慢性暴露)。LPS浓度通过使用定量显色鲎成釉细胞裂解物分析(QCL-1000;马里兰州沃克斯维尔Whittaker Bioproducts)对总室流出液进行取样来确定。在这些实验中,LPS气雾剂(鲎阿米巴细胞裂解物试验)的浓度为6–8μg/m三.
如前所述测量气道压力-时间指数(APTI)(24). 将小鼠麻醉、瘫痪、气管插管,并静脉注射25μg/ml、100μg/ml和250μg/ml的乙酰甲胆碱。
全肺灌洗
进行全肺灌洗,如前所述对灌洗细胞进行纺丝和染色(7). 在急性LPS暴露中,暴露后4小时处死小鼠。在长期接触LPS的情况下,在最后一次接触后3d处死小鼠,以避免混淆急性LPS效应。上清液储存在−80°C下。采用市售ELISA(明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司)测定小鼠灌洗液中TNF-α和转化生长因子(TGF-β)的水平。
亚硝酸盐含量测定
如前所述测量整个肺灌洗液中的亚硝酸盐(25)使用NOA 280(Sievers,Boulder,CO)。
组织准备
用0.9%的生理盐水灌注肺部,取下右肺,用液氮冷冻snap,并储存在−80°C下,用4%多聚甲醛在PBS中滴注并固定左肺。将组织包埋在石蜡中,如前所述对5μm切片进行染色(7).
实时RT-PCR
使用Trizol方法分离总肺RNA。hIL-10、鼠IL-10、鼠胶原I、III和IV、纤连蛋白、eNOS、iNOS、神经元NOS和S公司-亚硝基谷胱甘肽还原酶使用SYBR-Green分析和7900HT序列检测系统(加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司)进行检测。每个基因的荧光值均归一化为家政基因的荧光数值,并表示为对照组的折叠变化。
形态计量分析
如前所述,在支气管横切面(Masson-Trichrome染色)上测量横截面积(7). 简单地说,根据气道管腔直径,所有气道轮廓被分为小(⩽90μm)、中(>90-129μm)和大(>129μm)。对于每个剖面,上皮下面积均与相邻基底膜的长度一致。对每只动物的测量值进行平均。数据以各组平均值±SEM的形式报告。
免疫组织化学分析
使用各自的山羊抗体(R&D Systems)和Vectastain ABC(Vector Laboratories,Burlingame,CA)对人和小鼠IL-10进行染色。
统计分析
所有数据均表示为平均值±SEM。各组之间的个体比较由双尾学生的吨测试。使用SPSS软件(SPSS公司;伊利诺伊州芝加哥)进行统计计算。概率值P(P)<0.05(双尾)被认为具有统计学意义。
结果
hIL-10减轻小鼠急性LPS暴露后气道炎症
首先,我们试图证实hIL-10在改善LPS诱导的小鼠炎症中的功效。在一次急性LPS吸入激发后,IL-10缺乏小鼠与C57BL/6对照动物相比,全肺灌洗液中的细胞数和TNF-α蛋白显著增加(). 相反,C57BL/6小鼠气道中hIL-10的表达导致细胞和TNF-α浓度降低。IL-10缺陷小鼠气道中hIL-10的表达在细胞和TNF-α方面重建了WT表型(与C57BL/6小鼠无统计学差异)。
表1。
IL-10减少急性LPS暴露后全身冲洗液中的细胞炎症和前炎症细胞因子的产生
| IL-10缺乏 | C57BL/6型 | IL-10–缺乏表达hIL-10 | C57BL/6表达hIL-10 |
---|
细胞总数/ml冲洗液 | 1,134.0 ± 169.1 | 469.5 ± 45.8* | †594.4 ± 61.5 | 245.4 ± 43.5‡ |
中性粒细胞/ml灌洗液 | 1,082.6 ± 162.6 | 446.9 ± 46* | 563 ± 59.8* | 232.6±43.5‡ |
TNF-α(pg/ml灌洗液) | 4,284.8 ± 545.9 | 2,864.6 ± 297.8† | 1,404.3 ± 419.4* | 564.9±105.6‡ |
