脂质研究杂志。2009年2月；50(2): 204–213.
富含甘油三酯的脂蛋白脂解释放中性和氧化FFA，诱导内皮细胞炎症*
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王利民（Limin Wang）
*加州大学戴维斯分校内分泌、临床营养和血管医学系
拉詹·吉尔
†加州大学戴维斯分校营养系内科
§加利福尼亚州戴维斯加州大学昆虫学系
特蕾莎·佩德森
**美国农业部，农业研究服务部，西部人类营养研究中心，加利福尼亚州戴维斯
劳拉·希金斯
*加州大学戴维斯分校内分泌、临床营养和血管医学部
约翰·纽曼
†加州大学戴维斯分校营养系内科
**美国农业部，农业研究服务部，西部人类营养研究中心，加利福尼亚州戴维斯
约翰·拉特利奇
*加州大学戴维斯分校内分泌、临床营养和血管医学部
*加州大学戴维斯分校内分泌、临床营养和血管医学部
†加州大学戴维斯分校营养系内科
§加利福尼亚州戴维斯加州大学昆虫学系
**美国农业部，农业研究服务部，西部人类营养研究中心，加利福尼亚州戴维斯
收稿日期：2007年11月5日；2008年8月21日修订；2008年9月17日修订
摘要
富含甘油三酯的脂蛋白（TGRL）脂解产物提供一种能改变内皮屏障功能的促炎症刺激。为了探讨这种脂解诱导事件的机制，我们通过脂蛋白脂肪酶（LpL）评估了人餐后TGRL衍生的脂质类的促炎症潜能。TGRL与LpL孵育30分钟后，孵育液的饱和和不饱和FFA含量显著增加。此外，通过LpL脂解，羟基亚油酸9-羟基癸二烯酸（9-HODE）和13-HODE的浓度升高，高于其他测得的氧化脂质。FFA组分引发促炎反应，诱导人主动脉内皮细胞（HAEC）中TNFα和细胞内粘附分子的表达以及活性氧（ROS）的产生。细胞色素P450 2C9抑制剂磺胺酚唑和NADPH氧化酶抑制剂均阻断了FFA介导的活性氧增加。与亚油酸盐相比，13-HODE被发现是HAEC中ROS生成的更有效诱导剂，该活性对NADPH氧化酶和细胞色素P450抑制剂都不敏感。因此，虽然FFA在内皮细胞中的氧化代谢可以产生炎症反应，但TGRL脂解也可以释放预先形成的氧化应激介质（例如HODEs），这些介质可能通过刺激细胞内ROS的产生而影响体内内皮细胞的功能。
关键词：内皮功能障碍、脂肪酸、氧化脂质
富含甘油三酯的脂蛋白（TGRLs）可能具有重要的促发热和促炎症特性。循环TGRL，包括乳糜微粒（CMs）、VLDLs及其残余颗粒，构成了一个含有高甘油三酯载脂蛋白B（apoB）的脂蛋白的异质家族。餐后TGRL升高与内皮细胞炎症增加和动脉粥样硬化并发症有关(1)是冠心病的独立预测因子(2–4).
血浆甘油三酯浓度增加与体外内皮细胞功能受损相关(5)和体内(5,6). 例如，靠近内皮的TGRL脂解增加会增加内皮层通透性(7)并导致内皮细胞处于促炎状态，表现为TNFα分泌增加、粘附分子表达增加和氧化应激诱导(8). 在体内，TGRL被脂蛋白脂肪酶（LpL）水解，LpL是一种固定在内皮细胞上的酶，将游离脂肪酸释放到紧邻内皮细胞的血液中。因此，内皮细胞经常暴露于高浓度的FFA中，这种化合物可能在内皮功能和功能障碍中发挥重要作用(9–11). 例如，亚油酸（LA）增加培养的人主动脉内皮细胞（HAEC）的通透性(12–14)而内皮型一氧化氮合酶活性降低是由棕榈酸和油酸盐产生的，而不是亚油酸盐(15). 这些结果表明，在高甘油三酯血症中，FA的升高可能导致内皮功能障碍，并强调各种FA可能对内皮产生不同的影响。然而，这些研究主要考察了单个纯化FFA诱导内皮细胞损伤的能力，这可能无法充分反映体内状态的复杂性。值得注意的是，LpL释放的化学池的成分没有常规特征，很可能受到健康和营养状况的影响。
我们小组先前的研究表明，TGRL脂解产物会导致内皮细胞功能障碍，内皮层通透性增加(7,8,16,17). 内皮细胞TGRL依赖性促炎性改变的机制尚不清楚。我们最近的研究结果表明，脂筏形态和组成的改变可能调节内皮活性氧（ROS）的产生，并有助于TGRL脂解介导的内皮细胞损伤(18). 我们还发现，与LpL孵育30分钟后，TGRL培养基中的FFA浓度增加了10倍，而甘油三酯、胆固醇酯和磷脂浓度保持不变(18). 尽管高甘油三酯血症中的内皮功能障碍部分是由脂肪分解产物引起的，FFA是疑似的罪魁祸首，但胆固醇酯以及单、二酰基甘油酯的变化也可能是这些影响的来源。通过评估TGRL脂解产物的化学类别改变内皮功能的能力，我们可以重点关注能够引起炎症反应的TGRL脂解脂质成分。在这里，我们报告了导致脂肪分解后炎症状态升高的特定化学类别，并使用药理学工具显示了LA及其氧化产物13-羟基八碳二烯酸（13-HODE）之间不同的炎症信号模式。
