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循环。作者手稿；PMC 2009年2月11日提供。
以最终编辑形式发布为：
循环。2005年11月8日；112(19): 2959–2965.
2005年10月31日在线发布。 数字对象标识：10.1161/循环AHA.105.584623
预防性维修识别码：PMC2640100型
NIHMSID公司：NIHMS89187号
PMID：16260635

ROCK1患者血管周围纤维化减少，但心脏肥大不明显+/−单倍体不足小鼠

Yoshiyuki Rikitake公司、医学博士、博士，* Naotsugu Oyama公司、医学博士、博士，* 王朝容，医学博士，野田贤介、医学博士、博士，Minoru佐藤、医学博士、博士，Hyung-Hwan Kim（金贤焕）、博士和詹姆斯·K·廖，医学博士
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

Rho-GTPase及其下游靶点Rho-associated kinase（ROCK）与多种心血管疾病如心肌肥厚有关。然而，ROCK的药理抑制剂并不完全特异，也不能区分ROCK亚型ROCK1和ROCK2。为了确定ROCK1在心肌肥厚发展中的具体作用，我们生成了ROCK1+/−并确定这些小鼠的心肌肥厚和重塑是否减少。

方法和结果

乱扔的岩石1−/−C57Bl/6背景的小鼠明显缺乏代表性，表明其在宫内或出生后死亡。岩石1+/−然而，小鼠是可以存活和繁殖的，没有明显的表型异常。ROCK1中的基础血压、心率、心脏尺寸和功能+/−小鼠与野生型（WT）同窝小鼠相似。输注血管紧张素II（400纳克·千克−1·最小值−128天）或使用N个克-硝基-我-精氨酸甲酯（在饮用水中1 mg/mL，持续28天）在ROCK1中引起收缩压、左室壁厚度、左室重量、心脏重量与胫骨长度之比以及心肌细胞大小的类似增加+/−老鼠和WT的室友。相反，ROCK1中心脏血管周围纤维化的增加程度较低+/−小鼠与WT同窝小鼠的比较。这与转化生长因子-β、结缔组织生长因子和III型胶原的表达降低有关。此外，ROCK1中由经主动脉缩窄或心肌梗死引起的血管周围纤维化减少+/−小鼠与WT同窝小鼠的比较。

结论

这些发现表明，ROCK1对心脏纤维化的发展至关重要，而不是对各种病理条件的肥大的发展至关重要，并表明导致心脏肥大和促纤维化反应的信号通路是不同的。

关键词：血压、高血压、肥厚、重塑、血管紧张素

心脏重塑是一个复杂的过程，包括心肌细胞肥大、炎症、纤维化和重塑，它是对机械和神经激素刺激变化的反应。心脏肥大是对血流动力学负荷的适应性反应，在生理上对维持正常的心脏功能很重要。1然而，在某些情况下，长时间的肥厚反应成为病理性反应，增加了发生心律失常、舒张功能障碍、充血性心力衰竭和死亡的风险。2–4大量研究表明，多种信号分子如G蛋白、蛋白激酶C、有丝分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶Akt和钙调神经磷酸酶参与了肥厚反应。5这些途径有助于心肌细胞肥大以及其他细胞类型（如成纤维细胞和平滑肌细胞）的增殖和存活。

血管紧张素II（Ang II）在血压调节和肥厚反应中起着重要作用。血管紧张素Ⅱ不仅通过血压升高的间接机制，而且通过其对心肌细胞的直接作用，诱导心肌肥厚。Ang II的这些直接心肌效应涉及Rho家族小GTPase的激活，包括RhoA和Rac1。6,7RhoA调节肌原纤维组织，而Rac1通过激活心肌NAD（P）H氧化酶对产生氧化应激很重要。

