氧化应激改变Syndecan-1在肺部的分布纤维化^*S⃞

摘要

特发性肺纤维化（IPF）²是一个以严重和进行性纤维化为特征的间质性肺病。IPF患者的平均生存期为3-5年(1,2)没有有效的治疗方法(三,4)，原位肺除外移植已被证明可以提高生存率。IPF的发病机制是理解不足；然而，炎症和氧化/抗氧化失衡肺被认为起着重要作用(5——7).更好地理解氧化的分子机制损伤和纤维化可能导致新的治疗方法的发展目标。

细胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）是一种与抗氧化酶结合的酶硫酸乙酰肝素在肺细胞外基质中的表达(8——10),可以抑制炎症(11,12)并防止后续纤维化的发展(13——16).尽管EC-SOD发挥了有益的作用，但其保护肺仍然未知。

细胞外基质（ECM）对组织内稳态和ECM微环境的变化可能对细胞功能有害炎症和伤口愈合。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）含有膜结合核心蛋白和细胞外碳水化合物侧链。Syndecans是人类中最丰富的热休克蛋白；有4种亚型可变单元格表达式(17,18). syndecan-1和-4在肺部表达，具有上皮细胞和普遍表达，分别(19). Syndecans公司通过结合细胞因子和生长因子对ECM稳态至关重要，作为共受体和可溶性效应物。他们也有潜在的角色在炎症中(18,20,21)、纤维化(22,23)和伤口愈合(24——26).Syndecans在生理和病理条件下脱落，但棚内合成癸烷的功能尚不清楚(22). 活性氧物种（ROS）能够裂解HSPG(27)和其他ECM部件。值得注意的是，EC-SOD已被证明可以防止许多ECM的氧化损伤组件(23,28,29). 在肺部，EC-SOD通过肝素结合域与细胞表面的syndecan-1结合(8,30). 因为已知的syndecans的功能及其与EC-SOD的密切相互作用，syndecan-1是一种可能有助于抗炎和抗纤维化的关键靶点EC-SOD对肺和肺纤维化的影响。

本研究旨在确定EC-SOD在保护ECM与氧化应激的关系，并研究我们关于EC-SOD的假设通过抑制氧化诱导的syndecan-1的脱落。我们的研究结果表明，EC-SOD在肺部的丢失使syndecan-1易受氧化应激影响，并氧化脱落syndecan-1胞外区诱导中性粒细胞趋化，损伤上皮损伤愈合，促进纤维生成。氧化应激改变syndecan-1在肺微环境中的分布是一个新发现在肺纤维化的背景下。这些发现促进了人们的理解特发性肺纤维化的发病机制，并提供潜在的IPF干预的新治疗靶点。

材料和方法

动物治疗-动物实验方案由匹兹堡大学IACUC。野生型C57BL/6和EC-SOD-null小鼠（EC-SODKO）(13)接受了治疗气管内注入0.1 mg青石棉或二氧化钛（惰性控制粒子），如前所述(15,23). 选择1的研究白天的时间点包括与石棉和50个单位的纯化人共同处理EC-SOD公司(30,31). 1、14和28天后治疗后，支气管肺泡灌洗液（BALF）恢复，肺部已处理(32). 肺部快速冷冻并均质以进行Western blot。对其他小鼠进行治疗用0.05单位的博来霉素气管内注射，并在注射后7天进行处理处理方法与石棉试验相同(14).

人体样本-人BALF和石蜡包埋肺样本来自IPF，在国家临床中心获得正常肺贝塞斯达卫生研究院（NIH），医学博士或获得了匹兹堡IPF和对照组织的肺匀浆样本通过匹兹堡大学卫生科学组织库前面描述的(33). 这个国家NHLBI和NHGRI批准使用这些样品匹兹堡大学卫生研究所。肺匀浆样本取自活检或移植肺的手术残留物来自接受肺移植的IPF患者。均质化该过程与上述人体肺部样本的处理过程相同。全部患者符合美国制定的IPF诊断标准胸科学会和欧洲呼吸学会(34). 对于免疫组织化学，见下文。

西方印迹法-BALF和肺匀浆蛋白用SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯膜(14,23)并探测利息。用鼠抗鼠抗体检测膜syndecan-1外结构域（281.2，BD Biosciences）或小鼠抗人syndecan-1（B-A38，Diaclone，Besancon，法国），然后是辣根过氧化物酶（HRP）结合驴抗鼠和抗鼠二级抗体（Jackson免疫研究，宾夕法尼亚州西格罗夫）。ECL检测试剂用于可视化（ECL-plus，GE Healthcare）。Ponceau红膜染色用于BALF蛋白归一化，β-肌动蛋白密度测定用于使匀浆正常化。使用Gel Logic 2200系统拍摄图像密度测定（平均归一化净强度±S.E.）。

