胆固醇负荷后小鼠主动脉平滑肌细胞向巨噬细胞样状态的转分化

摘要

巨噬细胞内胆固醇和胆固醇酯（CE）在动脉壁中积聚，导致“泡沫状”组织病理学外观，是动脉粥样硬化的特征(1). 泡沫细胞作为巨噬细胞的鉴定通常通过巨噬细胞标记物的阳性免疫染色进行组织化学证实。当单核细胞/巨噬细胞的募集和进入被靶向或天然基因突变破坏时(2-6)然而，在易患动脉粥样硬化的小鼠模型中，尽管减少了，但巨噬细胞特异性标记物阳性的泡沫细胞的持续存在是显著的。虽然这种细胞的存在可能是由于单核细胞/巨噬细胞募集或滞留因子的冗余，但也有可能一些泡沫细胞起源于其他类型的细胞，特别是平滑肌细胞（SMC）。

为了支持这一概念，研究（例如，参考文献。7)研究表明，一些病变泡沫细胞具有SMC的形态学特征，尽管这些特征通常出现在晚期病变中。因为组织培养中保存的SMC可以诱导累积CE(8-10)，我们进行了在体外在分子水平上评估SMC胆固醇和CE含量增加时的早期表型变化。为了实现这一目标，将小鼠SMC中的游离胆固醇（FC）与甲基-β-环糊精络合，后者是水溶性环状多糖，可以提高疏水性化合物（如胆固醇）的溶解度(11). 在48到72小时内，随着CE的积累，细胞呈现出泡沫细胞的典型外观。引人注目的是，在蛋白质和mRNA水平上，这种相对快速的表型变化分别与SMC和巨噬细胞相关基因的表达下降和增加有关。此外，通过吞噬活性评估，蛋白质和基因表达的变化与巨噬细胞样功能特性的获得有关。这些结果表明SMC的表型体内可能是类似的“可塑性”，即使在早期病变中，含有胆固醇的SMC来源细胞也可能构成新生内膜巨噬细胞标记阳性泡沫细胞的重要亚群。

材料和方法

细胞培养。小鼠主动脉平滑肌细胞取自8周龄C57BL/6小鼠的胸主动脉（杰克逊实验室）。用II型胶原酶消化主动脉段后去除外膜和内皮（沃辛顿；175单位/ml）。用含有II型胶原酶（175单位/ml）和弹性蛋白酶（Sigma；0.5 mg/ml）的混合物进一步消化培养基，每个主动脉产生约100000个细胞。细胞在含有10%FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中生长，并在37°C和5%CO下孵育₂/95%空气。99%以上的细胞出现α-肌动蛋白（Sigma）免疫反应，证实了SMC谱系。以下所有涉及SMC的实验均使用传代数≤5的细胞进行。小鼠细胞系Lewis肺癌（LLC；最初来自C57BL/6小鼠）和NIH/3T3成纤维细胞由a.Hidalgo（纽约西奈山医学院）提供，并保持在与SMC相同的培养条件下。

细胞代谢活性测定。细胞代谢活性是细胞毒性的标准指数，测定如下(12). 用5、10和20μg/ml胆固醇：甲基-β-环糊精复合物（Chol:MβCD；见下文）在0.2%BSA中处理次级流出物（90-95%合流）SMC 72小时。然后添加CellTiter 96水溶液试剂（Promega）并与细胞孵育1小时。该试剂由代谢活性细胞转化为可在490 nm处测量的有色甲赞产品。细胞毒性与相对代谢活性（即formazan生成）呈负相关。

胆固醇负荷。通过使用从Sigma购买的Chol:MβCD复合物，将胆固醇作为“水溶性胆固醇”（目录号C4951）输送至细胞，其中胆固醇约为50 mg/g固体（摩尔比为1:6胆固醇/MβCD）。所有涉及Chol:MβCD的治疗浓度均基于胆固醇重量。

