肝和胰腺细胞的生成和再生

摘要

肝脏和胰腺协调控制身体代谢，包括肝脏中肝细胞对消化的营养物质的修饰，以及胰腺中β细胞分泌的胰岛素对血糖水平的调节。肝细胞是大型的多倍体细胞，分泌血清蛋白，表达中和毒物的酶，产生胆汁酸以帮助消化，并控制大部分中间代谢。胆管细胞是肝脏中的另一种上皮细胞类型，其胆管主要充当分泌胆汁的管道。相比之下，不同的胰腺功能被划分为更多的细胞类型。胰腺细胞包括胰岛素（β）、胰高血糖素（α）、生长抑素、生长激素释放肽和分泌内分泌类型的胰多肽，每种内分泌类型都产生一种激素。胰腺还包含外分泌细胞类型，它们构成了组织的主体，包括产生消化酶的腺泡细胞和为酶提供肠道导管的导管细胞。胰腺中细胞类型的更大多样性涉及器官发生过程中更多的调节因子和谱系决定。

临床研究表明，肝细胞移植可以长期支持衰竭肝脏的功能，纠正代谢性肝病(1). 类似地，尸体胰岛在几年内可以支持I型糖尿病患者的葡萄糖稳态，这些患者的β细胞已被自身免疫反应破坏(2). 在这两种移植环境中，供体细胞的质量和数量受到严重限制，扩大终末分化细胞群的能力也受到严重限制。这些局限性导致了对肝细胞和β细胞的其他祖细胞来源的搜索，并对如何有效地引导或“编程”这些祖细胞的分化产生了浓厚兴趣。编程工作的基础是了解肝细胞和β细胞是如何在胚胎中正常生成的，以及它们是如何在成人再生过程中产生的，以应对组织损伤和疾病。在这里，我们概述了细胞的发育和再生，并强调了该领域尚未解决的问题。

每个组织有两个祖细胞域

陆栖脊椎动物的肝脏和胰腺都是从胚胎前肠的最终内胚层上皮的两个不同空间域发育而来的。命运定位实验表明，肝脏起源于发育中的腹前肠内胚层的外侧区域(三,4)以及追踪腹中线的一小群内胚层细胞(4) (图1A). 在前肠闭合过程中，内侧和外侧区域结合在一起(图1A，绿色箭头）。胰腺也在外侧内胚层结构域中诱导，靠近肝脏外侧结构域和尾部，以及前肠背中线附近的细胞中(5,6) (图1A). 这些事件发生在小鼠妊娠8.5天（E8.5），相当于人类妊娠约三周。在区域被指定并开始形态发生芽生后，背侧和腹侧胰腺芽合并形成腺体。尽管不同祖细胞结构域的指定方式不同，但两个胰腺祖细胞结构区的后代产生内分泌和外分泌细胞，而两个肝祖细胞结构段的后代有助于肝芽细胞的分化(三-6). 需要进行遗传谱系标记研究，以确定每个组织中不同后代在功能和再生潜力方面的差异程度。

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图1

胚胎肝和胰腺规范的细胞域和信号。A.组织诱导前祖细胞域的命运图；图为E8.25（3-4体节期）理想化小鼠胚胎的前肠。绿色箭头表示外侧祖细胞区域向腹内侧区域移动。B.比a晚几个小时的小鼠胚胎的矢状图，显示新指定的肝脏和胰腺组织区域的位置。显示了内胚层模式的信号和细胞来源。蓝色虚线表示A中的视图平面。