Rho-associated kinase（ROCK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，介导RhoA的一些下游信号传导。8目前，ROCK有两种亚型，ROCK1和ROCK2。对ROCK的药理抑制表明，ROCK在多种心血管疾病的发病机制中起着重要作用，如脑血管和冠状动脉痉挛、高血压、血管炎症和缺血再灌注损伤。9例如，最近关于ROCK抑制剂fasudil和Y27632的研究表明，ROCK参与了大鼠心肌肥厚的发展10,11和老鼠。12在Ang II输注的大鼠模型中，口服法舒地尔可能通过抑制NAD（P）H氧化酶的表达来抑制左心室（LV）肥大，并减少血管周围纤维化和内皮超氧阴离子的产生。10同样，在喂食高盐饮食的Dahl盐敏感大鼠中，Y27632抑制了LV肥厚的发展，改善了心脏收缩功能障碍。11

尽管这些药理学研究已经证明RhoA/ROCK信号参与心肌肥厚，但在心脏过度表达RhoA的转基因小鼠不会发展为心肌肥厚。此外，ROCK抑制剂具有一定的非选择性，可能会抑制其他蛋白激酶，如蛋白激酶A和C，这些蛋白激酶对心肌肥厚的发展也至关重要。使用这些ROCK的药理抑制剂也不可能确定ROCK在心肌肥厚中的异构体特异性作用，因为它们无法区分ROCK1和ROCK2。因此，以特定ROCK等位基因为靶点的遗传方法为剖析ROCK的异构体特异性作用提供了最佳策略。因此，我们产生了单倍的ROCK1基因敲除（ROCK1+/−)并验证了ROCK1介导心脏肥大和重塑以应对Ang II的假说。

方法

ROCK1的生成+/−老鼠

构建条件靶向载体，通过同源重组删除包含ROCK1基因外显子1b的基因组片段(图1A). 引入了外显子1b两侧的两个loxP位点。将与磷酸甘油激酶（pGK）启动子（pGK-Neo）融合的新霉素耐药基因（Neo）插入外显子1b和3′loxP位点之间。5′同源臂和3′同源臂分别插入5′loxP位点的上游和3′loxP位点的下游。将线性化靶向载体注射到C57Bl/6小鼠的胚胎干细胞中。经基因组Southern印迹鉴定后，通过聚合酶链反应（PCR）筛选新霉素耐药克隆进行同源重组。通过Cre转染删除正确靶向克隆中的loxP侧翼外显子1b和pGK-Neo基因。外显子1b的缺失在外显子1中引入了一个框架移位和终止密码子，阻止了功能蛋白的进一步翻译。将正确靶向的胚胎干细胞克隆注射到C57Bl/6囊胚中。雄性杂合子ROCK1+/−将小鼠培育成C57Bl/6雌性，以获得杂合子幼崽。男ROCK1+/−本研究使用8至12周龄的小鼠及其对应物。通过Southern blot分析后代的基因型(图1B). 这些老鼠被饲养在哈佛医学院的动物设施中。哈佛医学院动物常设委员会批准了与动物实验有关的所有协议。

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ROCK1基因敲除等位基因的产生。A、 WT ROCK1等位基因、靶向载体、靶向等位基因和ROCK1-knockout等位基因的结构示意图。将含有ROCK1外显子1b侧翼loxP位点的靶向载体注入胚胎干细胞。通过Cre转染删除正确靶向克隆中的loxP侧翼外显子1b和pGK-Neo基因。显示了新霉素耐药（neo）、loxP位点（loxP）的位置；限制酶位点Bgl公司II（Bg），巴姆高（B），螺柱本人（S）和害虫I（P）；5′和3′基因组探针。B、 Southern blots显示存在WT（+）和缺失（−）ROCK1等位基因。基因组DNA从WT（+/+），ROCK1的尾部分离+/−（+/-）和ROCK1−/−（−/−）小鼠，用巴姆HI，并出现Southern斑点。C、 蛋白质印迹显示ROCK1和ROCK2的蛋白质水平。从WT（+/+）、ROCK1的心脏中提取蛋白质+/−（+/-）和ROCK1−/−（−/−）小鼠，并使用抗ROCK1、抗ROCK2和抗肌动蛋白抗体进行Western blots分析。

Ang II输液

血管紧张素II（400 ng·kg−1·最小值−1)如前所述，使用微型渗透泵（ALZET 2004型）将溶解在盐水或盐水中的液体注入。7将泵皮下植入雄性ROCK1+/−小鼠或其野生型（WT）同胞（8周龄）。