将次级流入的SMC与0.2%BSA中的Chol:MβCD（10μg/ml）孵育72小时。次级流入LLC细胞和NIH/3T3成纤维细胞与低浓度的Chol:MβCD孵育（5μg/ml），因为它们更容易受到胆固醇负荷的毒性。细胞与0.2%BSA孵育72小时，无Chol:MβCD处理，作为所有实验的对照。为了确定基因表达的变化是否受到FC或EC的细胞含量的调节，在一些实验中，用酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（ACAT）抑制剂预培养细胞过夜(13，14)F-1394（1μM），然后在F-1394存在下与Chol:MβCD孵育。在一些实验中，为了测试肿瘤坏死因子α（TNF-α）对刺激单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）和血管细胞粘附分子1（VCAM-1）表达的影响，对照细胞或胆固醇负荷细胞用30 ng/ml的TNF-胆固醇负荷后。

细胞胆固醇和蛋白质测定。使用己烷/异丙醇（3:2）混合物提取细胞脂质，然后使用0.2 N NaOH提取细胞蛋白(15). 使用罗氏应用科学公司的试剂盒测定总胆固醇和FC。通过从总胆固醇中减去FC来测定CE含量。使用Sigma试剂盒根据Lowry分析测定细胞蛋白质含量。

组织和免疫组织化学。治疗后，将Lab-Tek室载玻片（Nalge Nunc）中的小鼠SMC固定在PBS中4%的多聚甲醛中，并用油红O（中性脂质）、CD68（巨噬细胞标记物）或平滑肌α-肌动蛋白染色，如前所述(16). 此外，还使用针对SMC标记物α-原肌球蛋白（Sigma；稀释度，1:500000）或巨噬细胞标记物Mac-2（加拿大安大略省雪松兰；稀释度：1:1000）的单克隆抗体进行免疫染色。

在本报告中，通过光学显微镜观察，油红O染色液滴明显增多的细胞被视为泡沫细胞。

定量实时RT-PCR（QRT-PCR）。通过使用来自Qiagen（Valencia，CA）的试剂盒提取总RNA。如前所述，通过QRT-PCR测定特定基因的mRNA水平(17)使用10 ng总RNA。3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA）还原酶的引物和探针序列（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“M62766”，“term_id”：“193881”，“term_text”：“M6 2766”}}M62766型)，Mac-2({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X16934”，“term_id”：“32029”，“term_text”：“X16934”}}X16934型)，平滑肌肌球蛋白重链(｛“type”：“entrez核苷酸”，“attrs”：｛“text”：“NM_013607”，“term_id”：“2211362151”，“term_text”：“NM_013607”｝NM_013607号)，钙调素H1({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“Z19542”，“term_id”：“51137”，”term_text“：”Z19542“}}Z19542年)和α-原肌球蛋白({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_024427”，“term_id”：“146149131”，”term_text“：”NM_024428“}}NM_024427)在中列出表1以及CD68、ATP-结合盒转运体1（ABCA1）、α-肌动蛋白、MCP-1、VCAM-1和亲环素A（所有标记基因的负载控制）的基因与所述相同(17，18). 通过使用从肝脏分离的小鼠总RNA（HMG-CoA还原酶）、诱导的腹腔巨噬细胞（CD68、Mac-2和ABCA1）、病变丰富的主动脉弓（MCP-1和VCAM-1）或正常主动脉（α-肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、α-原肌球蛋白和钙粘蛋白H1）的系列稀释液构建QRT-PCR标准曲线（针对每个mRNA物种）所有数据均归一化为亲环素A含量，并表示为对照组的折叠变化。

SMC对乳胶粒的吞噬作用。在0.2%BSA中预先孵育或不孵育Chol:MβCD（10μg/ml，72 h）的小鼠主动脉平滑肌细胞（镀在玻璃盖玻片上）与1-μM氟硅石YG微球乳胶珠（Polysciences；4.55×10⁶然后在PBS中广泛清洗带细胞的盖玻片，用PBS中2%的多聚甲醛固定，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（用于细胞核）和1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁（用于膜）根据制造商的说明进行反染，并用VectorShield安装介质（Vector Laboratories）安装在载玻片上。采用荧光显微镜对乳胶珠、4′，6-二氨基-2-苯基吲哚和1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁进行不同激发波长的数字图像采集。为了定量测定SMC对乳胶粒的吸收，在每个实验条件下，在五个随机选择的区域中计算乳胶粒和细胞核的数量。吞噬活性表示为珠子数量除以场中的细胞核数量。