指定肝和胰腺祖细胞的信号

鸡胚、青蛙、小鼠和斑马鱼的胚胎组织重组实验和遗传方法表明，在来自附近中胚层细胞的诱导信号的影响下，内胚层上皮中指定了肝脏和胰腺区域(7,8). 关于中胚层中的信号基因是如何控制的，我们知之甚少，但值得注意的是，在脊椎动物模型中，诱导信号是如何保存的。最初，前肠中胚层Wnt和FGF4信号的广泛抑制可促进肝脏和胰腺的诱导，而后肠中胚层Wnt信号的激活可抑制这些组织的命运(9,10)(图1B). 视黄酸信号明显来自近轴中胚层细胞，有助于进一步细化肝脏和胰腺可以从肠内胚层发育的前后位置(11-14). 随后，在腹前肠，来自心脏中胚层的FGF和来自横隔间质细胞的BMP协同诱导肝程序和抑制胰腺程序(15-18). 奇怪的是，MAPK在外侧肝祖细胞对FGF的反应中被激活，早于内侧肝祖细胞的MAPK激活，反映了模式上的明显差异(19). 在前肠闭合过程中，将尾侧移向心脏区域的侧腹内胚层细胞逃避FGF，并可启动腹侧胰腺发育(20). 在背前肠，来自脊索的信号，包括激活素和FGF，抑制内胚层内的声波刺猬（shh）信号，并允许胰腺程序(21,22). 值得注意的是，上述所有事件都发生在脊椎动物胚胎的数小时内。

胚胎中新指定的肝细胞称为成肝细胞。这些细胞表达肝细胞特异性的血清蛋白基因，例如白蛋白（alb1）和转甲状腺素（ttr），并表现为双电位，随后产生肝细胞和胆管细胞(23); 然而，正式的遗传谱系研究仍有待进行。这个Tbx3型基因通过抑制成肝细胞数量来帮助扩大成肝细胞的数量第19页^自动射频(24). 新指定的胰腺内胚层最初以转录因子基因的表达为标志Pdx1页然后Ptf1a公司(25,26)对胰腺发育至关重要；Pdx1页也在邻近的十二指肠祖细胞中表达(27,28).

发展过程中信号响应的变化

细胞对诱导信号的反应包括转录因子基因的激活和抑制，而转录因子基因反过来又引发细胞分化所需的新基因表达程序。有趣的是，新的细胞类型程序可以改变细胞对外源信号的反应。FGF就是这样的情况，它们只需要短暂的帮助形成前肠内胚层的模式(19,29)然后促进新指定祖细胞群的扩大(16,30). Shh信号最初促进斑马鱼背部胰腺发育(31,32)后来似乎抑制了它(33). Wnt信号最初抑制肝诱导(9)但不久后会促进肝芽生长和分化(9,34,35). 在脊椎动物胚胎发生的不到一天时间里，细胞对诱导信号的每一种反应都会发生变化。这些变化背后的机制尚不清楚。

器官形态发生与细胞类型分化

在指定成肝细胞和胰腺祖细胞后，相应的内胚层细胞从立方形转变为柱状，然后在上皮内变为假分层(图2). 这一过程类似于神经上皮发育的形态发生特征，并由同源盒转录因子基因在前肠中控制六角螺母(36). 胰腺上皮随后分支到基质中，形成胰腺芽，而肝上皮的基底层被破坏，细胞增殖到周围的基质中。后一种形态变化由同源盒转录因子基因控制探头1(37),Hnf6/OC-1，和OC-2型(38) (图2).六氟化氢和OC-2型调节E-cadherin、血小板反应蛋白-4和Spp1，这些蛋白在不同环境中控制细胞粘附和迁移。胎儿肝脏是羊水造血的暂时场所。因此，胎儿的生存能力取决于肝脏的正常生长。

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图2

肝芽器官发生的阶段。成肝细胞被染成蓝色（Hex^LacZ公司+); 具有橙色细胞核的细胞是肠道内胚层（FoxA2⁺); 所有细胞核DAPI染色为绿色。白色箭头指向肝细胞。指出了促进每个过渡的基因和信号。类似的形态发生阶段发生在胰腺芽器官发生期间。图像改编自(36). S、 配对体节期；E、 胚胎期。

当这两种组织的祖细胞都长入基质时，它们与邻近的内皮细胞相邻并接收来自内皮细胞的刺激信号(39-41). 有趣的是，内皮细胞也促进组织损伤后的肝再生，这显然是通过HGF信号(42). 胚胎环境中内皮细胞产生的特定分子信号尚未被描述，但由内皮传递的循环中的1-磷酸鞘氨醇可促进胰腺背侧芽生(43). 肝脏和胰腺芽中新兴的血管系统也提供氧气和营养，并最终发挥内分泌功能(44).