实时PCR-RT-PCR用于测定mRNA的表达野生型小鼠EC-SOD的（ddCt相对定量）氧化钛₂或石棉（14天时间点）和野生型syndecan-1和用TiO2处理的EC-SOD KO小鼠₂（第14天），使用7300 Applied生物系统PCR系统和引物/探针组（EC-SOD-Mm00448831_s1；syndecan-1-Mm00448918_m1 Sdc1，Applied Biosystems）如前所述(35). 数据报告为表达百分比（相对于GAPDH表达）与控制，n个=每组每个基因4个样本。

免疫组织化学-小鼠肺部充气固定10%缓冲福尔马林和石蜡包埋。嵌蜡IPF和控制还检查了人的肺部。加热5μm厚的组织切片在60°C下过夜，用二甲苯脱蜡，用乙醇再水化并对syndecan-1和EC-SOD进行荧光染色。人和老鼠肺切片用syndecan-1（1:500，B-A38，马萨诸塞州剑桥Abcam；小鼠：281.2，BD Bioscience）和EC-SOD（1:500，如下文所述生成）和标记有Cy3和Alexa 488（1:5000，Jackson Immunoresearch，Westgrove，PA）。控制部分用免疫前血清或非免疫IgG染色。

抗-EC-SOD抗体的制备-小鼠和人类EC-SOD用a免疫家兔产生特异性多克隆抗体钥匙孔帽贝血蓝蛋白（KLH）结合肽，包含第一个小鼠EC-SOD中的19个氨基酸和位置处的额外半胱氨酸残基20（SSFDLADRLDPVEKIDRLDC）或含有人类EC-SOD氨基酸的肽残基19-37和位置20的额外半胱氨酸残基（WTGEDSAEPNSDSAEWIRDC）由AnaSpec Corporation（加利福尼亚州圣何塞）提供。抗体通过Western blot检测证实了EC-SOD的特异性肺匀浆分析。还收集免疫前血清以获得控制IgG。

细胞培养-原代小鼠肺泡上皮细胞如前所述，从6周龄C57BL-6小鼠中采集和培养(36)生长在胶原蛋白上生长培养基实验用IV涂层24孔板（Dulbecco改良含10%胎牛血清的Eagle培养基，50国际单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、Invitrogen）。A549，人牙槽骨上皮细胞（ATCC）和LL47，即人肺成纤维细胞（ATDC）在24孔板上用生长介质（F12K）分别生长含10%胎牛血清的培养基；Invitrogen）。谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-人syndecan-1胞外域融合蛋白（hS1ED）用于浓度在500 ng/ml至1μg/ml（由Alan Rapraeger博士提供，并按照之前的描述进行纯化(37)). 目前的研究关注外结构域蛋白本身的功能，因为没有蛋白质上存在糖胺聚糖链。

成纤维细胞增殖和TGF-ß1释放-LL47型成纤维细胞被镀在96个板（4000个细胞/孔）上，并放置在治疗前24小时无血清F12K培养基。用培养基处理细胞或1μg/ml hS1ED，在37°C/5%CO下24小时₂.成纤维细胞使用CellTiter 96 AQ非放射性试剂在2小时内测定增殖在333μg/ml MTS和25μ米PMS（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。490 nm处的吸光度，与代谢活性细胞，记录在平板阅读器上，并报告为平均值±S。E.、。，n个= 8. LL47也在12日培养汇合将聚苯乙烯板放置在无血清培养基中24小时，并进行处理用1μg/ml hS1ED处理48 h。收集上清液并通过潜伏和活性TGF-ß1的ELISA检测（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）。对于α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）检测，成纤维细胞裂解产物收集在带有蛋白酶抑制剂的冰镇细胞裂解缓冲液中并在SDS页面上分开。转移到膜后，小鼠使用抗α-SMA一级抗体（Sigma）进行检测如前所述，归一化为β-actin。