IL-10减轻慢性LPS暴露后气道炎症和重塑
IL-10对慢性LPS暴露后细胞气道炎症和重塑有显著影响(和). IL-10缺陷小鼠气道中的炎性细胞在统计学上显著增加,而hIL-10表达小鼠的细胞显著减少。此外,实时RT-PCR显示慢性LPS暴露结束后,C57BL/6小鼠IL-10表达增加350%(). 与LPS暴露的C57BL/6小鼠相比,IL-10缺乏小鼠气道上皮下间隙显著增厚(和). 在另一项实验中,与对照病毒治疗的小鼠相比,表达hIL-10的小鼠气道上皮下区域的厚度显著降低(和). 在4周恢复期后,IL-10缺乏小鼠和C57BL/6小鼠的上皮下厚度没有差异(未显示)。慢性LPS暴露3天后或4周后,IL-10缺乏动物和对照动物的I、III、IV型胶原和纤维连接蛋白mRNA表达没有显著差异(). IL-10缺乏小鼠灌洗液中TGF-β1的总水平显著高于IL-10缺乏鼠(616.3±67.6 pg/ml对399±43.9 pg/ml;P(P)=0.02);然而,TGF-β1活性水平相似(113.2±11.6 pg/ml对94.6±23.7 pg/ml)。与对照小鼠相比,在气道中表达hIL-10的小鼠肺中胶原蛋白I和III的表达显著降低().
表2。
| IL-10缺乏 | C57BL/6型 | C57BL/6表达hIL-10 |
---|
细胞总数/ml冲洗液 | 813,234 ± 124,449* | 479,285 ± 79,350† | 263,100 ± 16,486 |
巨噬细胞/ml灌洗液 | 692,222 ± 118,654 | 382,764 ± 72,194 | 230,876 ± 25,292 |
巨噬细胞百分比 | 83.8 ± 3.2 | 78.8 ± 3.5 | 87.2±6.3 |
表3。
用实时RT-PCR评估慢性LPS暴露后mRNA的表达,表达为对照的百分比
| 慢性接触后3天
| 慢性接触后4周
|
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| 白细胞介素-10 | 胶原蛋白I | 胶原蛋白III | 纤维结合蛋白 | 胶原蛋白III | 胶原蛋白IV | 电子NOS | iNOS系统 |
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控制 | 100 ± 4.5 | 100 ± 1.5 | 100 ± 3.7 | 100 ± 3 | 100 ± 0.8 | 100 ± 1.2 | 100 ± 3.7 | 100 ± 3.7 |
IL-10缺乏 | ND(无损检测) | 90.5 ± 8.7 | 421.6 ± 88.3* | 1576±217‡ | 170.0 ± 38.8* | 282.0 ± 22.5‡ | 133.9 ± 11.1* | 153.1 ± 8.6* |
C57BL/6型 | 345.2 ± 94* | 105.6 ± 10.7 | 329.1 ± 129.1* | 1,375 ± 395‡ | 183.9 ± 57.9* | 276.9 ± 46.3‡ | 92.9 ± 9.2 | 111.1 ± 11.2 |
表达hIL-10的C57BL/6 | NM公司 | 144.4 ± 26.7 | 265.0 ± 24.8* | 686 ± 133‡ | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 |
表达LacZ的C57BL/6 | NM公司 | 348.5 ± 72.5* | 464.2 ± 113.8† | 1,421 ± 410† | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 不适用 |
