全反式维甲酸在稳态突触可塑性中的突触信号传递

阻断神经元活动可增加RA合成

活动阻滞诱导的突触缩放是由RA信号介导的，这一有趣的可能性促使我们研究RA合成是否可以以活动依赖的方式进行调节。类视黄醇以视黄酯的形式储存在细胞内，视黄酯在需要时转化为视黄醇。视黄醇随后代谢为RA(Lane and Bailey，2005年). 视网膜脱氢酶（RALDHs）催化直接从视网膜生成RA的氧化(图3A). 在完全分化的海马神经元中检测到高水平的RALDH1 mRNA和蛋白，表明RA可以直接在神经元中合成(图3A和S2系列) (Wagner等人，2002年). 为了检测活动阻断是否会增强神经元中的RA水平，我们采用了一种广泛使用的基于维甲酸反应元件（RARE）的报告系统体内和在体外检测RA(Suzuki等人，2006年;汤普森-哈斯克尔等人，2002年;Wagner等人，1992年). 我们制作了一个报告构建物，包含维甲酸反应元件DR5变体的三个拷贝（直接重复，间隔5 bp）和一个GFP报告基因（3xDR5-RARE-GFP），用于监测培养神经元中RA的产生(图3B). 该检测系统在HEK293细胞中得到验证，在该细胞中，当用3xDR5-RARE-GFP报告子瞬时转染RA直接处理时，GFP显著增加(图S3A和B).

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图3

活动阻断增加神经元中RA的产生

（A） 海马神经元中RALDH1的表达。13个DIV海马神经元对RALDH1（绿色）表现出较强的免疫反应性。神经树突和细胞体用MAP2抗体标记（红色）。比例尺，10µm。（B） 3xDR5-RARE-GFP报告结构示意图。GFP报告子由胸苷激酶（TK）启动子驱动。转录受上游RARE序列调控，该序列由3个DR5-RARE拷贝组成。（C） 不同处理下神经元中3xDR5-RARE-GFP报告基因表达的示例图像。比例尺，10µm。（D） TTX和APV 24小时的活性阻断显著增加了神经元中3xDR5-RARE-GFP报告基因的表达，而未改变对照组GFP的表达（n=10/组；*，p<1×10⁻⁴，单因素方差分析）。TTX治疗24小时并没有增加报告者的表达（n=9，p>0.3）。（E） DEAB以剂量依赖的方式阻止TTX+APV治疗后3xDR5-RARE-GFP报告基因表达的增加（n=10/组；*，p<0.0005；n.s.，p>0.4）。（F） 和（G）长时间的神经元活动阻断（>8小时）显著增加了转染3xDR5-RARE-GFP报告基因的共镀HEK293细胞中GFP的表达水平，而不影响对照组的GFP表达（n=15/组，*，p<0.01）。比例尺，10µm。所有统计分析均采用单因素方差分析。误差条代表SEM。

我们用3xDR5-RARE-GFP转染13 DIV的神经元，6小时后检测GFP荧光强度。与未经治疗的情况相比，TTX和APV治疗24小时显著增加了GFP报告基因的表达，而缺乏RARE调节序列的对照GFP构建物的表达没有变化(图3C和D). 有趣的是，用TTX单独阻断神经元活动24小时，这是一种机制上不同形式的突触缩放协议(Sutton等人，2006年)，GFP报告基因表达没有显著增加(图3C和D).

为了进一步验证GFP报告基因表达增加反映了神经元RA的合成，我们检测了RA合成阻滞剂DEAB对报告基因表达的影响。DEAB与TTX和APV一起加入神经元，以剂量依赖的方式减少GFP报告信号(图3C和E). 浓度为10µM时，可阻止TTX+APV诱导的突触缩放(图2B)，DEAB完全阻断了RA的合成，如报告人表达缺乏显著增加所示(图3E). 值得注意的是，即使DEAB浓度最高（100µM），也可能完全阻断RA合成，GFP报告基因的表达水平与模拟处理神经元中的表达水平相当，这表明在基础条件下（无活动阻断），神经元中的环境RA水平非常低。

为了排除观察到的GFP报告基因表达增加是由作用于报告基因的神经元一般转录和/或翻译活动中的活动依赖性变化引起的可能性，为了直接测试RA是否可以作为作用于邻近细胞的扩散信号（即以细胞非自主方式发挥作用），我们使用转染3xDR5-RARE-GFP报告子的HEK293细胞重复了RA检测实验。转染一小时后，HEK293细胞与神经元共培养。与模拟治疗组相比，早在TTX和APV治疗开始后8小时，HEK293细胞中的GFP表达就显著增加，并且这种差异在活性阻断开始后24小时保持不变(图3F和G). 直接用TTX+APV处理HEK293细胞24小时，并不影响3xDR5-RARE-GFP报告基因的表达(图S4A). 此外，缺乏RARE序列的对照GFP结构在这些条件下没有表现出表达差异(图3G). 虽然直接贴在神经元上的HEK293细胞能够检测到TTX和APV处理的神经元中RA水平的增加，但从TTX和AP处理24小时的神经元培养物中收集的条件培养液并没有增加HEK299细胞中3xDR5-RARE-GFP报告基因的表达(图S4B). 条件培养基中缺乏游离RA可能是由于其亲脂性和不稳定性。