中性粒细胞趋化性-改进的Boyden室(38)，用于评估人类中性粒细胞（PMN）对脱落的syndecan-1外结构域的趋化反应A549细胞上清液、hS1ED（1μg/ml）或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（热休克蛋白，6μg/ml，西格玛）。用活性氧物种处理样品（ROS）如前所述(23)，纯化的人EC-SOD(30,31)或CuZn-SOD（Alexis，San）加利福尼亚州迭戈）。在无菌HBSS中使用1.25μ米硫酸铜（0.1米不₂人事军官₄/50μ米CuSO公司₄; pH值7.4）和1.5 m米氢芬顿类化学体系中的过氧化物(23,28,29,39). 我们以前的研究(23)表明0.068nmol/min/ml超氧化物是在本研究中使用的剂量下产生的。使用柠檬酸盐和percoll分离方案分离人类PMN(40)和2×10⁶将HBSS中的细胞添加到上跨阱插入物（5μm孔径，康宁公司，纽约州康宁）。下井含有HBSS（Sigma）指定的处理并孵育2小时。对于选定的实验，A549用培养基人syndecan-1 siRNA（sc-36587，Santa Cruz Biotechnology）或阴性对照siRNA（AM4611，Ambion）24小时ROS处理之前，敲低细胞表面syndecan-1的表达。这个在30和60μ米.A型浓度为30μ米用于所有其他实验以及Lipofectamine 2000（Invitrogen）和Opti-em I（Invit罗gen）试剂符合制造商的协议。然后处理细胞在37°C/5%CO条件下使用ROS 2小时₂.细胞上清液收集并应用于趋化试验的下室。使上室中的中性粒细胞在37时趋化2小时°C/5%一氧化碳₂Beckmann上完成了较低的井细胞计数Coulter计数器（加利福尼亚州Fullerton Beckmann-Coulter）。迁移索引为计算每组（41个；迁移细胞进行治疗/随机迁移细胞（HBSS））。指数大于1表示趋化性阳性（±标准偏差）。

脱落和伤口分析-用于脱落分析，A549细胞在37°C/5%CO下暴露于ROS和EC-SOD 30分钟₂.对细胞进行syndecan-1免疫荧光染色(42)，上清液通过斑点杂交和syndecan-1 ELISA分析脱落syndecan-1外结构域试剂盒（抗CD138，syn-1，Diaclone，法国）。凋亡，通过caspase-3活性，使用荧光caspase-3在10μg A549细胞裂解物中进行分析底物IV，ROS处理后，报告为平均相对荧光单位，RFU±S。E.（加州圣地亚哥Calbiochem）。对于伤口化验，将原代小鼠肺泡上皮细胞或A549细胞镀在胶原蛋白上IV涂层板，并在生长培养基中生长汇合。笔直的伤口使用p-200吸管尖端创建(43)、清洗和处理受伤后立即出现hS1ED（500 ng/ml或1μg/ml）。图像是使用4倍物镜在时间0和18进行相位对比拍摄，或20 h。人syndecan-1 siRNA（Santa Cruz Biotechnology）和阴性对照（加扰的）siRNA（Ambion）被用于抑制syndecan-1的表达A549电池如上所述。对于siRNA实验，24小时后创面siRNA处理后，立即添加hS1ED（1μg/ml）伤口被制造出来并清洗干净。变形软件（分子器件，宾夕法尼亚州唐宁镇）被用来测量伤口面积。结果显示为伤口愈合百分比。愈合百分比计算如下：（伤口面积（初始）-伤口面积-（最终））/伤口面积（初始）×100。

统计分析-平均密度测定和所有其他定量数据（平均值±S.E.）的显著性使用学生t检验或方差分析，然后使用Tukey的后验Graphpad Prism软件（加利福尼亚州圣地亚哥Graphpad）。实现了重大意义由第页值<0.05。样本大小(n个)如所示图形图例。

结果

石棉诱导肺损伤后Syndecan-1外体脱落增加小鼠损伤-研究syndecan-1胞外区脱落在肺纤维化模型中，我们测量了肺组织中shed-syndecan-1蛋白水平野生型和EC-SOD-null小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）（EC-SOD KO）在石棉和博莱霉素诱导的肺损伤模型中的表达纤维化。EC-SOD KO小鼠更容易受到氧化损伤和肺损伤纤维化(13——15,34). 石棉损伤后，野生型小鼠在1、14和28岁时BALF中脱落的syndecan-1水平增加石棉暴露后天数(图1，A–C，个= 5). 值得注意的是石棉损伤后来自ECM的syndecan-1显著(第页<0.05）在第1天和第28天，缺乏EC-SOD的小鼠进一步增加KO小鼠，图1，A类和C类). Syndecan-1也被发现显著(第页<0.05）石棉后28天肺匀浆增加暴露，暴露后14天开始出现趋势(图1，E类和F类，个= 4–5). 观察到类似的结果在博来霉素肺纤维化模型中。棚syndecan-1水平显著地(第页<0.001）EC-SOD-KO小鼠BALF增加博莱霉素治疗后7天与野生型小鼠比较(图1D类，个=5). 此外，在EC-SOD KO小鼠的24小时时间点，与石棉和50个单位的EC-SOD在气管内显著降低中性粒细胞(第页< 0.05;图。1,G–a公司)和脱落syndecan-1的减少BALF公司(第页< 0.01;图1，G–b类).