N个克-硝基-我-精氨酸甲酯处理

N个克-硝基-我-精氨酸甲酯（L-NAME）在饮用水中（1 mg/mL）给雄性ROCK1注射28天+/−小鼠或其WT同窝交配。

压力超负荷与心肌梗死小鼠模型

研究了8至12周龄雄性小鼠的压力过载和心肌梗死（MI）。经主动脉缩窄（TAC）是通过胸骨上入路产生的，只需稍加修改。TAC是用一条6-0的缝合线绑在主动脉上，用一根27 gauge的针制成的。针头缩回后，产生60%-80%的收缩，主动脉外径≈0.3 mm。心肌梗死是通过结扎冠状动脉左前降支造成的。还进行了无主动脉缩窄或冠状动脉结扎的假手术。

血压和心脏功能的无创分析

如前所述，在泵植入或L-NAME治疗前、1、2、3和4周后，采用尾剪法无创测量收缩压（SBP）和心率。7泵植入四周后，使用二维引导M型超声心动图进行超声心动图，使用15-MHz脉冲波多普勒超声心动图（SONOS 4500，安捷伦科技公司）。测量左室舒张末期直径（LVDd）、左室收缩末期直径（LVDs）、舒张室间隔厚度（IVS）和舒张后壁厚度（PW）。左心室缩短率（%FS）计算如下：[（LVDd–LVDs）/LVD]×100（%）。左室射血分数（EF）和左室质量计算如下：（LVEDV–LVESV）/LVEDV×100（%）和1.055×[（LVDd+PW+IVS）三–（LVDd）三]（mg），其中LVEDV是左室舒张末期容积，LVESV是左心室收缩末期容积。

北方印迹法

泵植入四周后，从所有小鼠中分离出心脏。根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从左心室提取总mRNA。用1.0%甲醛-淀粉凝胶电泳分离等量的总RNA（15µg），并按所述进行杂交和洗涤。7使用小鼠心钠素（ANF）的特异性引物（正向，5′-ATG GGC TCC TTC TCC ATC AC-3′；反向，5′-AAG CTG TTG CAG CCT AGT CC-3′）和小鼠结缔组织生长因子（CTGF）（正向，5′-GAG TGG GTG TGT GAC GAG CCC AAG G-3′）获得寡核苷酸探针作为PCR产物；反向，5′-ATG TCT CCG TAC ATC TTC CTG TAG T-3′）。每个探针都用随机引物DNA标记试剂盒（Takara）和[α-32P] dCTP（新英格兰核生命科学产品）。用NIH图像程序对谱带强度进行密度定量。ANF和CTGF mRNA的表达水平通过GAPDH探针再杂交进行标准化。

实时PCR

用三唑从PBS灌注的小鼠心脏提取总RNA。使用Quantitect SYBR Green RT-PCR试剂盒（Qiagen）按照制造商描述的一步方案进行扩增。使用以下引物扩增III型胶原、转化生长因子-β（TGFβ）和GAPDH部分cDNA：III型胶原：正向，5′-TGA ATG GTG GTT TTC AGT TCA G-3′，反向，5′-GGTT CAC TTG CAC TGG TTG ATA A-3′；TGFβ：正向，5′-CTC CCA CCG TGG CTT CTA G-3′，反向，5′-GTT CCA CAT GTT GCT CCA CAC TTG-3′；GAPDH：正向，5′-GCA GTG GCA AAG TGG AGA TT-3′，反向，5′-CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC-3′。然后将样品置于LightCycler（Roche）中，并使用附带的软件分析荧光曲线。GAPDH被用作内源性对照参考。折叠变化显示为相对于WT对照小鼠的折叠变化。

组织学

从心脏标本中获取石蜡切片（6µm），并用苏木精-伊红和马森三色染色。使用NIH Image软件对显微照片进行量化，以测量心肌细胞的横截面积，并评估血管周围纤维化的面积，该面积是血管周围纤维化面积与总血管面积的比值。每个心脏检查10个截面或≈40个血管；对每组8颗心脏的结果进行平均。