统计。在实验中，对每种条件或处理使用重复或重复的孔。数据表示为平均值±SEM。所有实验至少重复一次。两个样本学生使用PRISM软件（圣地亚哥GraphPad）分析样本之间的差异t吨测试或，用于图7使用Bonferroni后验对选定样本对之间的差异进行单向方差分析。P（P）<0.05的值被认为是显著的。

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图7。

FC对SMC和巨噬细胞相关基因表达的影响。使用或不使用ACAT抑制剂F-1394（1μM）对亚流入小鼠SMC进行过夜预处理，然后使用（Chol，Chol+ACAT抑制剂）或不使用（对照，ACAT抑制剂单独使用）Chol:MβCD（10μg/ml）在0.2%BSA中加入F-1394进行处理（72小时）。提取总RNA并进行QRT-PCR分析。所有数据均为独立副本的平均值±SEM。^*，未检测到α-actin。†，P（P）<0.01 vs.胆汁。

结果

细胞毒性。胆固醇：MβCD快速直接将胆固醇输送到质膜(11)血浆或内质网膜中过多的FC可能导致细胞毒性和细胞死亡(19，20). 为了确定最大亚毒性剂量，用增加浓度的Chol:MβCD处理小鼠主动脉平滑肌细胞72小时，如图1在高达10μg/ml的浓度下，Chol:MβCD对SMC代谢活性和细胞蛋白含量没有影响或几乎没有影响。因此，在以下SMC胆固醇负荷实验中使用10μg/ml。

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图1。

Chol的细胞毒性：MβCD。用0.2%BSA中增加浓度的Chol:MβCD处理次级流入的小鼠SMC 72小时。然后用CellTiter 96水溶液试剂培养细胞1小时，该试剂可被代谢活性细胞转化为有色的formazan产品。(一个)相对代谢活性通过分光光度法测定（OD=490 nm）培养基中formazan产物的积累。(B类)使用Sigma试剂盒测定总细胞蛋白。请参见材料和方法了解详细信息。数据为三口井的平均值±SEM，并至少重复一次。

Chol:MβCD治疗SMC诱导的胆固醇和CE积累。在与Chol:MβCD孵育72小时后，SMC呈现泡沫细胞的外观，大多数细胞的胞质溶胶中都存在油红O染色的脂滴(图2一个和插入); 相反，在与BSA孵育的对照细胞中未发现脂滴。生化测量与染色结果一致：与对照SMC相比，胆固醇负荷导致总胆固醇水平增加约2倍（32.7±1.5 vs.56.1±0.9μg/mg细胞蛋白，P（P）< 0.00005;图2B类)CE增加约10倍（1.3±0.2 vs.12.6±3.5μg/mg细胞蛋白，P（P）<0.02). HMG-CoA还原酶mRNA下调至控制水平的≈30%，表明这种固醇积累程度是一种显著的代谢扰动(图2C类).

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图2。

胆固醇负荷导致平滑肌泡沫细胞的形成。在0.2%牛血清白蛋白（BSA）中用（Chol）或不用（对照）Chol:MβCD（10μg/ml）处理亚流入小鼠SMC（72 h）。将细胞固定在10%中性缓冲甲醛中，并用油红O染色（放大倍数：一个, ×100;插入，×400）或收获以测定细胞胆固醇(B类)或提取RNA用于QRT-PCR测定HMG-CoA还原酶mRNA水平(C类). 数值数据为独立副本的平均值±SEM。

胆固醇负荷对SMCs和巨噬细胞相关蛋白表达的影响。为了表征在72小时治疗期结束时与SMC泡沫细胞形成相关的表型变化，用针对通常被视为平滑肌或巨噬细胞表型特征的蛋白质的特异性抗体对胆固醇负荷的SMC和对照SMC进行免疫染色。如所示图3正如预期的那样，对照组SMC被α-肌动蛋白和α-原肌球蛋白抗体严重染色。值得注意的是，胆固醇负荷后，两者的染色都减少了。相反，只有少数对照细胞被识别巨噬细胞相关蛋白（CD68和Mac-2）的抗体阳性染色，但在胆固醇负荷后，阳性染色细胞的数量和染色强度显著增加。