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图1。

缺乏EC-SOD导致syndecan-1在石棉或石棉后的支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织博莱霉素暴露。BALF和野生动物肺匀浆中的Syndecan-1通过Western blot分析检测类型和EC-SOD KO小鼠，并显示为归一化净强度（平均值±S.E.），n个=每组5只小鼠。BALF数据的结果标准化为蛋白质负荷，由膜的蓬松红染色。肺匀浆的结果是标准化为β-actin。将syndecan-1放入BALF，地址：(A类)石棉暴露后1天，*，第页< 0.05; (B类)14天石棉暴露后，*，第页< 0.05; (C类)28天石棉暴露后，*，第页< 0.05, **,第页< 0.001;和(D类)博莱霉素暴露后7天，*，第页< 0.001.E类，石棉暴露后14天肺匀浆中的syndecan-1和(F类)石棉暴露后28天，*，第页< 0.05.用石棉和纯化的EC-SOD共同处理EC-SODKO小鼠，结果是G–a公司中性粒细胞减少，第页< 0.001; **,第页< 0.05; 和中G-b公司syndecan-1水平降低，第页< 0.05; **,第页<0.01，在第1天的BALF中，n个= 4.

IPF中Syndecan-1胞外体水平增加-确定是否我们测量了受IPF影响的受试者也会出现syndecan-1脱落通过Western blot分析，获得BALF和肺匀浆中的syndecan-1来自符合ATS/ERS标准的散发性IPF患者(34). Syndecan-1水平为BALF显著增加(第页<0.01）和肺部匀浆(第页与对照组相比，IPF患者<0.05）主题(图。2A类).

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图2。

Syndecan-1增加了IPF肺的BALF和肺匀浆与正常情况相比。通过Western blot分析和表示为标准化净强度（标准化为蛋白质负荷通过BALF样品膜的Ponceau红染色和肺匀浆样品标准化为β-actin（平均值±S.E.）。syndecan-1增加(A类)BALF样本；*，第页<0.01，n个=5和(B类)肺匀浆样本；*，第页<0.05,n个= 4–5.

Syndecan-1在纤维化肺区域和结肠中增加EC-SOD公司-为了进一步评估syndecan-1的表达肺纤维化，syndecan-1和EC-SOD的免疫荧光染色为在有或无纤维化的人和小鼠肺上进行。图3A类描绘肺部正常人肺切片和散发性IPF。正常人肺图3，A–A显示EC-SOD普遍染色(绿色)稀疏染色合成癸烷-1(红色)以及这两种蛋白质的共同定位(黄色的具有箭头). 类似地，在图3，A–c，一个IPF肺中具有正常结构的组织区域无处不在EC-SOD和稀疏syndecan-1染色。相反，图3A、 b条和d日，描绘了IPF切片中染色的纤维化区域在肺泡上皮细胞的胚泡表面强烈表达syndecan-1，终末支气管上皮细胞和纤维化区域内(双星号). 纤维化区域EC-SOD染色减少(图3，A–b类，单个星号)和共同本地化肺上皮中含有syndecan-1(图3，A–d，箭头). 纤维化区域为通过委员会认证的系列肺切片的H&E染色鉴定病理学家。^三总的来说，在IPF肺纤维化区域，syndecan-1染色增加间质EC-SOD降低。

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图3。

EC-SOD和syndecan-1在人和小鼠肺中的定位部分。 绿色EC-SOD；红色，syndecan-1；蓝色,核染色；黄色的，共同本地化。A类，人肺：那里EC-SOD在正常肺实质中弥漫性表达(一)和syndecan-1表达的焦点区域与EC-SOD共定位(黄色的；箭头). IPF肺的正常肺结构区域(c（c）)对EC-SOD和syndecan-1都显示出相似的标记。相比之下纤维化(b条和d日)syndecan-1染色增强(红色染色，星号)，EC-SOD降低（绿色染色，单色星号），并且只有这个syndecan-1的一小部分仍然与EC-SOD公司(黄色染色，箭头).B类，肺组织用石棉或TiO处理的野生型和EC-SOD KO小鼠₂在暴露后28天。一，TiO的正常肺结构₂处理过的野生型显示弥散EC-SOD染色(绿色)和焦点与EC-SOD共定位的syndecan-1表达(橙色/黄色)与人类肺部的情况相似。b条石棉纤维区域经处理的野生型小鼠表现出弥漫性syndecan-1染色增强(双重的星号)与EC-SOD共同本地化(黄色，箭头).对EC-SOD KO小鼠肺进行syndecan-1染色，描绘(c（c）)TiO后正常肺结构₂治疗（发现H&E图像补充图E2）和(d日)石棉治疗后纤维化。弥漫性syndecan-1染色在纤维化(双星号). 未发现非免疫性染色血清或IgG对照染色，参见补充图E1。