统计分析

结果用平均值±扫描电镜表示。所有数据均通过Student’st吨测试或单因素方差分析，然后进行Fisher精确测试进行事后分析。值为P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

结果

ROCK1分析+/−老鼠

我们分析了通过杂交ROCK1获得的61个后代+/−纯C57Bl/6背景的小鼠。杂合杂交后代的基因型分布分析表明，纯合ROCK1+/−小鼠（61只中的1只，1.6%）在3周龄时在同窝小鼠中的代表性明显不足（WT，n=20；ROCK1+/−，n=40；岩石1−/−，n=1）。然后我们分析了通过杂交雄性ROCK1获得的61个3周大的后代−/−和女性ROCK1+/−并观察到ROCK1−/−与孟德尔比率（ROCK1）的预期值相比，小鼠（61只中的10只，16.4%）的代表性也不足+/−，n=51；岩石1−/−，n=10）。部分但不是全部ROCK1−/−小鼠出生时出现眼睑闭合和脐腔缺陷，与Shimizu等人报告的结果类似。13因此，ROCK1−/−小鼠是不正常的，大多数在子宫内或出生后死亡。

通过特异性ROCK1单克隆抗体的Western blot证实ROCK1表达的部分和完全缺失(图1C). 正如预期的那样，ROCK1在ROCK1中的表达水平+/−心脏大约是WT心脏的一半。ROCK1缺失对ROCK2表达没有补偿性上调。在本研究中，我们使用了ROCK1+/−小鼠，它们可以存活和繁殖，没有发育或大体解剖异常。

ROCK1单倍体缺失对血管紧张素Ⅱ诱导高血压的影响

我们检测了血管紧张素II对WT和ROCK1的血流动力学参数如血压和心率的影响+/−老鼠。在基线检查时，体重没有差异（27.8±0.4克对27.4±0.7克；P（P）>0.05），血压（117±2对120±2毫米汞柱；P（P）>0.05）和心率（502±2 vs.504±22 bpm；P（P）>0.05）在WT和ROCK1之间+/−小鼠（每组16只）。小鼠被随机分为两组：一组为盐水注入组（对照组），另一组为Ang II注入组。注入Ang II而非生理盐水导致WT和ROCK1的收缩压持续增加+/−老鼠(表1). WT和ROCK1之间Ang II诱导的收缩压无显著差异+/−老鼠。除注入Ang II的ROCK1外，所有组的体重均增加+/−与治疗前相比，输注后4周的小鼠。除盐水融合的WT小鼠外，Ang II输注后心率不变。这些结果表明，单倍体充足的ROCK1不影响Ang II诱导的收缩压增加。

表1

血流动力学和超声心动图评估：Ang II模型

重量
岩石1+/−
盐分（n=8）血管II（n=8）盐分（n=8）血管II（n=8）
体重，克
之前27.9±0.627.8±0.627.6±0.627.4±0.7
4周时30.8±0.6†29.6±0.6‡30.2±0.9‡27.6±0.8
收缩压（毫米汞柱）
之前118±3117±3121±2120±2
4周时117±3146±4*‡114±5138±4*‡
人力资源，bpm
之前503±28501±24535±27474±32*
4周时606±19†549±38533±31523±26
LVDd（毫米）1.87±0.083.03±0.093.21±0.123.11±0.16
LVD（毫米）1.87±0.081.77±0.051.91±0.081.83±0.08
FS，%41.2±2.041.6±1.040.4±0.942.0±1.1
EF，%77.3±1.678.7±1.077.5±1.077.0±2.6
IVS（毫米）0.71±0.020.91±0.02*0.72±0.010.89±0.03*
PW（毫米）0.73±0.020.94±0.02*0.74±0.020.90±0.02*
左心室质量，mg70±494±5*74±594±9*
HW/TL，mg/mm7.1±0.17.8±0.2*7.1±0.17.8±0.2*