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图3。

SMC和巨噬细胞相关蛋白的免疫染色。在0.2%牛血清白蛋白（BSA）中用（Chol）或不用（对照）Chol:MβCD（10μg/ml）处理亚流入小鼠SMC（72 h）。细胞用α-肌动蛋白抗体（红色染色，×200）、α-原肌球蛋白抗体（棕色染色，×20 0）、CD68抗体（棕色着色，×2 0 0）和Mac-2抗体（褐色染色，×2 00）染色。

胆固醇负荷对SMCs和巨噬细胞相关mRNA物种丰度的影响。为了进一步研究与胆固醇负荷相关的表型变化，我们测定了几种SMC的mRNA物种丰度(21)巨噬细胞相关蛋白，包括免疫组化检测的蛋白。如所示图4一个与免疫染色一致(图3)SMC泡沫细胞显著降低了α-actin的mRNA水平（对照组的11.5±0.5%，P（P）<0.005），α-原肌球蛋白（29.3±1.4%，P（P）<0.0005），平滑肌肌球蛋白重链（23.8±1.4%，P（P）<0.01）和钙调素H1（3.8±0.5%，P（P）< 0.05).

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图4。

QRT-PCR检测SMC和SMC中巨噬细胞相关基因的表达。在0.2%牛血清白蛋白（BSA）中用（Chol）或不用（对照）Chol:MβCD（10μg/ml）处理亚流入小鼠SMC（72 h）。在C类在胆固醇负荷后，用30 ng/ml TNF-α处理对照细胞或胆固醇负荷细胞2 h。提取总RNA并对平滑肌标记基因进行QRT-PCR分析(一个)，巨噬细胞标记基因(B类)和巨噬细胞相关炎症基因(C类). 所有数据均为独立副本的平均值±SEM。

在BSA处理的对照细胞中，CD68 mRNA水平较低（≈病变巨噬细胞中水平的5%；J.X.R.和E.A.F.，未发表的观察结果），与保存在10%FBS/DMEM中的细胞中的水平相似（数据未显示），与免疫染色数据一致。胆固醇负荷时，细胞CD68 mRNA水平增加（达到对照组的709±84%，P（P）< 0.03). 同样，另一种巨噬细胞标记物Mac-2的表达增加到对照组的330±11%(P（P）< 0.003) (图4B类). 因此，mRNA丰度的这些变化与免疫染色结果一致，免疫染色结果显示SMCs和巨噬细胞相关蛋白信号分别明显减少和增加。

外周细胞胆固醇流出到高密度脂蛋白的关键调节因子ABCA1的mRNA(22)主要与巨噬细胞相关体内(23)，增加到207±13%(P（P）<0.03）在胆固醇负荷的SMC中(图4B类). 由于巨噬细胞泡沫细胞的形成被认为会启动或促进炎症状态，我们还分析了两个动脉粥样硬化相关基因MCP-1和VCAM-1的mRNA水平，这两个基因对炎症刺激有强烈反应，并且在SMC和巨噬细胞中都有表达。令人惊讶的是，尽管MCP-1和VCAM-1基因对TNF-α治疗有反应，但在对照细胞和胆固醇负荷细胞之间没有发现差异(图4C类).