在石棉小鼠模型中，石棉诱导的损伤导致支气管周围和肺泡纤维化与IPF相似。确认人IHC染色结果，小鼠肺切片进行EC-SOD染色TiO之后的syndecan-1₂或石棉暴露（28天时间点）。图3，B–a类显示弥散EC-SOD染色(绿色)和稀疏syndecan-1(红色)TiO后野生型小鼠的正常肺₂暴露。相比之下图3，B–B类显示syndecan-1的扩散增加(双星号)，减少了间隙EC-SOD(单个星号)以及两者的共同本地化野生型小鼠的蛋白质(黄色的具有箭头). 同样，在EC-SOD KO小鼠中，syndecan-1在石棉处理后的纤维化(图3，B–d类，双星号)与…相比TiO2处理小鼠(图3，B–c类).

先前的研究表明，EC-SOD在肺间质中减少纤维性损伤后肺泡衬液增加，通过肺匀浆和BALF的Western blot分析确定，分别(15,32). 实时PCR用于确认小鼠肺EC-SOD的IHC染色。EC-SOD基因表达在暴露后14天；EC-SOD基因表达百分比氧化钛₂-治疗肺：100%±4.96与76.32%石棉处理的肺为±3.40(第页< 0.05,n个=4） 。Syndecan-1基因在肺部的表达没有显著差异TiO之间₂，对照处理野生型小鼠（100%±4.51）和EC-SOD KO小鼠（99.46%±4.51）第页= 0.95,n个= 4.有关图形表示，请参阅在线补充图E3。这让我们假设EC-SOD的缺失可能使syndecan-1易受氧化应激导致膜结合的syndecan-1脱落。

EC-SOD防止Syndecan-1氧化脱落-收件人确定氧化应激是否导致syndecan-1脱落在里面体外，A549细胞（人肺泡上皮细胞系）暴露于有无人类EC-SOD时的ROS。A549细胞对syndecan-1的氧化脱落(第页<0.05）之后，细胞上清液中的shed syndecan-1水平增加活性氧治疗(图。4A类). 活性氧治疗不会诱导细胞凋亡细胞，如细胞裂解液中caspase-3活性在ROS治疗（caspase-3活性，RFU：中等657.1±73.1与活性氧405.3±75.1；第页= 0.074,n个= 3).此外，EC-SOD治疗可以显著(第页< 0.01)保护这些细胞免受ROS诱导的syndecan-1脱落。符合这些发现，我们观察到ROS后细胞表面syndecan-1染色丢失暴露表明EC-SOD处理抑制了脱落(图4B类). 这个培养基后A549细胞上清液中syndecan-1的浓度与通过ELISA测定ROS处理为9.2 ng/ml±2.3和42.3纳克/毫升±1.9(第页< 0.0001),分别是。十二烷-1外结构域和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖

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图4。

EC-SOD可防止syndecan-1的氧化脱落。A549电池在有或无EC-SOD或CuZnSOD的情况下用活性氧进行治疗。A类用斑点印迹法检测培养基中的人syndecan-1。结果显示，经过介质处理的网点强度增加了倍控制（平均值±S.E.）；*，第页< 0.05; **,第页<0.01.B类，A549上syndecan-1的代表性荧光染色在没有和存在EC-SOD的情况下，用ROS处理后的细胞。C类，用培养基、对照siRNA处理的A549的上清液，或syn-1 siRNA在HBSS或ROS治疗前24小时用于趋化试验。上清液中氧化脱落的syndecan-1是对中性粒细胞的趋化作用(项目管理编号). syndecan-1表达下调ROS治疗后抑制趋化性。*，第页<0.001和**，第页< 0.01与哈佛商学院；^，第页< 0.001.D类，氧化碎片硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(热休克蛋白)和(E类)未修饰的hS1ED促进PMN的趋化性(n个= 6, *,第页< 0.005). 数据报告为PMN迁移指数（±S.E.）。治疗分三次完成。数据是三个独立实验的代表。