材料和方法
脂蛋白的分离和表征
健康志愿者在食用标准的中高脂肪膳食（40%的热量来自脂肪）3.5小时后，采集餐后血样。这个时间点与血浆甘油三酯浓度的峰值升高相一致。所有程序都是根据加州大学戴维斯分校人类受试者审查委员会批准的方案进行的。所有受试者在参与前均获得书面知情同意。在EDTA-Na管中抽取血液，分离并汇集四名志愿者的血浆。在Beckman L-90K型超速离心机内，将SW41 Ti摆动桶转子（加利福尼亚州桑尼维尔市Beckman Coulter）置于14°C的温度下，以40000 rpm的转速离心18 h后，用窄孔移液管从d<1.0063 g/ml的人血浆中分离出TGRL。收集顶部部分TGRL（即CM、VLDL及其残余颗粒），并在4°C的Spectra/Por®膜管（分子量截止值3500；Spectrum Medical Industries，Los Angeles，CA）中在含有0.01%EDTA的盐水溶液中通宵彻底透析。必要时，TGRL在Beckman L-90K L8-70M超离心机内保持14°C的SW41 Ti摆动斗式转子（Beckman）中以25000 rpm的转速旋转，从而分为CM和VLDL(19). TGRL的纯度由SDS-PAGE分析、考马斯染色和脂质分析证实。SDS电泳显示，CM中只存在apoB-48，VLDL中只存在apoB-100。酶法测定血浆甘油三酯（TG）和胆固醇水平（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。
LpL培养
为了评估TGRL脂解对培养的HAEC的影响，分离的餐后TGRL、CM或VLDL【所有处理均为2.5 mg TG】用2 U/ml牛LpL（Sigma-Aldrich）进行酶促脂解。将稀释的脂蛋白部分与LpL在37°C下预孵育30分钟，并将试管置于湿冰上停止反应。组分要么立即用于培养细胞的培养，要么在-80°C下冷冻保存，直到进行脂质分析。
为了验证LpL培养释放酯化脂肪酸（EFA）作为NEFAs的效率，使用了从混合志愿者血浆（n=4）中分离的VLDLs。制备含有20μg甘油三酯的亚液，并加入0.17 mg/ml丁基羟基甲苯（BHT）。使用乙醚重氮甲烷的直接萃取甲基化对NEFA浓度进行定量(20)和十五烯酸（Nucheck Prep，Elysian，MN）作为分析替代品。在甲醇氢氧化钾中连续酯交换和甲醇HCl中甲基化后，使用三庚烷酸（Nucheck Prep）作为分析替代物，测定等量VLDL小份的总EFA+NEFA含量(21). 脂肪酸甲酯（FAME）在安捷伦6890气相色谱仪上进行分析，该气相色谱仪配有30 m×0.25 mm×0.2μm薄膜DB225ms色谱柱（安捷伦，加州圣克拉拉）和安捷伦5973N质谱检测器。样品通过电子冲击电离，数据通过同时选择的离子监测/全扫描模式获得。使用安捷伦化学站软件对SIM数据进行数据分析和量化。根据真实的FAME标准（Nucheck Prep）制备的七点校准曲线包含所有残留物。使用全扫描质谱来确认FA的身份。
总脂质提取
为了制备用于细胞培养的脂质分离物，使用60 mg Oasis HLB固相萃取筒（Waters，Milford，MA）从TGRL中提取脂质，包括LpL预处理和未预处理。用甲醇对柱进行预清洗，并用0.1%乙酸在5%甲醇中进行调节。将等分样品与0.17 mg/ml BHT混合在色谱柱储液罐中，并通过重力将其加载到色谱柱填料上。用调节溶液清洗加载柱，干燥，并用0.5 ml甲醇和1.5 ml乙酸乙酯洗脱。使用Genevac EZ-2蒸发系统干燥有机提取物（英国Generavac公司），并在100μl氯仿中重新配制残留物。水洗分析表明，分析物没有突破。对于下文所述的氧化脂质分析，遵循了等效的方案，除了在提取前用分析替代品对等分样品进行加标，并且将最终提取物重新配制在50μl甲醇中，其中含有先前报告用于血浆分析的替代物回收测定的内部标准(22).
