在发育中的海马神经元中，含有NR2B的NMDA受体可以调节神经元存活、突触增强以及神经元死亡的信号

电生理记录和分析

将含有海马神经元的盖玻片转移到一个记录室，该记录室灌入由以下物质组成的外部记录溶液（单位：mM）：152 NaCl、2.8 KCl、10 HEPES、2 CaCl₂，10葡萄糖，0.1甘氨酸和0.02士的宁，pH 7.3（320-330 mOsm）。贴片移液管由厚壁硼硅酸盐玻璃（Harvard Apparatus，Kent，UK）制成，并填充以葡萄糖酸钾为基础的内部溶液，该溶液含有（mM）:155K葡萄糖酸钾，2MgCl₂，10 Na-HEPES，10 Na-PiCreatine，2 Mg₂-ATP和0.3 Na_三-GTP，pH 7.3（300 mOsm）。电极头经过火焰抛光，最终电阻在5-10 MΩ之间。对于要求高信噪比的实验，电极涂有Sylgard 184树脂（密歇根州米德兰道康宁）。使用Axopatch-1C放大器（加利福尼亚州Union City的Molecular Device）在室温（21±2°C）下记录电流，并将其存储在数字音频磁带上。随后使用WinEDR v6.1软件对数据进行数字化和分析（英国斯特拉斯克莱德大学John Dempster）。在-70 mV电压下对海马神经元进行电压捕获，如果保持电流大于-100 pA或串联电阻漂移超过其初始值的20%（<35 MΩ），则拒绝记录。

在补充有0.3μM河豚毒素（TTX）和50μM苦毒毒素（PTX，均来自英国布里斯托尔Tocris Bioscience）的外部记录溶液中，以3-5 ml/min的速度在记录室中流动，测量全细胞NMDAR介导的电流。将NMDAR介导的电流从外部记录溶液线切换到含有150μM NMDA的溶液线，持续5-10秒，直到电流达到稳定状态，然后返回到无激动剂溶液。由于使用过多的激动剂后细胞很难维持，每次使用NMDA后都要进行至少1分钟的洗脱，并且只能重复2-3次。NMDAR拮抗剂NVP-AAM077和伊芬地尔（Tocris Bioscience或Merck）在电流测量前浴敷3分钟。将所有电流标准化为其各自的初始全细胞激动剂引发的电流，并以基础电流的百分比显示。应用增加浓度的NVP-AAM077抑制谷氨酸（3 mM）诱发电流，使我们能够确定集成电路₅₀NVP-AAM077的值(Frizelle等人，2006年). 在这些实验中，用CNQX（10 mM）补充外部记录溶液，以阻断AMPA和红藻氨酸受体的谷氨酸激发激活。

突触外NMDAR电流分析

为了阻断突触定位的NMDAR，我们使用MK-801的量子激活介导的阻断(Nakayama等人，2005年). 单位：Mg²⁺-含有TTX的自由外部记录溶液只能通过自发（动作电位无关）释放谷氨酸的突触小泡（包），将谷氨酸释放到突触间隙。在MK-801（一种不可逆的（在我们的实验时间范围内）开放通道阻滞剂MK-801+的补充存在下，只有经历这种局部释放的NMDAR（因此被定义为“突触”）被MK-801.拮抗。在应用MK-801以允许足够的突触NMDAR阻滞和3分钟的MK-80l冲刷后，只有突触外NMDAR对随后的全细胞NMDAR介导电流起作用。在使用ifenprodil时，由于该药物难以洗脱，并且可能会导致对含NR2B突触NMDAR群体的低估，因此在量子阻滞方案之前从未使用过该药物。因此，以不成对的方式比较了“全细胞”和“突触外”组分的ifenprodil敏感性。测量的突触外NMDA电流被归一化为MK-801前的电流，并显示为基底的百分比。