胆固醇负荷对SMC吞噬活性的影响。为了研究胆固醇负荷的SMC是否获得巨噬细胞的功能，将胆固醇负荷或不负荷的SMCs与1μm乳胶珠孵育，作为通常用于研究白细胞吞噬活性的方案的一部分(24). 如所示图5对照组SMC的吞噬活性很低（每细胞0.6±0.2粒）。然而，胆固醇负荷后，乳胶珠的积累增加（每个细胞3.4±0.3珠，P（P）<0.02（与对照组相比）。这一发现表明，除了胆固醇负荷的SMC中巨噬细胞相关基因和蛋白表达增加外，还存在获得巨噬细胞功能特性的证据。

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图5。

胆固醇负荷增加SMC的吞噬活性。(一个)用（Chol）或不使用（对照）Chol:MβCD（10μg/ml）在0.2%BSA中处理亚流入小鼠SMC（72 h），然后用1-μM乳胶珠（绿色）培养20 h。然后广泛清洗细胞，固定，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色，用于细胞核）和1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁（红色，代表细胞膜），并进行荧光显微镜检查。（放大倍数，×200。）(B类)计算细胞数和乳胶珠数，以获得吞噬活性的数值数据。所有数据均为独立副本的平均值±SEM。

胆固醇负荷对LLC细胞和NIH的影响/3T3成纤维细胞。为了确定在胆固醇负荷下获得巨噬细胞样特征是否是一种独立于细胞类型的普遍现象，我们研究了LLC细胞，该细胞最初是从C57BL/6小鼠的肺中建立的，小鼠的主要LLC被植入其中(25)和NIH/3T3小鼠成纤维细胞。如所示图6在LLC细胞和NIH/3T3成纤维细胞中检测到α-原肌球蛋白、CD68和Mac-2 mRNA，但在两种细胞系中均未检测到α-actin。对于LLC细胞，α-原肌球蛋白略有下降（至对照组的75.8±2.7%，P（P）<0.05）。然而，CD68和Mac-2 mRNA的丰度没有改变，与SMC对照细胞中的水平相似（数据未显示）。对于NIH/3T3成纤维细胞，对照组和胆固醇负荷细胞之间的α-原肌球蛋白、CD68或Mac-2 mRNA没有明显差异（通过胆固醇测量证实；数据未显示）。因此，在胆固醇负荷的SMC中观察到巨噬细胞相关基因表达的大幅增加似乎不是一种非特异性或一般的细胞反应。

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图6。

胆固醇负荷对LLC细胞SMC和巨噬细胞相关基因表达的影响(一个)和NIH/3T3成纤维细胞(B类). 在0.2%BSA中用（Chol）或不用（对照）Chol:MβCD（5μg/ml）处理亚流入小鼠LLC细胞或NIH/3T3成纤维细胞（72小时）。提取总RNA并进行QRT-PCR分析。所有数据均为独立副本的平均值±SEM。^*，未检测到α-actin。

细胞FC增加对SMC和巨噬细胞相关mRNA物种丰度的影响。约50%由Chol:MβCD交付给SMC的FC转化为CE(图2). 在最近的一项合作研究中(20)，我们发现FC和CE对与内质网应激反应和细胞凋亡相关的基因表达的不同影响。为了确定FC和CE对与胆固醇负荷相关的SMC基因表达的变化是否也有不同的影响，我们在ACAT抑制剂Fujirebio化合物F-1394的存在下用Chol:MβCD（10μg/ml）处理细胞(13)]. 与单独用Chol:MβCD处理的细胞相比，在F-1394（1μM）的最高亚毒性浓度下，SMCs的CE含量减少了50%，而细胞总胆固醇含量没有减少。如所示图7，FC含量的优先增加倾向于分别进一步降低或显著增加与胆固醇负荷相关的SMC或巨噬细胞相关基因表达，尽管增强程度因基因而异（即α-actin或CD68的增强程度分别大于α-原肌球蛋白或Mac-2的增强程度）。

讨论

巨噬细胞泡沫细胞是动脉粥样硬化形成的核心（参见参考文献。19用于最近的审查）。一般来说，假设泡沫细胞主要来源于循环中的单核细胞，这些单核细胞被招募到血管壁中。而脂溶性、SMC衍生的泡沫细胞已被证明在体外(8，10)以及动脉粥样硬化斑块（例如，参考文献。7)通常认为这些细胞发生在病变发展的相对较晚阶段。此外，它们保留了足够的表型特征，可以通过光识别(26)或电子显微镜(7)作为SMC的起源。