脂质类分离
为了研究培养中脂质类别对细胞反应的差异性影响，使用氨丙基固相萃取（SPE）柱将总脂质提取物分为中性脂质、FFA和磷脂，对已发表的程序进行了轻微修改(23,24). 简言之，将溶解于100μl氯仿中的总脂质提取物装入500 mg氨丙基柱（Supelco，Belleforte，PA），之前用4 ml己烷清洗并活化。用4 ml氯仿洗脱中性脂质，然后用4 ml二乙醚-乙酸（98:2；v/v）洗脱FFA，用4 ml甲醇洗脱磷脂。为了验证这些分离的性能，使用Wako Chemicals USA，Inc.（弗吉尼亚州里士满）的临床脂质试剂盒测定总FFA和分数FFA、磷脂、甘油三酯和总胆固醇水平。所选脂质组分的回收率和相对纯度如所示特定组分中脂质类的回收率>85%，在添加和不添加LpL的情况下相当。中性脂质部分进一步细分为甘油三酯、二甘油酯、单甘油酯、胆固醇酯和游离胆固醇。简单地说，将分离的中性脂质部分干燥，再悬浮在100μl己烷中，并应用于新制备的氨丙基柱。胆固醇在4ml己烷中洗脱，然后在6ml己烷（含1%乙醚和10%二氯甲烷）中洗脱甘油三酯。然后用12 ml 5%乙酸乙酯在己烷中洗脱游离胆固醇部分。最后分别用4ml 15%乙酸乙酯在己烷和氯仿-甲醇（2:1；v/v）中洗脱二甘油脂和单甘油脂。
表1。
从TGRL和TGRL+LpL中分离的脂质组分的回收（n=5）
| 脂质部分 | TGRL回收 | TGRL+LpL回收 |
|---|
| % | |
| 金融流量账户 | 94 ± 3.2 | 96 ± 3.0 |
| 磷脂类 | 93 ± 2.0 | 94 ± 2.4 |
| 甘油三酯 | 87 ± 5.6 | 90 ± 3.6 |
| 胆固醇酯 | 89 ± 6.8 | 86 ± 3.3 |
HPLC/MS/MS脂质测定
TGRL的背景氧化状态通过使用之前描述的基于HPLC/MS/MS的程序定量来自LA和花生四烯酸（AA）的环氧化合物、二元醇和醇来表征(22)适用于配备2.1×150 mm BEH-C18反相柱（Waters）的Quattro Micro串联质谱仪和Acquity UPLC。具体而言，通过反相HPLC分离10μl等分甲醇总脂提取物，并通过负模式电喷雾电离和串联质谱进行分析。测定了LA氧化产物环氧十八碳烯酸、二羟基十八碳烯酸、HODE和氧代十八碳烯酸，以及AA氧化产物环氧二十碳三烯酸、二羟基二十碳三烯酸、羟基二十碳四烯酸（HETE）和氧代二十碳四烯酸。还为LA采集了信号[米/z279.2>261.2，锥电压（CV）=30，碰撞能量（CE）=19，保留时间（tR（右）)=18.66分钟]；α-亚油酸(米/z277.2>259.2，CV=30，CE=19，tR（右）=17.61分钟）；AA公司(米/z303.2>259.2，CV=28，CE=14；t吨R（右）=18.44分钟）；二十碳五烯酸（EPA：米/z301.2>257.2，CV=28，CE=14，tR（右）=17.43分钟）；和二十二碳六烯酸（DHA：米/z303.2>259.2，CV=28，CE=14，tR（右）=18.13分钟）。使用氘化替代物和内部标准方法，根据涵盖所有报告浓度的最小五点校准曲线，对氧苷进行量化。使用d15-HETE回收率，通过六点校准曲线对游离LA和AA进行量化，以校正萃取损失。n-3 FA使用由具有等效碳数的n-6 FA校准曲线产生的响应因子进行伪量化，并且只应视为LpL依赖性增加的迹象。
细胞培养
HAEC购自Cascade Bioscience，Inc.（马萨诸塞州温彻斯特），并在37°C、5%CO的湿化环境中，在补充有低血清（2%FBS）生长补充剂和青霉素、链霉素和两性霉素B的培养基200（Cascade biosciences）中培养2第4代和第6代之间的HAEC在T-75烧瓶中生长，直至汇合。
HAEC处理
为了评估TGRL释放LpL的成分对内皮的潜在影响，HAEC培养物仅用培养基（未经处理的对照）、TGRL或TGRL加LpL盐水处理。LpL本身和热失活LpL在HAEC培养物中均未引起炎症反应（数据未显示）。在脂蛋白暴露的初步研究中，我们用CM、VLDL或TGRL处理内皮细胞，发现CM产生高度可变的内皮细胞反应。相反，VLDL孵育产生了更可预测的内皮细胞损伤诱导；因此，VLDL被选为剩余实验的主要TG源。
TNFα与细胞内粘附分子测定
HAEC用从50mg/dl VLDL中提取的脂质级分处理2小时，加入或不加入LpL，并收获其培养基。使用BD Bioscience的ELISA试剂盒检测TNFα和细胞内粘附分子（ICAM）的产生。
活性氧测定
通过量化2,7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA；Invitrogen，Carlsbad CA）氧化转化为高荧光产品二氯荧光素来探索活性氧的生成(25). 汇流HAEC（104用10μM DCFDA预孵育96周板中的细胞/孔）30分钟。清除了多余的含有DCFDA的介质。用PBS洗涤细胞两次，然后用脂质组分（15μl）、从VLDL中分离出来的（50 mg/dl TG）、不含（14μmol/l FFA）或用LpL（196.5μmol/l FFA）培养细胞2 h，并在37℃培养30 min。从微孔中取出培养基后，用PBS清洗细胞三次，并使用荧光FLA 5100微孔板阅读器（FUJIFLIM，Stamford，CT）在485 nm激发后测量538 nm处的发射荧光密度。为了研究各种氧化生成酶在VLDL+LpL诱导的ROS生成中的作用，在黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇（100μM；Sigma）、NADPH氧化酶抑制剂apocynin（100μM；Sigma-）和二苯碘铵（DPI）（50μM；Sigma）存在的情况下重复进行了检测，或细胞色素P450-2C9抑制剂磺胺酚唑（10μM；西格玛）。为了评估氧化和中性FA对脂解诱导的氧化应激的相对影响，还使用70μM硬脂酸（20μg/ml）、71μM LA或67μM 13-HODE（Cayman Chemical，Ann Arbor，MI）重复检测，并添加或不添加抑制剂。4β-福尔波12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（10μM；Sigma）因其能够刺激氧化活性而被用作阳性对照。