NMDAR电流对ifenprodil敏感性的发育性丧失不仅限于突触部位

接下来，我们试图确定这种ifenprodil敏感性的丧失是否同样适用于突触和突触外电流，或者突触外流是否基本上仍然含有NR2B。这将告诉我们NR2A是否有选择性地分裂成突触位置。为了分析突触外NMDAR电流，我们使用了一种既定的方法来选择性和不可逆地阻断突触NMDAR(Nakayama等人，2005年)然后使用激动剂的浴式应用来激活突触外NMDARs。在测量全细胞NMDAR电流后，将神经元置于TTX和Mg²⁺-在MK-801存在下的自由溶液。在这些条件下，谷氨酸量子的自发释放激活突触NMDAR，然后被开放通道阻滞剂MK-801阻断。比较治疗前后的NMDAR电流显示，自发量子神经递质释放下的开放通道NMDAR阻断是进行性的，10分钟后趋于平稳，不再进一步(图2a、b). 这个剩余的电流是突触外的，没有被阻断突触NMDAR的协议减弱。为了最终证明所有突触NMDAR都被该方案阻断，我们分析了MK-801阻断NMDAR前后mEPSCs的形态，NMDAR被自发量子神经递质释放激活（见方法）。衰变动力学有明显变化，表明电流的NMDAR分量丢失(图2c、d). 为了证实这种丢失是完全的，我们将这些mEPSCs的动力学与MK-801存在下高激动剂应用（100μM NMDA）阻断所有NMDAR的动力学进行了比较。在这些条件下，mEPSC动力学与在自发量子释放下NMDAR阻断10分钟的动力学相同(图2c)表明所有突触NMDAR确实被阻断。

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图2

NMDAR电流对ifenprodil敏感性的发育性丧失不仅限于突触部位

A） 量子传输平台下MK-801暴露10分钟后全细胞电流损失(n个=3). 将神经元置于电压钳下，测量全细胞NMDAR介导的电流。然后将神经元置于镁中²⁺-含有TTX和MK-801的自由外部记录溶液，在指定时间内，允许通过谷氨酸的量子释放激活突触NMDAR后，对其进行开放通道阻断。B） 应用MK-801 10分钟前后的全细胞电流跟踪（DIV 9）示例，此时NMDAR仅通过谷氨酸的自发释放激活（表示为“量子块”）。C、 D）确认所有突触NMDAR均被该程序阻断。C） MK-801 NMDAR阻断剂自发释放10分钟前后mEPSC形状示例。同样用于比较的是实验结束时记录的mEPSC，其中所有NMDAR都被MK-801存在时添加高浓度激动剂阻断。D） 之前从细胞中记录的mEPSC衰减常数的累积分布曲线示例(n个=185）及之后(n个=157）10分钟的“量子块”，以说明衰变动力学的变化。E） 比较全细胞和突触外NMDAR电流对ifenprodil（3μM）敏感性的发育损失。DIV 7-11神经元的全细胞电流(n个=21）和DIV 12-18神经元(n个=19）分析。DIV 7-11神经元的突触外电流(n个=21）和DIV 12-18神经元(n个=17）分析。*p<0.05双尾非配对T检验。

毫不奇怪，我们发现在DIV7-11，ifenprodil对突触外电流产生了接近最大的阻滞（77±2%，n个=18），就像它对全细胞电流所做的那样(图2e). 然而在DIV12-18时突触外NMDAR电流的阻断显著降低（65±3%，n个=16,第页< 0.01图2e)表明一些NR2A-NMDAR被整合到突触外位点，如前所示(Thomas等人，2006年). 然而，重要的是，突触外NMDAR电流的ifenprodil敏感性仍然显著高于全细胞电流的敏感性(图2e)表明NR2A-NMDAR优先并入突触位点。

NR2B-NMDAR可以调解促死亡和促生存NMDAR信号

鉴于DIV7-11的突触和突触外NMDAR电流基本上都是NR2B-NMDAR介导的，我们想确定NR2B-MMDAR是否能够在单个神经元类型中介导生存和死亡信号。实验在DIV8-11进行。我们首先观察了NMDAR发出的死亡前信号，该信号是由浴用毒性剂量的NMDA（50μM）诱导的。MK-801和ifenprodil均能防止兴奋性毒性细胞死亡(图3a、b). 此外，我们测试了NVP-AAM077（30 nM）的NR2A接触水平的影响，该水平抑制约70%的NR2A-介导电流和10%的NR2B介导电流，这些电流由50μM NMDA诱发(Frizelle等人，2006年). 30 nM NVP-AAM077对细胞死亡没有影响。然而，除了含有NR2A的NMDAR（400 nM(Frizelle等人，2006年))具有神经保护作用(图3a、b). 接下来，我们试图确定在DIV9海马神经元中是否可以实现突触NMDAR依赖性神经保护，以及是否由NR2B-NMDAR介导。