BW表示体重；心率；PW，后壁；HW，心脏重量；TL，胫骨长度。

*P（P）<0.05 vs生理盐水；
†P（P）<0.05,
‡P（P）与之前相比<0.01。

ROCK1单倍体不足对血管紧张素Ⅱ诱导的心脏肥大的影响

超声心动图显示，4组之间的LVDd、LVDs、EF和%FS等心脏尺寸没有差异，表明ROCK1单倍体不足不会影响心脏结构或收缩性能(表1). Ang II输注的WT和ROCK1的壁厚和左心室质量增加的程度相似+/−小鼠与含盐小鼠的比较。含盐WT和ROCK1的心脏重量与胫骨长度之比没有差异+/−老鼠。通过在WT和ROCK1中输注Ang II，心脏重量与胫骨长度的比值增加到相似的程度+/−老鼠。这些结果与超声心动图测量结果一致。同样，在WT和ROCK1中注入Ang II后，由心肌细胞横截面积确定的心肌细胞大小增加+/−老鼠(图2A). 然而，WT和ROCK1之间没有差异+/−小鼠对Ang II的反应(P（P）>0.05). 通过在WT和ROCK1中输注Ang II，心脏中胎儿心脏基因的表达上调，如心脏肥大的既定标记ANF+/−老鼠。然而，WT和ROCK1之间的ANF表达没有差异+/−心脏(图2B). 总之，这些结果表明ROCK1不参与Ang II诱导的心肌肥大。

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血管紧张素Ⅱ对WT和ROCK1心肌肥厚的影响+/−老鼠。从接受盐水或Ang II治疗4周的小鼠中分离心脏。A、 显示心肌细胞横截面积的量化数据。B、 Northern blots显示ANF mRNA表达。ANF mRNA的表达水平通过GAPDH mRNA的表示水平进行标准化。每组（A组和B组）n=8。

ROCK1对L-NAME诱导的心脏肥大的影响

L-NAME治疗增加了WT和ROCK1的收缩压+/−老鼠。4周后，L-NAME诱导的收缩压在WT和ROCK1之间没有显著差异+/−老鼠(表2). 在WT和ROCK1中使用L-NAME治疗后，心脏重量与胫骨长度的比值增加到类似的程度+/−老鼠。ROCK1的单倍体充足性也不影响心脏尺寸和心肌肥大指数（即心脏重量与胫骨长度的比值）以及超声心动图评估的收缩性能，这表明ROCK1不参与L-NAME诱导的心肌肥大。

表2

血流动力学和超声心动图评估：L-NAME模型

重量
岩石1+/−
控制
（n=4）		L名称
（n=4）		控制
（n=4）		L名称
（n=4）
体重，克
之前28.1±1.727.9±1.127.8±2.427.6±1.5
4周时31.3±2.730.1±1.429.8±2.929.1±2.1
收缩压（毫米汞柱）
之前112±2115±3109±5112±4
4周时110±3147±4†‡106±5145±2†‡
人力资源，bpm
之前539±17518±18552±24539±26
4周时542±22541±31548±29563±26
LVDd（毫米）3.12±0.083.19±0.053.26±0.093.17±0.08
LVD（毫米）1.86±0.061.93±0.031.97±0.071.95±0.07
FS，%40.2±0.939.4±0.439.6±0.438.6±0.8
EF，%76.8±0.976.0±0.576.2±0.675.1±1.0
IVS（毫米）0.72±0.080.90±0.07*0.74±0.180.88±0.12*
PW（毫米）0.73±0.080.87±0.09*0.73±0.070.86±0.15*
左心室质量，mg69±395±3*76±391±4*
HW/TL，mg/mm7.1±0.37.7±0.3*7.0±0.37.7±0.2*

中的缩写表1.

*P（P）与对照组相比<0.05；
†P（P）与对照组相比<0.01；
‡P（P）与之前相比<0.01。

ROCK1单倍体缺失对心肌纤维化的影响

与此相反，WT和ROCK1的心肌肥厚无明显差异+/−在小鼠中，WT和ROCK1之间Ang II和L-NAME诱导的心脏纤维化增加存在显著差异+/−老鼠(图3A). 在WT中冠状动脉周围区域观察到明显的心肌纤维化，但ROCK1中未观察到心肌纤维化+/−老鼠。定量免疫组织化学分析表明，与ROCK1相比，静脉滴注Ang II和L-NAME治疗增加了WT患者心脏血管周围纤维化区域+/−老鼠(图3B). 同样，WT和ROCK1在TAC和缺血/MI诱导的血管周纤维化增加方面存在显著差异+/−老鼠(图4A和4B). 在两种心脏重塑动物模型中，ROCK1患者术后4周发生的血管周围纤维化明显减少+/−尽管WT和ROCK1的心肌壁厚度和心脏重量与胫骨长度之比发生了类似变化，但小鼠与WT小鼠相比+/−小鼠（数据未显示）。