统计分析
所有实验均在至少三个独立试验中进行，一式三份。除非另有说明，否则数值表示为平均值±SEM。采用以下方法评估各治疗组之间的比较t吨-测试。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
LpL诱导VLDL释放FFA
四名健康志愿者的样本在LpL培养后的VLDL EFA和NEFA含量以及NEFA的含量如所示(). 在本实验中，VLDL与LpL孵育30分钟，释放出1.3±0.1%的可用酯化饱和脂肪酸（SFAs）、MUFAs和PUFAs。虽然极低密度脂蛋白（VLDL）脂溶物非酯化MUFA/SFA和n3/n6 PUFA的比率没有被LpL显著改变，但LA的自由浓度增加了1.5倍(P（P）=0.03）当VLDL与LpL预孵育时。
表2。
| VLDL全民教育 | VLDL-NEFA公司一 | VLDL+LpL NEFA一 | LpL释放的NEFA | LpL释放的NEFA |
|---|
| nmol/mg甘油三酯 | | | | % |
| 饱和脂肪酸 | | | | | |
| 14分0秒 | 694 ± 13 | 8.43 ± 1.2 | 16.7 ± 0.98b条 | 8.27 ± 0.98 | 1 |
| 15分0秒 | 75.1 ± 1.6 | 0.622 ± 0.22 | 1.78 ± 0.16b条 | 1.16±0.16 | 2 |
| 十六点零分 | 9240 ± 410 | 148 ± 22 | 268 ± 19b条 | 120 ± 19 | 1 |
| 17点10分 | 64.7 ± 1.9 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 1 |
| 18时0分 | 1350 ± 59 | 38.3±7.1 | 62 ± 6.3b条 | 23.8 ± 6.3 | 2 |
| 19点10分 | 13.2 ± 0.23 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C20:0分 | 10.9 ± 0.43 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C21:0号 | 1.71 ± 0.12 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C22:0号 | 5.15 ± 0.25 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C24:0号 | 3.94 ± 0.24 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| 木法 | | | | | |
| C14:1编号5 | 50 ± 1.6 | 0.951 ± 0.071 | 1.31 ± 0.072b条 | 0.361 ± 0.072 | 1 |
| C16:1n7吨 | 140 ± 5.2 | 0.564 ± 0.042 | 2.57 ± 0.29b条 | 2.01 ± 0.29 | 1 |
| C16:1n7号 | 1,030 ± 61 | 10.7 ± 1.7 | 19.9 ± 1.5b条 | 9.18±1.5 | 1 |
| C18:1n9吨 | 65.6 ± 3.7 | 2.07 ± 0.66 | 4.39 ± 0.65b条 | 2.32 ± 0.65 | 4 |
| C18:1n9/1n7吨 | 7020 ± 300 | 98.7 ± 13 | 167 ± 10b条 | 67.8±10 | 1 |
| C18:1n7/1n6 | 1,170 ± 49 | 18.2 ± 2.7 | 30.8 ± 2.3b条 | 12.6 ± 2.3 | 1 |
| C20:1n9吨/1n12 | 8.24 ± 0.55 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C20:1n9号 | 28.3 ± 0.81 | 1.17 ± 0.088 | 1.58 ± 0.073b条 | 0.411 ± 0.072 | 1 |
| 多不饱和脂肪酸 | | | | | |
| C18:2（9吨，12吨）n6 | 42.8 ± 0.72 | 0.164 ± 0.063 | 0.681 ± 0.089b条 | 0.518 ± 0.089 | 1 |
| C18:2n6号 | 6340 ± 270 | 86.1 ± 13 | 134 ± 11b条 | 48.2 ± 11 | 1 |
| C18:3n6号 | 121 ± 2.1 | 1.69 ± 0.16 | 2.15 ± 0.14 | 0.465 ± 0.14 | 0 |
| C18:2（9吨，11吨）n6 | 115 ± 2.7 | 0.226 ± 0.046 | 1.37 ± 0.24b条 | 1.15 ± 0.24 | 1 |
| C18:3n3号 | 213 ± 4.2 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 2.31 ± 0.37 | 1 |