慢性LPS暴露后气道改变。(一个)IL-10缺乏小鼠。(B类)C57BL/6小鼠。(C类)表达hIL-10的小鼠。(D类)C57BL/6小鼠暴露于相同时间的盐水中(对照组)(Masson-Trichrome)。
慢性LPS暴露后上皮下间隙厚度的立体测量。(一个)在停止接触后第3天,IL-10缺陷小鼠的上皮下间隙厚度显著增加(*P(P)与所有其他组相比<0.001)。C57BL/6小鼠上皮下间隙中度增厚(†P(P)与对照C57BL/6小鼠相比<0.001;P(P)与对照IL-10缺陷小鼠相比,<0.05)。填充条形图IL-10 KO PBS;开放式酒吧,C57BL/6 PBS;阴影条IL-10 KO PBS;条纹条,C57BL/6 LPS。(B类)与表达β-半乳糖苷酶的对照小鼠相比,表达hIL-10的C57BL/6小鼠的上皮厚度降低(*P(P)与所有其他组相比<0.001;†P(P)与对照动物相比<0.05)。填充条形图,AdhIL-10 PBS;开放式酒吧、AdLacZ PBS;阴影条,AdhIL-10脂多糖;条纹条、AdLacZ LPS。(C类)在骨髓移植模型中停止暴露后第3天。接受IL-10缺陷骨髓的小鼠无论是何种受体菌株,都显著增加了大、中型气道上皮下间隙的厚度(*P(P)< 0.05).开放式酒吧、IL-10 KO骨髓对IL-10 KO-小鼠的影响;浅灰色条、IL-10 KO骨髓对C57BL/6小鼠的作用;深灰色条、C57BL/6骨髓对IL-10 KO小鼠的影响;实心钢筋,C57BL/6小鼠骨髓。
我们之前已经证明,即使在恢复4周后,慢性LPS暴露也会导致对乙酰甲胆碱的气道反应性增加(7). 有趣的是,APTI在这一点上表明,与C57BL/6对照动物相比,经LPS治疗的IL-10缺陷小鼠的气道高反应性降低(). 这与支气管肺泡灌洗液中亚硝酸盐水平的统计升高有关(154.4±18.3nM对79.4±7.8nM,P(P)<0.01),eNOS和iNOS的mRNA表达增加(). 神经元NOS和S公司-亚硝基谷胱甘肽还原酶在各组之间没有差异(数据未显示)。
慢性吸入LPS暴露后气道高反应性(以APTI测量)(*P(P)< 0.01).开放式酒吧慢性LPS后3d IL-10缺乏;阴影条慢性LPS后3d,C57BL/6;条纹条慢性LPS后4周IL-10缺乏;实心钢筋,慢性LPS后4周C57BL/6。
造血而非结构细胞衍生IL-10对减轻LPS暴露后气道重塑的重要性
为了研究IL-10的来源对气道重塑的影响是否重要,我们通过将C57BL/6小鼠的骨髓移植到IL-10缺乏小鼠中,创建了在白细胞中表达IL-10但在结构细胞中不表达IL-10的骨髓嵌合体小鼠(WT>敲除[KO])(). 相反,在结构细胞而非白细胞中表达IL-10的小鼠()通过将IL-10缺陷小鼠的骨髓移植到C57BL/6小鼠(KO>WT)中创建。对照组通过将相同菌株的骨髓移植到小鼠(WT>WT和KO>KO)来创建。我们发现白细胞衍生的IL-10对减轻慢性LPS暴露后的气道重塑至关重要。与白细胞介素-10缺乏的小鼠相比,表达IL-10的白细胞的小鼠的上皮下增厚显著减少,无论其肺实质中是否表达IL-10(). 在形态计量学分析中,与仅在结构细胞中表达IL-10的小鼠相比,在白细胞中表达IL-10的小鼠(WT>KO和WT>WT)显著减少了上皮下间隙的厚度().
慢性LPS暴露后的气道重塑,骨髓移植模型。(一个)IL-10缺陷的骨髓植入IL-10缺陷小鼠。(B类)IL-10缺陷的骨髓植入C57BL/6小鼠。(D类)C57BL/6骨髓植入IL-10缺陷小鼠。(E类)C57BL/6骨髓植入C57BL-6小鼠。箭头之间描绘了上皮下间隙的厚度。(C类和F类)接受IL-10缺陷骨髓的C57BL/5小鼠IL-10的代表性免疫组织化学研究(C类)和接受C57BL/6骨髓的IL-10缺陷小鼠。注意IL-10缺陷白细胞无染色(箭头, [C类])和IL-10缺乏的支气管上皮(F类). IL-10阳性白细胞也显示在(F类) (箭头).