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Ang II和L-NAME对WT和ROCK1心肌纤维化的影响+/−老鼠。心脏与WT和ROCK1分离+/−小鼠接受生理盐水或Ang II治疗4周，或接受或不接受L-NAME治疗4周。A、 用Masson三色染色法分析血管周围纤维化。显示了具有代表性的照片图像。B、 C，显示量化数据。每组n=8（B）和n=4（C）。

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WT和ROCK1患者的心脏纤维化+/−缺血/MI或TAC后的小鼠。心脏与WT和ROCK1分离+/−接受假手术、MI手术或TAC手术的小鼠。术后4周从小鼠体内分离心脏。A、 通过Masson三色染色分析血管周围纤维化。显示了具有代表性的照片图像。B、 显示量化数据。每组3至4人。

ROCK1单倍体缺失对Profibrotic基因表达的影响

确定ROCK1中的纤维化前基因表达是否发生改变+/−我们分析了CTGF在小鼠心脏的表达，CTGF是包括心脏在内的各种组织中纤维化的关键调节因子。14注入Ang II增加WT小鼠CTGF mRNA表达(图5A). 在ROCK1中，Ang II诱导的CTGF表达的增加显著减弱+/−老鼠。此外，Ang II增加了WT小鼠心脏纤维化的其他关键标志物，如TGFβ和III型胶原(图5B). 然而，在ROCK1中TGFβ和III型胶原表达的增加也明显较少+/−小鼠与WT小鼠进行比较。这些发现表明，在各种病理条件下，ROCK1在介导心脏纤维化中起着关键作用。

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肝纤维化前基因在WT和ROCK1中的表达+/−老鼠。从接受盐水或Ang II治疗4周的小鼠中分离心脏。A、 通过Northern印迹分析CTGF mRNA的表达。用GAPDH mRNA表达水平标准化CTGF mRNA的表达水平。每组n=8。B、 实时PCR分析TGFβ和III型胶原mRNA的表达。根据GAPDH mRNA的表达水平对数值进行标准化。每组n=4。

讨论

越来越多的证据表明，ROCK在各种心血管疾病的发病机制和发展中发挥着重要作用。然而，大多数证据是基于使用ROCK药物抑制剂如Y27632和法舒地尔的研究。9ROCK由2种亚型组成，即ROCK1和ROCK2，其激酶结构域具有92%的同源性。因为ROCK抑制剂以ROCK1和ROCK2的激酶域为靶点，所以它们在抑制这两种ROCK亚型方面具有相似的效力。因此，不可能通过使用ROCK抑制剂来确定ROCK的异构体特异性作用。此外，ROCK抑制剂如Y27632和fasudil可能不是完全选择性的，可能在相对较高的浓度下抑制其他蛋白激酶，如蛋白激酶C和A。

为了确定ROCK在心血管疾病中的异构体特异性作用，我们生成了ROCK1+/−并研究了ROCK1缺乏对血压和心脏重塑中Ang II变化的影响。为此，我们使用了ROCK1+/−因为杂合子没有显示发育或解剖异常。此外，我们的初步数据显示纯合ROCK1−/−在通过ROCK1交叉获得的同窝小鼠中，小鼠的代表性明显不足+/−小鼠（61只中的1只，1.6%）和通过杂交雄性ROCK1−/−与女性ROCK1+/−老鼠。最近的一项研究表明，通过将外显子3和4替换为lacZ公司报告基因导致了出生时眼睛睁开和脐腔的突变小鼠。13这些表型分别是由于眼睑上皮中肌动球蛋白索的紊乱和脐环中肌动蛋白细胞骨架组合的缺陷造成的。与我们的观察结果一致，他们还证明了ROCK1−/−在通过杂交ROCK1获得的同窝小鼠中，小鼠的代表性显著不足+/−小鼠（316只中12只，3.8%）。有趣的是，尽管ROCK1在心脏中的表达水平相对较高−/−小鼠心脏明显没有异常。