| 18:4n3元 | 10.9 ± 0.37 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C20:2n6型 | 34.1 ± 0.63 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C20:3n6号 | 190 ± 4.6 | 4.96 ± 1 | 7.66 ± 1.1 | 2.7 ± 1.1 | 1 |
| C20:4n6号 | 732 ± 29 | 28 ± 5 | 36.8 ± 4.5 | 8.83 ± 4.5 | 1 |
| C20:3n3号 | 4.78±0.25 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C20:3n9号 | 34.6 ± 1 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） | ND（无损检测） |
| C20:4n3号 | 11.8 ± 0.3 | 0.628 ± 0.033 | 0.741 ± 0.038 | 0.113 ± 0.038 | 1 |
| C20:5n3分 | 56.2 ± 1.1 | 2.04 ± 0.19 | 2.42 ± 0.21 | 0.38 ± 0.21 | 1 |
| C22:4n6号 | 43.6 ± 1.1 | 1.28±0.15 | 1.81 ± 0.15b条 | 0.535 ± 0.15 | 1 |
| C22:5n6号 | 37.7 ± 0.79 | 1.85 ± 0.22 | 2.27 ± 0.19 | 0.578 ± 0.15 | 2 |
| C22:5n3号机组 | 70.2 ± 2.1 | 2.18±0.25 | 2.75 ± 0.21 | 0.568 ± 0.21 | 1 |
| C22:6n3号机组 | 195 ± 5.5 | 8.65 ± 1.5 | 11.7 ± 1.3 | 3.05 ± 1.3 | 2 |
| C24:6n3号 | 5.78 ± 0.25 | 0.447 ± 0.039 | 0.479 ± 0.041 | 0.097 ± 0.029 | 2 |
使用来自独立健康志愿者组（n=4）的VLDL，发现LpL培养不仅增加PUFA()而且FFA组分中一系列氧化脂质的水平(). 在这种情况下，TGRL脂解使LA衍生的氧化产物增加了9倍以上，包括13-HODE，氧化低密度脂蛋白中主要的氧化脂质(26)，与TGRL相比(). AA-衍生的氧化脂质也有所增加，但浓度远低于LA产品的浓度().
含或不含脂蛋白脂肪酶（LpL）培养的高甘油三酯脂蛋白（TGRL）中的PUFA。使用含或不含LpL的人餐后VLDL（A）、乳糜微粒（CM）（B）或TGRL（C）[2.5 mg甘油三酯（TG），用于脂质提取和氧化脂质测量。对于LpL依赖性脂解，将LpL与CM、VLDL或TGRL在37°C下预孵育30分钟，并在样品提取和FA分析之前通过在冰上转移试管来停止反应。随着LpL处理的进行，VLDL、CM和TGRL中的亚油酸（LA）和花生四烯酸（AA）以及n-3 FAsα-亚油酸、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的浓度增加。一脂质被伪量化，并通过相对响应因子进行调整，以估计其浓度，并允许对这些数据进行一致的图形表示。数据为平均值±SEM（n=3）。
含或不含LpL培养的VLDL中的氧化脂质。LpL处理增加了氧化脂质的浓度。使用含或不含LpL的人餐后VLDLs（2.5 mg TG）进行脂质提取和氧化脂质测量。对于LpL依赖的VLDL脂解，在37°C下将LpL与VLDL预培养30分钟，并在样品提取之前将试管转移到冰上，从而停止反应。LA氧化产物（A）环氧十八碳烯酸（epoxy octadeconoic acid，EpOME）、二羟基十八碳二元酸（DHOME）、羟基十八碳二烯酸（HODE）和氧代十八碳二酸（oxo-ODE），以及AA氧化产物（B）环氧二十碳三烯酸（EET）、二氢二十碳三羧酸（DHET）、羟基二十碳四烯酸（HETE），并测定了氧代二十碳四烯酸（oxo-ETE）。数据为平均值±SEM（n=3）。
TGRL脂解组分诱导炎症介质的表达
通过测量炎性细胞因子TNFα和细胞粘附分子ICAM的产生，评估从VLDL中分离的脂质组分（有或没有LpL治疗）诱导内皮细胞炎症反应的能力。如所示与对照组和其他脂质亚类处理相比，单酰甘油（MGs）或VLDL的LpL后FFA组分处理显著增加TNFα的生成。然而，脂解作用只改变了FFA部分诱导的TNFα的产生。
VLDL及其LpL脂解衍生物增加内皮细胞TNFα生成（A）和细胞内粘附分子（ICAM）表达（B）。ELISA法检测人主动脉内皮细胞TNFα水平和ICAM表达。用从VLDL（50 mg/dl TG）中分离的单个脂质处理12孔板中的内皮细胞培养物2 h，用LpL（2 U/ml）孵育或不孵育30 min。从VLDL中分离出每一组分，蒸发，再溶解，并输送至PBS载体（5μl）中的细胞。测量用TNFα（10 ng/ml，16 h）刺激的TNFα水平或ICAM表达。脂肪分解释放的过量FFA增加了HAEC上TNFα的表达和TNF诱导的ICAM的表达。数据为平均值±SEM（n=6）。CTRL，控制；游离脂肪酸；PL，磷脂；CE，胆固醇酯；甘油三酯；FC，游离胆固醇；DG，甘油三酯；MG，单酰基甘油。
这些组分诱导的ICAM表达是可变的，一些脂质组分，包括FFA、胆固醇酯、游离胆固醇、甘油三酯和MG处理增加了治疗后ICAM的表达(). 然而，如TNFα所示，只有FFA断裂诱导的ICAM表达反应受到VLDL脂解的显著影响(P（P）< 0.01).