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图3

NR2B-NMDAR可以调解死亡前NMDAR信令

A、 B）A）在暴露于50μM NMDA 1 h之前，用指示的拮抗剂对神经元进行预处理。然后将神经元返回到无NMDA培养基中，并在24 h后评估死亡情况。MK-801（10μM）、ifenprodil（3μM）和NVP-AAM077（30 nM和400 nM）。B） 示例图片（比例尺20μm）。*p<0.05双尾配对T检验。

然后，我们使用已建立的星形孢菌素诱导的细胞凋亡模型，并评估突触NMDAR活性对这种损伤的脆弱性的影响。我们发现，用MK-801和用ifenprodil阻断自发NMDAR活性可加剧staurosporine诱导的神经元死亡(图4a). 因此，自发的NR2B-NMDAR活性显然在这种细胞死亡模型中发挥了保护作用。除了用拮抗剂抑制自发NMDAR活性外，通过去抑制神经元网络还可以增强突触NMDAR的活性。用GABA处理大鼠皮层神经元可以启动突触活性_A类受体阻滞剂荷包牡丹碱(Hardingham等人，2001年). 该刺激方案诱导与NMDAR依赖性钙相关的动作电位爆发²⁺瞬态(哈丁汉和巴丁，2002年). 这种增强的活性促进了在面对凋亡损伤时的有力保护(图4b、c)此外，MK-801和ifenprodil都降低了所提供的保护。注意，在布洛芬存在的情况下，荷包牡丹碱治疗仍有很小的保护作用(图4b)，可能是因为它不能完全阻断NR2B NMDARs。总之，NR2B-NMDAR能够向神经保护和神经元死亡发出信号。

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图4

NR2B-NMDAR可以调节促生存NMDAR信号

A） 阻断自发NR2B-NMDAR活性会加剧staurosporine诱导的细胞凋亡。暴露于staurosporine（50 nM）24小时前，用MK-801（10μM）或ifenprodil（3μM）处理16小时的神经元*p<0.05双尾配对T检验。

NMDAR发出的生存和死亡信号

尽管来自动物研究的大量证据表明NMDAR活性与缺血后神经元丢失有关，但由于耐受性和有效性较差，许多不同NMDAR拮抗剂治疗中风的临床试验都失败了(Ikonomidou和Turski，2002年,缪尔，2006年). NMDAR在突触可塑性和传递以及学习和认知中发挥着核心作用，这一事实解释了拮抗剂不希望产生的心理模拟和中枢神经系统不良反应(缪尔，2006). 然而，当这些副作用是靶向而非非靶向效应时，试验设计可能过于谨慎，试图避免精神病和其他CNS副作用。其他问题给NMDAR拮抗剂的明确评估蒙上了阴影，例如试验中的患者数量和用药时间。由于许多大型制药公司回避NMDAR拮抗剂，这些问题可能不会很快得到解决。

然而，越来越多的证据表明，生理性突触NMDAR活性发挥神经保护作用(Ikonomidou和Turski，2002年,哈丁汉和巴丁，2003年,Hetman和Kharebava，2006年)有人建议，它可能在促进恢复和防止半影延迟神经元丢失方面发挥作用(Albers等人，2001年,Ikonomidou和Turski，2002年). 因此，全球NMDAR拮抗剂可能会阻断NMDAR激活的促死亡信号，以应对缺血挑战，但会干扰半影区的某些恢复或预处理过程。NMDAR拮抗剂的抗兴奋毒性作用从未受到质疑，但直到最近，NMDAR的促生存作用还不清楚，因此拮抗剂没有在暴露其有害作用的环境中进行测试。在治疗与死亡前NMDAR信号相关的疾病时，可能需要阻断死亡前信号，而不影响生存前信号或突触可塑性。