在本研究中，我们证明了小鼠ROCK1基因的单倍体不足导致了心肌纤维化的抑制，而不影响Ang II诱导的高血压和心肌肥厚。L-NAME治疗的小鼠也获得了类似的结果。ROCK1中L-NAME诱导的血管周围纤维化减少+/−尽管WT和ROCK1对L-NAME的高血压和心肌肥厚反应相同+/−老鼠。尽管先前的研究表明，对高血压大鼠施用ROCK抑制剂可以降低血压，15,16考虑到血管紧张素II诱导的收缩压升高在WT和ROCK1之间具有可比性+/−这些发现表明，ROCK1可能与Ang II诱导的血压升高无关。用ROCK抑制剂法舒地尔长期治疗不会影响Ang II诱导的动物高血压。10,12

ROCK抑制剂对ROCK活性的慢性抑制已被证明可以抑制Ang II诱导的大鼠心肌肥大和纤维化10和载脂蛋白E基因敲除小鼠。12其他研究表明，ROCK抑制剂抑制达尔盐敏感大鼠心脏的肥厚反应和纤维化变化。11与这些研究的结果相反，小鼠ROCK1基因的单倍体不足并不能阻止Ang II诱导的心肌肥大。因此，ROCK1在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大中可能没有显著作用。

本研究最引人注目的发现是单倍体ROCK1的心脏纤维化减少+/−各种病理条件下的小鼠。我们使用4种纤维化模型分析了心脏纤维化：Ang II输注、L-NAME治疗、MI和TAC。在所有这些模型中，ROCK1+/−与WT对照组相比，小鼠的纤维化程度降低。ROCK在纤维化中的关键作用不仅在心脏中得到证实10–12但也存在于其他组织中，包括肾脏。17体外研究表明，ROCK参与了血管紧张素Ⅱ诱导的纤维化。18在本研究中，我们发现心脏纤维化的减少与CTGF表达的减少相关。CTGF最初被认为是TGFβ的下游介质，与纤维化有关。CTGF在动物模型心脏和培养的心肌细胞中诱导，以应对各种刺激和损伤，包括Ang II输注。19,20ROCK1中TGFβ和III型胶原的表达降低+/−老鼠。这些结果表明，ROCK1可能是纤维化疾病的重要治疗靶点。

然而，ROCK1基因的单倍体不足并不能阻止Ang II、L-NAME或TAC引起的心肌肥大的发展。因此，我们的结果表明导致心肌纤维化的信号通路可能与心肌肥厚的信号通路不同。例如，具有p38α和p38β显性阴性形式的心脏特异性过表达的转基因小鼠发展为心脏肥大，而对压力超负荷的心脏纤维化没有改变。21此外，心肌特异性过表达激活型MKK3bE或MKK6bE（p38的直接上游激活物）的转基因小鼠会导致心肌纤维化和收缩舒张功能障碍，但不会导致心肌肥厚。22总之，这些研究表明，MKK-p38信号通路可能在心肌纤维化的发展中起重要作用，但在心肌肥厚中不起作用。虽然心肌细胞中ROCK1的抑制似乎在预防心肌纤维化中起着主要作用，但我们不能排除心脏成纤维细胞中ROCK1也可能介导这些作用的可能性。需要使用心肌细胞特异性ROCK1缺失进行进一步研究，以解决这些问题。

确认

这项工作得到了国家卫生研究所（HL-52233）和美国心脏协会（Bugher基金会奖）的资助。Y.Rikitake是AHA博士后研究金奖的获得者——东北附属机构。Y.Rikitake、N.Oyama和K.Noma是日本心脏基金会/拜耳雅库欣海外研究基金的接受者。

脚注

披露

廖博士曾担任旭化成制药的顾问。

工具书类

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