神经嵴细胞迁移到发育中的胰腺，当它们发育成神经元时，影响β细胞的数量(45). 内皮细胞和神经嵴细胞的刺激作用说明基质环境与肝和胰腺祖细胞的共同分化是多么重要。

在肝和胰腺芽中，notch信号成分对于在成肝细胞的肝细胞和胆管细胞数量之间建立适当的平衡非常重要(46,47)胰腺祖细胞的内分泌和外分泌细胞(48-50). Notch信号的丢失允许内分泌谱系，内分泌谱系以转录因子基因Ngn3为标志并需要Ngn3(25,48,51).

优雅的遗传谱系研究表明，随着胰腺芽发育成器官，Cpa1型-分支上皮远端的阳性细胞是多能干祖细胞，沿着分支主干产生导管和内分泌后代，直到小鼠的E14左右(52). 之后Cpa1型-阳性细胞产生腺泡细胞；这与“二次转变”的时间相对应，即在Mafa转录因子的影响下产生最终β细胞(53,54). 进一步的遗传谱系研究、引发胰腺和肝细胞分化的转录因子基因以及影响细胞生长的参数如图3并在其他地方进行了广泛审查(23,55-57). 有趣的是注意到背侧和腹侧胰腺祖细胞是如何被指定的差异(图3)这表明胰腺细胞从干细胞中分化出来的方式具有灵活性。

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图3

控制肝脏和胰腺内细胞类型谱系的调节因子。转录因子基因以粗体显示；其功能已在文本和其他地方进行了审查(23,55-57)，除了vHnf1型在肝脏发育中(81). 请注意Pdx1页最初标记十二指肠和胃尾侧祖细胞（未显示）以及胰腺区域(28).

肝脏再生

大多数形式损伤后的肝再生并不依赖干细胞或祖细胞，而是涉及成熟细胞的有丝分裂(58). 肝细胞的再生能力可以在肝再生动物模型中进行评估，其中移植细胞比宿主具有选择性优势(59). 使用这种系统已经表明，成熟的多倍体肝细胞具有与造血干细胞相媲美的干细胞样再生能力，并且能够分裂100倍以上而不丧失功能(60). 人类肝细胞也具有高度再生能力(61)重要的是，这种再生能力是在早期胚胎阶段建立的(36). 不幸的是，在细胞培养中尚无法生长和扩大肝细胞的数量或维持其分化。即使使用最复杂的生长介质，肝细胞在电镀后的几个小时内也会广泛去分化(62). 因此，成人肝细胞的功能，包括细胞分裂，似乎依赖于与三维基质中其他细胞的复杂相互作用。试图模拟这种组织的共培养系统有望解决这些问题(63).

成人肝脏还含有兼性祖细胞，这些祖细胞可以在特定损伤时被激活(图4)通常在肝细胞复制受损的情况下。祖细胞产生中间细胞类型，通常称为“卵圆细胞”，被认为可以分化为胆道上皮和肝细胞(58). 然而，卵圆细胞不是一个均匀的群体(64)他们明显的多潜能并没有被明确的血统追踪所证明。在大鼠中，卵圆细胞类似于胚胎成肝细胞，因为它们同时表达胆管和肝细胞标记物以及α-甲胎蛋白(58). 因此，成人的祖细胞激活采用了一些与发育过程中相同的遗传程序(65). 关于成人肝祖细胞的确切来源以及控制其激活的信号的细节尚不清楚。