TGRL脂解产物诱导ROS生成
通过DCFDA氧化法评估每个脂质组分对HAEC氧化应激的影响。与对照组或其他组分相比，HAEC暴露于FFA 2 h显著增加ROS生成(P（P）< 0.05;). 因此，我们选择从VLDL脂解中分离的FFA来探讨LpL依赖性变化的机制。我们的白蛋白剂量反应实验表明，当培养基中的白蛋白浓度大于50 mg/ml时，VLDL脂解诱导的ROS生成显著降低。在大多数实验中，我们在培养基中使用20 mg/ml白蛋白（2%FBS）。
从VLDL中分离的脂质组分对HAEC中活性氧（ROS）生成的影响。从VLDL（50 mg/dl TG）中分离出每个脂质部分，蒸发、再溶解，并将其输送至PBS载体（5μl）中的细胞。HAEC用H预先培养30分钟2哦2-敏感荧光探针DCF-AM（10μM），然后用从VLDL中分离的单个脂质培养2小时，用LpL（2 U/ml）培养30分钟。用荧光微孔板阅读器测量细胞的荧光强度。DCF-AM氧化的荧光分布以荧光单位（FU）表示，并以平均值±SEM表示（n=6）*P（P）< 0.01. CTRL，控制；游离脂肪酸；PL，磷脂；CE，胆固醇酯；甘油三酯；FC，游离胆固醇；DG，甘油三酯；MG，单酰基甘油。
为了确定参与FFA诱导的ROS产生的途径，我们测量了NADPH氧化酶抑制剂（罗布麻素和DPI）、细胞色素P450抑制剂（磺胺酚唑）和NO合成酶/黄嘌呤氧化酶抑制剂（别嘌呤醇）对FFA诱导的ROS产生的影响。如所示，FFA在HAEC中产生的氧化剂被显著抑制(P（P）<0.01），而不是别嘌呤醇（100μM）。
在没有或存在酶抑制剂的情况下，从VLDL（V-FFA）和VLDL脂解（V+L-FFA）中分离的FFA对HAEC中ROS生成的影响。从VLDL（50 mg/dl TG）中分离出每个脂质部分，蒸发、再溶解，并将其输送至PBS载体（5μl）中的细胞。HAEC与荧光探针DCF-AM（10μM）预孵育30分钟，然后与从极低密度脂蛋白中分离的FFA孵育2小时，在不存在或存在别嘌醇（FFA-AP）（100μM）、罗布麻素（FFA-AC）（100μM）、磺胺酚唑（FFA-SP）（10μM）或DPI（FFA-DPI）（50μM）的情况下，与LpL（2 U/ml）孵育30分钟。用荧光微孔板阅读器测量细胞的荧光强度。DCF-AM氧化的荧光分布以荧光单位（FU）表示，并以平均值±SEM表示（n=6）。平均值的显著差异由双尾学生的t吨-测试(*P（P）与V-FFA相比<0.05**P（P）<0.05 vs.V+L-FFA）。
氧化脂质引起的氧化应激
为了评估氧化和中性FAs对脂解诱导的氧化应激的相对影响，我们测量了脂质诱导的ROS生成。在初步实验中，用20μg/ml硬脂酸（70μM）或LA（71μM）处理的HAEC在ROS生成方面没有显著差异（数据未显示）。然而，与LA（2.7±0.3单位/细胞）或溶媒对照（2.3±0.15单位/细胞。用罗布青素（100μM）、DPI（50μM）和磺胺酚唑（10μM）处理HAEC不会影响13-HODE诱导的ROS生成。
讨论
餐后血脂和碳水化合物的增加已被证明会增加氧化应激，这种状态与心血管疾病和糖尿病并发症的发病机制有关(27,28). 更具体地说，动脉粥样硬化与餐后高脂血症相关，其特征是血液中TGRL水平升高，越来越多的证据表明餐后TGRL比空腹TGRL更易致动脉粥样硬化(三,29–31). 餐后状态下TGRL脂肪分解在内皮细胞附近释放过多的FFA，这可能导致内皮细胞损伤(11)以及随后的内皮功能障碍(32). 此外，TGRL脂解产生的TGRL残余物本身就是致动脉粥样硬化的(33,34)，性质类似于氧化低密度脂蛋白(35–37). 在最近的研究中，我们发现经纯化牛乳LpL体外脂解的餐后TGRLs损伤了HAEC，诱导了炎症因子和细胞因子的表达(8)刺激膜微区聚集，增加活性氧的产生(18). 因此，目前的文献表明，FFA和氧化/刺激残留物都可能导致TGRL脂解诱导的内皮细胞损伤。在这里，我们将新鲜分离的人餐后TGRL与LpL孵育，以生成类似于血液中TGRL脂肪分解的脂肪分解产物混合物。然后，我们研究了TGRL水解过程中产生的哪些可溶性脂质类能够介导内皮细胞损伤，并探索了负责类的组成。