NR2B-NMDAR在促进细胞死亡中的特定作用将使NMDAR的这一特定亚型成为靶向，而不会使用现有的高选择性拮抗剂损害促生存信号。然而，我们的观察表明，NR2B-NMDAR能够促进生存和死亡信号。此外，在更成熟的神经元（DIV21）中，NR2A-NMDAR最近被证明能够介导兴奋毒性和保护性信号(von Engelhardt等人，2007年). 综上所述，这些研究表明NR2B-NMDARs和NR2A-NMDARs都能够介导生存和死亡信号。因此，如最近所述，NR2B-NMDARs和NR2A-NMDARs分别促进死亡和存活的特异能力(Liu等人，2007年)可能不适用于所有发育阶段的所有神经元类型，因此NR2B特异性拮抗可能不是最佳的抗兴奋毒性策略。此外，最近在3周大的急性海马脑片中观察到突触和突触外NMDAR具有类似的NR2B成分(哈里斯和佩蒂特，2007年)表明NR2B选择性拮抗剂即使选择性靶向突触外NMDARs也可能不成功体内另一个复杂的事实是，当激动剂浓度较低时，ifenprodil和相关NR2B拮抗剂实际上会增强NR2B-NMDAR电流，因此在低到适度的环境谷氨酸条件下可能会增强突触外电流(内顿和保莱蒂，2006年). 另一种在阻止细胞外介质中谷氨酸兴奋毒性剂量升高的效应的同时保留跨突触NMDAR信号的药理学方法可能涉及低亲和力非竞争性拮抗剂，如美金刚。其缺乏竞争力的性质导致非常有效地阻止环境中高浓度谷氨酸或NMDA引起的过度慢性NMDAR活动(Chen和Lipton，2006年). 然而，由于其快速关闭速率，美金刚胺不会通过在通道中积累而实质性地干扰正常的突触NMDAR活动(Chen等人，1998年,Chen和Lipton，2006年,Wrighton等人，2007年)相比之下，MK-801是一种无竞争力的拮抗剂/开放通道阻滞剂，其关闭速率极慢。作为一种在病理而非生理情况下优先对抗NMDAR的药物，它具有潜在的优势，可以保护所有神经元，无论其NMDAR亚单位的组成如何。

突触可塑性方向性的亚单位依赖性？

NMDAR的NR2组成可能在突触可塑性的方向性中发挥重要作用。有人提出，含NR2A的NMDAR优先参与突触的增强，而含NR2B的NMDARs主要在抑郁症中起作用(刘等人，2004,Massey等人，2004年,Bartlett等人，2007年). 然而，其他研究表明，含有NR2A的NMDAR对NMDAR依赖型LTP的诱导并不重要，并且含有NR2B的NMDARs也可以很好地调节这种诱导(Berberich等人，2005年,Weitlauf等人，2005年,Zhao等人，2005年,Berberich等人，2007年,Le Roux等人，2007年).

这一争议的一个潜在原因是NVP-AAM077的使用，据报道该药物选择性阻断NR2A-NMDAR(Auberson等人，2002年)这导致它被用于在各种过程中牵连NR2A-NMDAR。然而，后来的研究表明，这种拮抗剂的选择性不如最初想象的那么强(Berberich等人，2005年,Frizelle等人，2006年,内顿和保莱蒂，2006年). 此外，NVP-AAM077甚至在NR2A-/-小鼠中也能抑制NMDAR依赖性LTP，并减弱神经元中NR2B受体介导的NMDAR电流(Weitlauf等人，2005年). 事实上，在最常用的浓度（300–400 nM）下，NVP-AAM077将基本上阻断含有NR2A和NR2B的NMDAR的突触激活，因为其缓慢的解离速率常数将意味着在突触时间尺度上，谷氨酸和NVP-AAM 077结合无法达到平衡(Frizelle等人，2006年,Wyllie和Chen，2007年). 然而，低浓度（30 nM或更少）的应用可用于提供一些NR2A选择性拮抗，并在突触增强中特异性地牵涉到NR2A(Frizelle等人，2006年,Bartlett等人，2007年).

分歧的另一个潜在原因在于NR2A的表达是发育调控的，从P6-P10开始(Sheng等人，1994年,Zhong等人，1994年). NR2A亚单位对突触NMDAR电流的贡献越来越大(斯托卡和维奇尼，1998年,托瓦尔和韦斯特布鲁克，1999年)因此，发育阶段可能对NR2A与NR2B-NMDAR在过程（如LTP）中的参与产生重大影响，而与任何亚单位特定的信号要求无关（如参见(Le Roux等人，2007年)). 我们的研究表明，在未成熟的海马培养物中，NR2B-NMDAR能够通过分析mEPSC频率来调节突触连接的活性依赖性增强。

我们感谢Y.P.Auberson博士（瑞士巴塞尔诺华生物医学研究院）为NVP-AAM077提供的礼物。这项工作得到了英国皇家学会、威康信托基金会和欧洲委员会的支持。