尽管SMC以前被诱导积累胆固醇在体外(8-10)，对于任何一种在体外或体内SMC泡沫细胞，关于蛋白质或RNA水平的表型变化的信息很少。本研究结果表明，胆固醇负荷在体外SMC迅速呈现泡沫细胞外观，并失去SMC表型的普遍接受标记的表达。同时，巨噬细胞相关基因和蛋白质的表达增加，巨噬细胞功能获得增加（通过吞噬活性评估）。值得注意的是，巨噬细胞特性的增加并不是胆固醇负荷的一般结果，小鼠LLC细胞系和NIH/3T3成纤维细胞的结果证明了这一点。因此，我们的研究结果引发了一种挑衅性的可能性，即除了先前发现的具有SMC外观的泡沫细胞外，还存在传统上被归类为巨噬细胞的泡沫细胞亚群，这些细胞实际上是由胆固醇积聚诱导的动脉SMC，从而显著改变其表型。

众所周知，SMCs分化、收缩表型的改变在动脉粥样硬化病变的形成中起着不可或缺的作用(27). 本研究中检测到的四种平滑肌标志物均与平滑肌细胞收缩有关；α-肌动蛋白和肌球蛋白重链是平滑肌收缩机制的重要组成部分(21). Calponin H1是一种肌动蛋白相关的平滑肌特异性蛋白，是潜在的收缩调节剂(28). α-原肌球蛋白被认为在调节收缩过程中起重要作用(29). 在动脉粥样硬化形成的早期阶段，也观察到这些基因的下调，与SMC增殖和迁移到新生内膜有关。如前所述，我们研究了传代数≤5的SMC，这避免了他们假设为增殖表型(30)因此，我们观察到的基因表达下调不太可能是增殖增加的结果。因为所研究的细胞传代数较低，在实验过程中增殖被进一步降低（如细胞代谢活性和蛋白质含量的恒定性所反映的；图1)通过在无血清培养基中培养，SMC相关基因的下调或巨噬细胞相关基因的上调也不太可能是培养物被快速分裂的异常SMC亚群所取代的结果，这些异常SMC在胆固醇负荷前具有类似巨噬细胞的特性。

SMC泡沫细胞中的下调（图。​（图3三和​和4一个),4一个)因此，胆固醇可能导致SMC改变为与致动脉粥样硬化特征相关的状态(27). 与这一观点相一致的是，有报道称，酶降解的非氧化低密度脂蛋白诱导人类血管平滑肌细胞活化和泡沫细胞转化，作者将这些数据解释为去分化过程的证据(10). 根据巨噬细胞相关蛋白的目前结果（见下文），胆固醇负荷可能更适合作为转分化程序的一部分，而不是代表去分化过程。

SMCs转化为巨噬细胞样细胞也可能与小鼠动脉粥样硬化文献中的其他两个观察结果相吻合。首先，在单核细胞募集相关基因缺失或受损的小鼠动脉粥样硬化病变中发现大量巨噬细胞标记阳性泡沫细胞(2，三)、白细胞粘附(4，5)，以及巨噬细胞的增殖和分化(6). 尽管这一发现无疑在一定程度上反映了单核细胞和巨噬细胞相关因子的生物冗余性，但某些持续存在的“巨噬细胞”曾经是SMC，这一点无疑是合理的。第二个观察来自我们之前的研究(16)其中apoE中HDL水平的急性持续升高^-/-小鼠（血浆HDL天然较低）重塑晚期斑块，纤维帽厚度显著增加（通过α-actin染色评估）。如果我们所描述的变化在胆固醇流出方面是可逆的，那么升高的HDL可能会将SMC表型恢复为最初从中间层迁移到内皮下的细胞，并在胆固醇负荷后呈现巨噬细胞样特征。