促进趋化作用-炎症细胞内流是肺纤维化的发病机制(6,14,15,44). 我们之前展示过经活性氧处理的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）促进中性粒细胞趋化性，它被EC-SOD的存在所抑制(23). 因为syndecan-1是在IPF和小鼠肺损伤模型中很重要，我们假设氧化性脱落syndecan-1外结构域和HSPG可促进中性粒细胞对肺的趋化性。脱落综合征聚糖、HSPG和对hS1ED进行评估在体外使用改进的Boyden-chamber系统。如所示图4A类,syndecan-1可以从A549细胞中氧化脱落。上清液含有shed-syndecan-1对中性粒细胞具有趋化性(图4C类; 迁移仅ROS指数1.70±0.22与HBSS控制1.00±0.10，第页< 0.001,n个=6）。syndecan-1的敲除细胞表面表达部分抑制ROS诱导的中性粒细胞趋化性(图4C类; 迁移带有ROS的Syn1 siRNA指数1.12±0.07，第页< 0.001与仅ROS 1.70±0.22）。图4D类说明了这一点HSPG不会单独引起趋化性。然而，趋化性是由HSPG暴露于ROS，并通过添加一定量的EC-SOD而受到抑制每口井5、50和100个单元(图。4D类). EC-SOD为HSPG提供了比CuZnSOD缺乏EC-SOD的肝素结合域。趋化诱导HSPG与ROS和5单位或100单位CuZnSOD相比无显著性差异与仅含ROS的HSPG不同。hS1ED（1μg/ml）单独引起趋化性人类中性粒细胞(图。4E类，HBSS 1.0±0.49与hS1ED第4.42页± 0.83,第页< 0.005). 活性氧，H₂O（运行）₂，人类EC-SOD和CuZnSOD单独不诱导趋化性（未显示）。因此，syndecan-1外结构域在肺损伤期间被氧化脱落和修饰对中性粒细胞具有高度趋化性。

脱落的Syndecan-1外结构域和缺乏细胞表面Syndecan-1抑制剂伤口愈合-伤口愈合异常，缺乏上皮再上皮化是被认为与IPF有关的关键特征发病机理(45). 收件人测定shed-syndecan-1对上皮伤口愈合的影响在里面体外用培养的原代小鼠肺泡进行划痕试验上皮细胞和A549细胞。

在受伤的原代肺泡上皮细胞中，添加hS1ED伤口在20h后显著抑制单层细胞的愈合(图5A类，%愈合±S。E.）：单独培养：65.0%±3.7愈合与1μg/ml hS1ED:51.6%±1.7，*，第页< 0.05.暴露于ROS的A549细胞上清液抑制细胞的再上皮化A549单分子膜在创伤后导致细胞粘附大幅度降低20小时后（数据未显示）。受伤时还添加了hS1ED抑制A549单层的愈合（对照92.4%±1.2与hS1ED（500纳克/毫升）73.5%±3.5，第页< 0.01图5，B类和C类). 原电池和A549都显示为圆形，可溶性syndecan-1处理后粘附形态减少（数据不如图所示）。A549细胞中syndecan-1表达被敲除siRNA对人syndecan-1的作用（siRNA处理24小时后80%被击倒，图5D类). 失去syndecan-1表达，转染后24h肺泡上皮伤口愈合减少（阴性对照siRNA 80.1%± 6.6与syndecan-1 siRNA 49.3%±5.7，第页< 0.001,图5，B类和C类). syndecan-1外结构域hS1ED（1μg/ml，创伤后立即）对siRNA处理的细胞没有显著增强受损的伤口愈合反应。

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图5。

hS1ED抑制伤口愈合，而细胞表面综合征-1促进伤口愈合牙槽骨再上皮化。数据以伤口愈合百分比报告（±S.E.），n个=每组6人。A类，鼠标的相位图像暴露于hS1ED的原发性肺泡上皮细胞单层伤口抑制原代细胞伤口愈合超过20小时*，第页< 0.05.B类，暴露于hS1ED的A549单层伤口的相位图像，syndecan-1siRNA或阴性对照siRNA（以伤口百分比表示愈合C类). hS1ED抑制A549上皮伤口愈合超过18h.用30μ米siRNA（siRNA处理为伤口前24小时给予）导致伤口愈合受损和变化细胞形态从扁平鳞状变为圆形，第页< 0.05; **,第页<0.001。没有区别在使用培养基和对照siRNA的基线伤口愈合之间。D类,人syndecan-1在A549细胞中成功敲除30μ米和60μ米syndecan-1 siRNA（siRNA处理24小时后）。*，第页< 0.05.