综上所述，这些结果表明，TTX和APV治疗阻断神经元活动会显著增加神经元中的RA水平，RA在这些神经元和周围细胞中发挥局部作用。

RA促进含有GluR1的AMPA受体的表面表达

RA治疗后mEPSC振幅选择性增加，但频率没有增加，RA对脊椎密度没有影响，这表明RA在突触后起作用，以增强现有突触的突触强度。为了研究RA是否通过增加突触后AMPA受体功能来增加突触传递，我们对用DMSO（载体）或1µM RA处理的神经元的细胞表面进行染色，以检测表面表达的GluR1和GluR2 AMPA受体亚单位(图4A). 事实上，RA显著增加了GluR1的表面水平，但没有增加GluR2的表面水平(图4B).

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图4

RA增加同源GluR1受体的表面传递

（A） DMSO或RA治疗30分钟后，神经元中GluR1和GluR2的表面染色。药物洗脱后一小时进行染色。比例尺，10µm。（B） RA治疗增加了表面GluR1水平，而不影响GluR2水平（n=10个神经元/组；*，p<0.0005）。（C） DMSO或RA处理30分钟后，或TTX+APV处理24小时后，原代培养神经元中表面GluR1的生物素化。（D） RA治疗和活性阻断均增加了表面GluR1的表达，但在24小时TTX和APV治疗后，RA未观察到额外的增加（n=3；*，p<0.01）。（E） 在分离的海马培养物中，（F）RA诱导的突触传递增加被Phanthotoxin-433（PhTx，5µM）完全阻断（n=8；*，p<0.05）。记录前10分钟，在浴缸中涂抹了PhTx。E中的比例尺：20 pA，20 ms。（G）RA诱导的培养切片神经元mEPSC振幅增加也对PhTx治疗敏感（n=10；*，p<0.01）。所有统计分析均采用单因素方差分析。误差条代表SEM。

我们还通过表面蛋白生物素化检测了表面GluR1的表达水平。RA或TTX+APV单独治疗显著增加了表面GluR1水平(图4C和D). 然而，同时应用这两种治疗并没有产生额外的增强效果(图4C和D)，这与我们的电生理学结果一致，表明活动阻断诱导的突触标度阻断了RA诱导的突触体传递增加(图2C和D).

RA对GluR1表面表达的选择性增加表明在RA诱导的突触缩放过程中插入了同源的GluR1受体。活性阻断诱导的突触缩放由同源GluR1受体介导，并可被Phanthotoxin-433（PhTx）阻断，PhTx是缺乏GluR2亚单位的同源AMPA受体的阻断剂(Ju等人，2004年;Shepherd等人，2006年;Sutton等人，2006年;Thiagarajan等人，2005年). 事实上，RA诱导的mEPSC振幅的增加通过在分离培养物中浴敷5µM PhTx而逆转(图4E和F)在海马切片培养中(图4G)表明RA诱导的同源GluR1受体的突触插入是观察到的缩放效应的原因。相反，基础突触传递不受PhTx的影响(图S5)这与支持基础突触传递的AMPA受体是含GluR2的异聚受体的概念一致。

RA诱导树突中GluR1的转录依赖性局部翻译

活动阻滞诱导的，尤其是TTX和APV诱导的突触缩放需要树突状蛋白翻译(Ju等人，2004年;Sutton等人，2006年;Sutton等人，2004年). GluR1 mRNA存在于神经元树突中，并被认为是局部翻译的(Grooms等人，2006年;Miyashiro等人，1994年;Poon等人，2006年). 为了测试RA是否诱导突触后GluR1增加，我们研究了RA诱导的突触缩放是否依赖于基因转录或翻译。蛋白质合成抑制剂茴香霉素（40µM）在两种海马薄片培养物中阻断了RA诱导的mEPSC振幅增加(图5A)和分离的文化(图5B). 此外，茴香霉素或环己酰亚胺（100µM；参见图5C). 相反，转录抑制剂放线菌素D（50µM）未能阻断RA对mEPSC振幅或表面GluR1表达的影响(图5A、B和C). 因此，RA通过一种新的翻译依赖但转录依赖机制调节突触传递。

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图5

RA诱导的突触缩放与转录无关

（A） （B）RA-诱导的突触缩放被蛋白合成抑制剂茴香霉素阻断，而在切片培养（A）和分离培养（B）的海马锥体神经元中，转录抑制剂放线菌素D未阻断（n=10/组；*，p<0.005）。在RA治疗前30分钟开始药物治疗，并与RA一起清洗。（C） RA治疗可选择性增加神经元表面GluR1水平，而GluR2水平保持不变。GluR1表面表达的增加被放线菌酮或茴香霉素阻断，但不被放线霉素D阻断（n=5；*，p<0.01）。