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图4

成人肝脏和胰腺的祖细胞谱系关系。箭头的厚度表示再生的主要模式。虚线描绘了仅在特定实验条件下发生的罕见或假设的细胞命运转变。

胰腺再生

尽管肝细胞能够广泛再生，但β细胞的扩增能力更为有限，尤其是在成人中。在怀孕等生理刺激后，幼小动物可以发生一定程度的再生(66)或损伤（部分胰腺切除术）(67). 然而，这种部分生长能力不足以使1型糖尿病患者从细胞丢失中恢复过来；然而，随着自身免疫的抑制，它可能会(68). 内分泌胰腺再生能力受限可能与确定数量的胰腺祖细胞有关，这些祖细胞不能对细胞丢失作出补偿生长(69). 相反，成肝细胞可以提高其增殖率，以应对其中间的功能失调细胞(36). β-细胞缺乏再生，这引起了人们对常驻干细胞修复组织潜力的极大兴趣。成人胰腺中是否存在祖细胞仍有争议。很明显，大多数新的β细胞来源于手术损伤后已有的胰岛素表达细胞(67,70)但最近的研究表明，导管结扎可以激活导管上皮中Ngn3阳性的β细胞前体(71). 因此，成人胰腺祖细胞是存在的，它们的激活取决于特定的损伤，肝脏中的卵圆细胞也是如此(图4).

新生肝细胞和β细胞

由于细胞在评估外源性物质代谢方面的重要性，目前无法在体外扩增人肝细胞不仅是细胞治疗的障碍，也是药物开发的障碍。因此，从可膨胀的前体细胞生成肝细胞是一个非常有趣的课题。值得注意的是，与肝卵圆细胞性质几乎相同的细胞也可以出现在胰腺中，尤其是在腺泡细胞消融后(72). 移植后，这些胰腺衍生的“卵圆细胞”可以分化为功能性肝细胞和胆管(73). 一些报告表明，相互的转分化也是可能的，即肝细胞向胰腺内分泌命运的转化(74). 胰腺转录因子的强制表达可诱导肝脏中胰岛素的表达并纠正实验性糖尿病(75). 这些发现表明，成人肝脏和胰腺都含有具有共同胚胎起源表观遗传记忆的细胞。成人肝脏中潜在的β细胞前体的存在具有明显的医学意义。由于胰腺外分泌细胞的数量大大超过了β细胞，因此，通过病毒传递发育转录因子，可以对其进行重新编程，使其在体内产生功能性β细胞，这也是令人兴奋的Pdx1页,Ngn3号机组、和马法(76).

多能性干细胞，包括胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPS），是肝细胞和β细胞的潜在丰富来源。许多研究小组一直在开发ESC分化方案，试图模拟正常胚胎发育。胰腺和肝脏发育的第一步是使用激活素A诱导最终内胚层(77). BMP-4和bFGF的进一步治疗可以引导细胞向肝细胞系分化(78). 在一项针对内分泌胰腺分化制定的方案中，明确的内胚层用KGF、维甲酸、noggin和环胺依次治疗(79,80). 尽管取得了显著进展，但所产生的细胞往往无法实现再生治疗所需的完整功能，只剩下“肝细胞或β细胞样”细胞。目前尚不清楚必须如何精确地协调已知的发育信号，以便随意地对肝和胰腺细胞进行适当编程，但对激活的信号通路及其在胚胎发生过程中的相互调节作用的详细研究将提供信息。

未来展望

肝脏和胰腺发育生物学知识的医学应用出现了两个基本机会。首先是应用胚胎中存在的精确条件来分化多能干细胞。细胞外因子和辅助细胞类型（如内皮细胞和间充质细胞）的连续和精确定时使用预计将模拟胚胎发生，从而产生用于移植和其他应用的高功能衍生物。在这种情况下，有能力的细胞对作用于其表观基因组的外源信号作出反应。第二种方法是利用转录激活物、阻遏物和染色质修饰物，利用基因重编程直接改变细胞命运。这种方法既可以在体内工作，也可以在培养中工作，并且可以应用于所需细胞类型的成人表观遗传亲属。因此，可以在没有细胞移植和免疫排斥并发症的情况下原位增强组织再生。然而，当涉及到稳定的基因整合时，克服插入突变的潜在问题，以及对病毒基因传递的不希望的转基因表达变化和生理反应，将是非常重要的。总之，需要强调两种方法，即利用发育生物学的信号和调节因子塑造祖细胞和干细胞向肝和胰腺细胞命运的分化。

致谢

参考文献和注释