Syndecan-1外体瘤增加成纤维细胞增殖和TGF-ß1释放-确定hS1ED对成纤维细胞，LL47细胞（肺成纤维细胞系）用1μg/ml hS1ED持续24或48小时，代谢活性细胞检测为描述。hS1ED显著增加肺成纤维细胞的增殖24小时后(图。6A类，第页<0.01，校正吸光度：中等0.50 ± 0.02与hS1ED 0.61±0.04）。此外，hS1ED诱导48小时处理的成纤维细胞释放TGF-ß1增加(图6B类,TGF-ß1（ng/ml）：培养基0.34±0.08与标准偏差0.80± 0.05). 活性TGF-ß1没有明显增加（数据未显示）。其他研究表明，hS1ED不会导致α-光滑法测定成纤维细胞的肌成纤维细胞分化细胞中的肌肉肌动蛋白在治疗48小时后溶解（数据未显示）。

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图6。

Syndecan-1胞外域诱导肺成纤维细胞增殖并诱导释放TGF-ß1。 A类，LL47成纤维细胞用培养基或hS1ED培养24小时，测定增殖情况。已更正490nm处的吸光度与代谢活性物质的数量成正比单元格。*，第页<0.01。B类，成纤维细胞用培养基或hS1ED培养48小时。随后对上清液进行总量分析TGF-ß1（ng/ml）；*，第页< 0.01. 活动中无差异检测TGF-ß1水平。

讨论

先前的研究表明，EC-SOD抑制炎症和几种肺损伤模型中的纤维化。此外，间隙EC-SOD因许多导致肺纤维化的损伤而丧失(15,32). 这种间隙损失EC-SOD可能促进肺损伤后的炎症和纤维化。这个EC-SOD抑制炎症和纤维化的机制并不完善理解。最近的报告表明，EC-SOD通过一种机制调节炎症是通过抑制糖胺聚糖的氧化裂解比如透明质酸和硫酸乙酰肝素(23,29).

Syndecans是有助于中性粒细胞的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖趋化性、ECM调节、细胞因子和生长因子功能，以及细胞粘附(20,25,26,46). 总的来说合成癸烷还没有完全被理解，尤其是当它们脱落到组织细胞外基质中时，其外结构域发生变化(46). 因为能力EC-SOD直接结合硫酸乙酰肝素蛋白多糖并抑制我们假设这些重要基质成分的氧化断裂合成癸烷对氧化修饰的保护是一种机制EC-SOD通过其抑制对肺的炎症和纤维化反应受伤。

本研究表明，syndecan-1外结构域的脱落可能在肺纤维化的发展和进展中发挥作用。更多重要的是，我们的结果提出了一种新的机制，EC-SOD通过该机制通过抑制syndecan-1外结构域保护肺部免受氧化损伤脱落。目前的数据表明syndecan-1有助于中性粒细胞趋化性，调节再上皮化，促进肺纤维化受伤。

目前的研究表明，syndecan-1的脱落增加到石棉和博来霉素损伤后小鼠的BALF(图1). 我们现在已经展示了BALF中syndecan-1的脱落量进一步显著增加EC-SOD KO小鼠对石棉损伤和博莱霉素损伤的反应。这些发现进一步得到了以下因素的支持：IPF患者的BALF(图2).氧化应激导致小鼠纤维化、IPF和其他模型肺部疾病(5,47——49).我们已经证明EC-SOD抑制syndecan-1脱落并减少BALF中性粒细胞内流体内(图。1)并抑制syndecan-1的脱落在体外(图4)，表明氧化应激导致纤维化肺syndecan-1脱落EC-SOD可以抑制这种脱落。

炎症和受损的上皮伤口愈合是关键的病理学涉及肺纤维化动物模型和IPF的过程。这里的研究提出了一种氧化剂诱导的新机制syndecan-1的脱落和hS1ED可直接促进中性粒细胞缺乏细胞因子或趋化因子时的趋化性。中性粒细胞趋化性数据表明，A549细胞氧化性脱落的syndecan-1诱导趋化性，被A549 syndecan-1的敲除部分抑制表达式(图4C类),这表明，虽然其他因素有助于中性粒细胞趋化，shed-syndecan-1外结构域是一种有效的化学吸引剂。我们确认了hS1ED和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的趋化反应。hS1ED是直接趋化(图。4E类)而HSPG在暴露于反应性后具有趋化性氧气种类(图。4D类). 氧化损伤和碳水化合物的去除HSPG的侧链可以暴露syndecan核心蛋白。核心syndecan然后蛋白质能够诱导趋化性。棚中的机制syndecan-1诱导趋化性尚不清楚，但toll样受体-4可能是因为该受体以前被证明与肝素有关硫酸盐介导的中性粒细胞趋化性(23). 与存在一起参与识别革兰氏阴性菌对宿主的入侵，TLR-4可能将可溶性syndecan-1识别为组织损伤的信号。这是第一次syndecan-1外结构域直接诱导小鼠趋化性的研究纤维化肺损伤的背景。