使用炎症介质TNFα和ICAM作为内皮细胞损伤和炎症的标记物，发现TGRL脂溶物比单纯TGRL或与LpL孵育的TGRL产生更多的损伤，而LpL在使用前在70°C孵育30分钟使其部分失活（数据未显示）。LpL介导的脂解前后分离每个TGRL脂质组分为评估这些复杂混合物的独立作用提供了一套独特的材料。使用这些组分，我们发现只有FFA组分在培养的内皮细胞中显示出LpL介导的TNFα、ICAM生成和ROS形成的显著增加。虽然TGRL和TGRL脂解物中的FFA组分均诱导氧化应激，但TGRL脂解物中FFA组份诱导处理细胞产生更多ROS。
据报道，LpL对TGRL的脂解同时具有(38)和/或抗动脉粥样硬化(39)效果。在之前的研究中，Ziouzenkova等人(39)表明LpL介导的TGRL脂解具有抗炎作用；然而，与我们的论文相比，他们的论文有几个关键差异。首先，Ziouzenkova等人用TNFα诱导内皮细胞损伤，而我们没有。其次，LpL浓度是我们研究中使用的浓度（2 U/ml）的100倍（200 U/ml）。肝素治疗后，人血清中含有～66 ng/ml LpL(40). 相比之下，Ziouzenkova等人使用5300–35000 ng/ml的LpL。第三，Ziouxenkova等人混合VLDL和LpL处理细胞，而我们使用LpL在37°C下预处理VLDL（酶脂解）30分钟，然后处理内皮细胞。因此，我们的研究与Ziouzenkova等人的研究存在重大差异，首先是对内皮细胞损伤的刺激。此外，这些差异使得目前的结果难以与Ziouzenkova等人的结果进行比较，因为在之前的研究中，我们表明当内皮细胞用TNFα处理时，LpL（3 U/ml）本身具有抗炎作用(41). 无论如何，这些研究是相辅相成的，每个研究都支持这样一个假设，即溶脂释放的生物活性剂携带在VLDL隔间内。
为了进一步探讨观察到的FFA介导的内皮损伤的潜在机制，我们接下来考虑了FFA组分的含量。FFAs对氧化应激和内皮功能障碍的影响已被广泛研究，并发现其因测试的特定FA而异。例如，在HAEC培养物中，饱和脂肪酸棕榈酸酯和硬脂酸酯被发现具有促凋亡作用，而不饱和脂肪酸则具有抗凋亡作用(42). 然而，高水平的血清PUFAs，如果不能充分防止过氧化，可能会增加动脉粥样硬化并发症的风险(43). 其他研究表明，暴露于油酸和LA会增加人LDL在培养内皮单层的转移，而同等剂量的棕榈酸、亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸则不会(13). 此外，血清FA混合物与LA（而非各种SFA）的选择性富集导致内皮屏障功能的破坏(44). LA增强TNFα介导的氧化应激(45)，并在血管内皮细胞中调节促炎作用(46). 相反，EPA和DHA会减弱粘附分子的表达(47,48)并抑制炎症细胞因子的产生(49)最近的研究表明，DHA的释放可以通过减少p47phox膜的移位来减少细胞内ROS的生成，从而降低NADPH氧化酶的活性(50). 因此，在FA的多不饱和类别中，明显存在不同的作用，膳食PUFA的组成可能是决定体内TGRL依赖性内皮损伤可能性的重要因素。
在本研究中，我们测量了TGRL和TGRL脂溶物FA，发现许多脂质（包括各种PUFA）的游离浓度显著增加。尽管在本研究中使用的两个独立VLDL菌株之间的释放量和在原始VLDL中观察到的NEFA浓度存在一些差异表明LpL均匀地释放可用的酯化FA。值得注意的是，在用于HAEC培养的实验性脂解物中，观察到PUFAs（包括LA、EPA和DHA）过度释放的证据。考虑到LA、EPA和DHA对细胞炎症的相反影响，VLDL脂解物暴露引起的内皮细胞反应将反映颗粒释放的这些“炎症”和“抗炎”脂质之间的平衡。然而，中性脂质只是这些颗粒中存在的一种FA，能够引起抗炎反应。
氧化脂质，如13-HODE、9-HODE以及相应的环氧化合物和二醇是氧化低密度脂蛋白的主要成分(26)和VLDL(51)可以酯化成各种脂池。这种氧化脂质是通过不饱和FA与ROS的相互作用生成的，ROS在溶液中游离或由包括二铁氧化酶（例如脂氧合酶）和血红素单氧化酶（例如细胞色素P450s；CYP）在内的酶协调。各种氧化脂质，包括氧化胆固醇(52)和氧化的1-棕榈酰-2-花生四烯醇-锡-甘油-3-磷酰胆碱(53)据报道，可诱导细胞反应，从而促进活性氧的生成。尽管低密度脂蛋白是人类餐后氧化修饰的主要靶点，但控制体内低密度脂素氧化的因素的平衡仍存在争议。动脉粥样硬化性氧化脂蛋白脂质的一小部分直接来自饮食(31,54)而其他则是在原地循环中形成的。尽管据报道，高单不饱和脂肪的摄入会降低脂蛋白的氧化能力(55)TGRL持续升高，与CM清除率降低相关，导致维生素E向LDL的转移受到限制，同时更容易被氧化(56). 然而，Reaven等人(57)研究不同FA对脂蛋白的影响表明，只有低密度脂蛋白中LA的百分比与脂蛋白氧化程度密切相关。无论如何，氧化脂质明显存在，并可能积极参与动脉粥样硬化的发展。