令人惊讶的是，尽管胆固醇负荷的SMCs具有巨噬细胞（通常被认为是炎症细胞）的特征，但似乎没有被显著激活，至少按照MCP-1或VCAM-1的诱导标准是这样的(图4C类)，其基因受NF-κB高度调节的致动脉粥样硬化分子。这一发现的一个可能的解释是，胆固醇负荷不知何故使细胞对炎症刺激通常无反应。然而，根据TNF-α治疗后MCP-1和VCAM-1 mRNA中对照组和负载SMC的可比增加，这种可能性不大可能。对这些结果的另一个可能的解释是胆固醇的积累就其本身而言不是炎症刺激，也不是炎症刺激。但炎症分子的诱导发生在稍后的时间。对前一种可能性的支持来自上述编辑的研究(10)其中SMCs的激活是通过以修饰的LDL（含有炎症因子）的形式传递胆固醇来实现的(31，32)]以及Lawn和同事的研究(33)研究表明，巨噬细胞系负载氧化低密度脂蛋白导致炎症基因表达增加，这些基因对脂多糖刺激的反应性更强(34).

通过使用环糊精传递胆固醇，我们已经能够将胆固醇本身的作用与修饰脂蛋白的其他成分分离开来，正如上述报告所表明的，根据目前的结果，修饰脂蛋白可能发挥独立于胆固醇积聚或可能与胆固醇积聚协同作用的作用。环糊精可有效地将胆固醇传递给多种细胞类型，如成纤维细胞、巨噬细胞和肝癌细胞（例如，参见Rothblat及其同事的报告，如参考文献。11). 值得注意的是，在本研究中，通过使用相对低浓度的环糊精-胆固醇复合物[≈<1:20，可在不引起细胞毒性的情况下形成SMC泡沫细胞(11)]. 同样，与使用修饰和氧化低密度脂蛋白的研究相比，我们的研究中缺乏炎症激活，这也可能反映出这种低水平的细胞毒性，因为氧化低密度蛋白已知对细胞活力有不利影响。

胆固醇负荷导致SMC转化为巨噬细胞样细胞的机制是什么？虽然我们采用的“候选因子”方法无法检测到所有诱导的变化，但我们知道至少有一些是在mRNA水平上，这使得转录调控可能是胆固醇负荷反应的关键组成部分。此外，当胆固醇酯化被抑制时，作用的增强表明存在FC-敏感途径。鉴于此，在一项合作研究中，我们最近报道了FC对巨噬细胞内质网应激途径相关基因表达的优先影响(20)，这些结果和目前的发现可能是相关的。

细胞胆固醇含量强烈调节的两种转录因子是固醇反应元件结合蛋白（SREBP）和肝脏X受体（LXR）。根据我们对HMG-CoA还原酶的研究结果，前者不太可能成为SMC转分化调控因子(图2C类)这表明SREBP通路在我们的实验条件下下调。另一方面，LXR由于其天然配体而受到牵连，包括FC氧化产生的氧甾醇，FC氧化发生在大多数（如果不是所有的话）积聚胆固醇的细胞中。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是另一个候选因子。先前的研究表明，PPARγ调节原代平滑肌培养中巨噬细胞样表型的增加(35)巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取(36)或内皮细胞中胆固醇（由白蛋白-胆固醇复合物提供）(37)导致PPARγ活化。然而，目前我们只能推测这些或其他因素是否与我们描述的表型变化有关。未来需要更多候选因子和最终的DNA微阵列的实验，以确定胆固醇负荷改变的转录途径，这是SMC假设巨噬细胞样状态的原因。

总之，我们已经在蛋白质和分子水平上描述了与小鼠主动脉平滑肌细胞泡沫形成相关的表型变化。这些细胞变成巨噬细胞样，但没有激活已知在炎症状态下被诱导的基因。结果表明，根据免疫染色，先前假定的病变泡沫细胞来源于巨噬细胞，可能起源于SMC人群。进一步阐明胆固醇积累改变SMC的途径不仅将阐明发育生物学的一个有趣领域，而且也可能增加我们对斑块形成和重塑的基本知识。

致谢

笔记

缩写：CE，胆固醇酯；胆固醇：MβCD，胆固醇：甲基-β-环糊精；FC，游离胆固醇；LLC，Lewis肺癌；QRT-PCR，定量实时RT-PCR；平滑肌细胞；ACAT，酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶；HMG-CoA，3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA；肿瘤坏死因子α；MCP-1，单核细胞趋化蛋白1；VCAM-1，血管细胞粘附分子1。

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