其他纤维化研究报告了特异性在ECM中定位于syndecans以产生的炎症化学因子趋化梯度(22).hS1ED和氧化性片段HSPG也可独立产生梯度吸引并激活中性粒细胞。最近的一项临床研究表明评估IPF患者BAL液中性粒细胞负荷对预后的影响(50). 检测中的增加肺纤维化患者BAL液中的syndecan-1可能提供炎症和纤维化的其他临床相关信息参与IPF发病机制的介质。

伤口愈合研究表明，除了促炎作用外特性，shed-sydecan-1损害肺泡上皮伤口愈合。这些研究表明，细胞表面结合的syndecan-1对损伤后再上皮化，如siRNA抑制syndecan-1表达显著影响愈合(图5). 此外，hS1ED发现在生理浓度syndecan-1下抑制伤口愈合(图5). 表达减少细胞表面syndecan-1导致肺泡功能下降上皮细胞修复受伤区域。文献表明syndecan-1与各种整合素相互作用，介导整合素活化增强细胞粘附(37). 在目前的研究表明，可溶性syndecan-1可能通过以下途径抑制再上皮化与整合素亚基竞争性结合。

根据所描述的数据，我们假设syndecan-1也调节成纤维细胞增殖和功能。Syndecan-1在细胞中起作用对成纤维细胞生长因子的反应性(46)细胞粘附和通过整合素的延伸(37). hS1ED显著增加了人肺成纤维细胞的增殖潜在TGF-ß1的释放(图。6). 这些数据表明，syndecan-1外结构域也可能激活成纤维细胞促进肺纤维化的发展生长和增加关键促纤维化介质的释放，如TGF-ß1。

综上所述，这项研究的结果表明肺使syndecan-1易受氧化应激的影响氧化剂诱导的细胞表面syndecan-1的丢失损害了再上皮化，诱导中性粒细胞趋化，并促进肝纤维化微环境肺。组织匀浆、免疫荧光染色和实时PCR数据表明syndecan-1细胞表面在损伤后肺纤维化，而EC-SOD减少。失去间质EC-SOD对石棉和博莱霉素损伤的反应可能增加基质蛋白和蛋白聚糖（包括syndecan-1）的脆弱性，氧化修饰。肺部发生的这些变化的组合间质syndecan-1和EC-SOD分布可能通过创造持续炎症细胞募集的循环，异常上皮伤口愈合，TGF-ß1生物利用度增加(图7).

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图7。

肺中的氧化应激总结。氧化性损伤肺可导致上皮细胞丢失和syndecan-1脱落。这个脱落可能造成细胞趋化性的破坏性循环，异常上皮再形成和TGF-β生物利用度增加导致肺纤维化。

这项研究为EC-SOD在保护肺对抗氧化损伤及其脱落的潜在机制syndecan-1胞外区可促进肺纤维化的发展。拿总之，这些发现提供了氧化作用的一般机制这些过程会导致肺损伤，并为今后的研究提供动力syndecan-1在其他氧化诱导的肺病理中的作用疾病。

总之，这些研究表明，shed syndecan-1有助于诱导中性粒细胞趋化性导致肺纤维化的发病机制，损害肺泡损伤后的上皮再形成，并促进纤维生成。本研究还强调了EC-SOD在防止氧化剂诱导的syndecan-1在肺部脱落肺纤维化导致EC-SOD的丢失会导致ECM易受氧化应激的影响。这些结果提供了对潜力的洞察针对细胞外氧化变化的治疗途径IPF中的肺基质。

补充材料

致谢

笔记

^*这项工作全部或部分得到了国家研究院露丝·L·路德的健康。Kirschstein国家研究服务奖（1F30ES016483-01，致C.R.K.），研究项目拨款（R01HL063700-07，致T.D.O.），并由NGRI和NHLBI。本文的出版费用已支付部分通过支付页面费用。因此，必须特此声明标记为“广告“根据《美国法典》第18卷。第1734节仅用于说明这一事实。

^S⃞本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图E1–E3。

脚注

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