我们的研究表明，与仅TGRL相比，TGRL暴露于LpL可显著增加自由氧化脂质。在用于HAEC处理的VLDL组分中，LA-衍生的氧化脂质13-HODE和9-HODE升高了10倍以上，而LA在30分钟的脂解过程中增加了～3倍。在最近的一项研究中，Goodfriend等人(58)从接受肝素治疗的受试者的血浆中观察到非酯化氧化脂质显著增加，这表明人体TGRL体内含有这些氧化脂质，正如在大鼠中观察到的那样(51). 因此，在TGRL脂解过程中，似乎释放了大量氧化脂质，并可能参与诱导暴露内皮细胞的反应。在本研究的背景下，有趣的是，内皮细胞单层的形态受到脂蛋白水解而非氧化的脂蛋白的干扰，维生素E可以防止这种干扰(11)支持活性氧介导事件。
TGRL脂肪分解产生的TGRL残余物是餐后TGRL动脉粥样硬化的主要原因(59). 先前的研究表明，TGRL残留物具有类似于氧化低密度脂蛋白的促热和促炎特性(36,37,60,61). Chung等人(35)观察到TGRL的脂解残留物对巨噬细胞具有细胞毒性，且仅TGRL中的FFA或溶血磷脂均不能解释这种细胞毒性。然而，考虑到我们的发现，残余颗粒中的氧化脂质可能有助于其细胞毒性。我们发现，氧化应激是由脂溶性FFA组分和13-HODE引起的，而不是由来自天然TGRL、硬脂酸或亚油酸的FFA引起的。此外，20μg/ml（71μM）剂量的LA没有引起HAEC氧化应激，而13-HODE使氧化应激增加了1.8倍，与对照组相比。然而，LA和13-HODE均在40μg/ml时产生细胞毒性（LA，142μM；13-HODE，135μM）。有趣的是，在Hennig及其同事的一项研究中(46)90μM LA在培养的人脐静脉内皮细胞中诱导了促炎反应。
由于LpL直接锚定在内皮附近，TGRL脂解产物在血内皮细胞界面的浓度预计会高于平均血浆浓度。因此，13-HODE以及TGRL中脂解释放释放出来的其他物种可能对血管内皮具有病理生理作用。此外，TGRL脂解是快速的，导致这种脂解产物的浓度急剧增加，使细胞几乎没有时间产生保护性反应。
先前的研究表明，多不饱和脂肪酸的CYP2C9依赖性代谢与亚油酸衍生环氧化物原毒剂的产生有关(62)细胞内ROS的显著生成和血管内皮的炎症(63). 与这些报告一致，CYP2C9抑制剂磺胺苯唑减少了TGRL衍生的FA组分诱导的活性氧应激，但没有减少13-HODE刺激的ROS生成，这表明该化合物不是该酶的底物。然而，NADPH氧化酶抑制剂减少了TGRL NEFA刺激的活性氧的生成。如前所示(64)FA诱导的人中性粒细胞质膜NADPH氧化酶的激活依赖于中性粒细胞胞浆，并由稳定的鸟嘌呤核苷酸增强。各种FA可以激活NADPH氧化酶，而PUFA是CYP2C家族的底物，在血管细胞类型中产生超氧物(63). 我们的结果清楚地表明，这两条独立的途径，即NADPH氧化酶和CYP450，有助于脂质介导的氧化应激和TGRL脂解刺激的活性氧的产生。
总之，本研究表明，脂肪分解过程中释放的FFA组分包含大量中性和氧化脂质，这些脂质激活NADPH氧化酶和细胞色素P450介导的内皮细胞内ROS生成机制。
致谢
作者感谢Danielle Baute和William Keyes提供的技术援助。
缩写
AA，花生四烯酸
载脂蛋白B
BHT，丁基羟基甲苯
CM，乳糜微粒
二氯荧光素二乙酸酯
DHA、二十二碳六烯酸
EFA，酯化脂肪酸
DPI，二苯碘
二十碳五烯酸
脂肪酸甲酯
HAEC，人主动脉内皮细胞
HETE，羟基二十碳四烯酸
HODE，羟基癸二烯酸
ICAM，细胞内粘附分子
LA，亚油酸
脂蛋白脂肪酶
MG，单酰基甘油
活性氧
SFA，饱和脂肪酸
TGRL，高甘油三酯脂蛋白
脚注
*这项研究得到了国立卫生研究院HL-78615和HL-55665以及Richard A.和Nora Eccles Harrison糖尿病研究捐赠主席的支持。美国农业部农业研究服务项目#5306-51530-016-00D和国家环境健康科学研究所拨款P42 ES04699为本研究提供了额外支持。
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