讨论
我们的研究结果表明,IL-10可以减少LPS诱导的炎症和气道重塑。在骨髓移植模型中,白细胞IL-10的表达足以减轻吸入LPS的慢性影响,而结构细胞IL-10单独表达则不能。此外,在气道上皮细胞中诱导表达hIL-10可恢复IL-10的保护作用,这表明在治疗目的中,气道IL-10的来源可能是次要的。我们的结果支持了IL-10在减轻LPS诱导的气道疾病方面有效的概念,表明IL-10可能对慢性炎症性疾病,如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)有治疗作用。
本研究和该实验室以前的研究表明,反复急性炎症可导致气道重塑。我们以前也证明炎症减轻可以减轻慢性呼吸道疾病(7,26,27). 在这组研究中,慢性LPS暴露使内源性IL-10的mRNA表达增加了350%,而诱导的IL-10表达对慢性LPS吸入的影响具有保护作用。相反,慢性气道疾病患者,如哮喘、COPD和囊性纤维化,内源性IL-10水平降低(17,19)提示IL-10可能在面对环境侮辱或损伤时对维持肺结构内稳态至关重要。这些患者经常被革兰氏阴性微生物定植,这些微生物是脂多糖的稳定来源,并且可能更容易受到环境脂多糖来源的影响(28). 这些患者可能至少在两个方面易受吸入LPS的影响:第一,IL-10基线水平降低;其次,慢性暴露后未能适当增加IL-10的表达(16,18). 在我们的手上,气道中IL-10的诱导表达显著降低了急性LPS暴露后的炎症程度。更重要的是,我们证明慢性(反复)LPS暴露后,气道重塑和肺胶原沉积显著减少。重塑可以解释哮喘患者和COPD患者肺功能加速下降的原因(29). 我们的结果表明,从长远来看,适当控制急性炎症发作将导致重塑减少。因此,外源性IL-10可能被证明是一种有效的治疗剂,可以减少慢性炎症性呼吸道疾病的持续影响。
造血细胞对吸入LPS的反应至关重要(7,8). 本研究表明,造血细胞可以通过产生IL-10来自动调节其对LPS的炎症反应。从长远来看,这可能是对气道持续环境暴露的适应。气道上皮细胞Toll样受体(TLR)4表达降低(30). 造血细胞可能是吸入LPS的主要反应细胞,需要自动调节其炎症反应。在过敏性气道炎症的卵清蛋白模型中,调节性T细胞的过继转移以IL-10依赖的方式改善炎症(31). 我们的骨髓移植结果表明,IL-10对慢性LPS诱导的重塑具有类似的造血细胞依赖性作用。此外,我们证明,通过腺病毒载体在气道上皮细胞中诱导表达IL-10可以减少LPS暴露后的炎症反应。这意味着,无论以何种方式给药,将IL-10药物输送到气道都会减轻LPS诱导的炎症。
我们证明IL-10缺乏似乎可以保护LPS诱导的气道高反应性。尽管炎症增加,但IL-10缺乏的保护作用尤其令人感兴趣。以往对过敏性致敏卵清蛋白模型的研究也得出了同样的结果(32,33). 阿梅雷德斯及其同事最近提出了一种可能的机制(34). 这些研究人员表明,IL-10缺乏的小鼠气道增加了NO的生成,降低了乙酰甲胆碱的基线反应性。在这项长期接触LPS的研究中,气道阻力的侵入性测量(APTI)显示出气道高反应性的类似降低,我们检测到IL-10缺乏小鼠亚硝酸盐水平以及iNOS和eNOS的表达增加。虽然这一发现并不能明确证明IL-10缺乏症的低反应性机制,但它确实支持了之前在气道炎症过敏模型中的观察结果(35).
总之,我们已经证明了IL-10在气道慢性LPS暴露反应中的重要作用。体内白细胞衍生IL-10可减轻慢性吸入LPS暴露后的气道重塑。在肺中诱导IL-10表达可减少LPS诱导的炎症,无论是在缺陷小鼠还是在WT小鼠中。肺IL-10的表达可能为非过敏性哮喘的治疗提供新的选择。
笔记
这项工作得到了国家环境健康科学研究所(ES11375、ES07498、ES012496、ES12717和ES011961)和退伍军人管理医疗中心(绩效评估)的资助。
最初于2006年6月29日作为DOI:10.1165/rcmb.2006-0055OC出版
利益冲突声明:作者中没有一人与对本手稿主题感兴趣的商业实体有财务关系。
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