结合就地杂交和免疫细胞化学，我们发现GluR1 mRNA存在于神经元树突中(图6A)，与以前的报告一致(Grooms等人，2006年). 接下来，我们检测了从3-4周龄大鼠海马分离的突触神经体中RA诱导的GluR1的局部翻译。突触神经元体制剂富含GluR1、PSD-95等突触蛋白，不含组蛋白H3等核蛋白(图6B). 用1或10对突触神经小体进行短暂治疗，未能在37°C下阻断RA M RA的作用10分钟，特别是增加了GluR1蛋白水平(图6C)而不是其他突触蛋白，如GluR2和PSD-95(图6D). 与我们从培养神经元获得的结果和局部蛋白翻译的特点一致，RA诱导的突触神经体GluR1合成增加被蛋白合成抑制剂茴香霉素和放线菌酮阻断，但不受转录抑制剂放线菌素D的影响(图6E). 综上所述，这些结果表明RA在神经元树突中以转录依赖的方式激活GluR1蛋白的局部翻译。

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图6

RA诱导GluR1蛋白的局部翻译

（A） 在神经元树突和胶质细胞中检测到GluR1 mRNA。针对GluR1 mRNA（红色）的反义或正义探针用于荧光就地杂交。用MAP2抗体（蓝色）标记神经元胞体和树突。比例尺，10µm。（B） 相对于全细胞裂解物，GluR1和PSD-95在海马突触体部分富集，组蛋白H3选择性缺失。（C） 10分钟RA治疗（0.1、1或10µM）可诱导突触神经小体中GluR1的合成（n=4；*，p<0.005）。（D） RA治疗未改变GluR2、PSD-95和RARα的表达（n=4，p>0.5）。（E） 放线菌酮和茴香霉素阻止了RA诱导的突触体GluR1合成，但放线菌素D没有阻止（n=4；*，p<0.0005）。（F） 海马切片的MAP2（绿色）和RARα（红色）免疫荧光染色；上部面板的比例尺为200µm；下部面板为20µm）。

抗体

本研究中使用了以下小鼠单克隆一级抗体：肌动蛋白（Chemicon，Temecula，CA）、FMRP（Chemicons）、GluR2（Chemicon2）、MAP2（Abcam）、PSD95（亲和生物试剂，Golden，CO）、Flag（Sigma）。使用了以下兔多克隆一级抗体：GFP（Abcam）、RALDH1（Abcam）、GluR1（癌基因Calbiochem，加利福尼亚州圣地亚哥）、Glu R1（Upstate，弗吉尼亚州夏洛茨维尔）、GluR2（Chemicon）、组蛋白、H3 CT（Upstate）、RARα（Santa Cruz Biotechnologies，加利福尼亚州圣克鲁斯）。使用了Jackson ImmunoResearch（宾夕法尼亚州西格罗夫）的以下二级抗体：抗小鼠Cy2、抗兔Cy2，抗小鼠Cy3和抗兔Cy3。

药物和化学品

从Sigma Aldrich购买了以下药物和化学品：全反式维甲酸、philanthotoxin-433、茴香霉素、放线菌素D、环己酰亚胺和苦曲霉毒素。河豚毒素购自Tocris Biosciences（密苏里州埃利斯维尔），D-APV购自Fisher。AM580来自Biomol International，LP（宾夕法尼亚州普利茅斯会议）。

细胞培养、转染、药物治疗和免疫标记

在胚胎第22天从大鼠大脑中制备初级海马培养物，并在补充有B-27和谷氨酰胺（Gibco-Brl，Grand Island，NY）的无血清神经基础培养基中培养两周在体外(Nam和Chen，2005年). 从7–8天大鼠幼崽中制备海马切片培养物(Schnell等人，2002年)并在补充有马血清（Hyclone、Logan、UT）、胰岛素（Sigma）和谷氨酰胺的Neurobasal-A培养基中保存。人类胚胎肾（HEK）-293细胞在添加10%胎牛血清（Gibco-Brl）的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）中培养。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA）按照之前描述的方案转染神经元(Nam和Chen，2005年). 根据制造商的说明，使用HEKfectin（BioRad，Hercules，CA）转染HEK293细胞。DMSO中全反式RA的储备溶液在处理前新鲜制备，DMSO在培养基中的最终浓度为0.05%或更低。用1µM TTX和100µM APV的24小时处理诱导分离培养物中的突触标度，用10µM TTX和1 mM APV 36小时处理诱导切片培养物中突触标化。在用2%多聚甲醛（15分钟，室温）固定并用含有0.3%Triton X100的PBS洗涤的培养物上进行免疫细胞化学，然后与一级和二级抗体孵育。

RA合成抑制剂处理

在DMSO中制备5mM柠檬醛（Sigma-Aldrich）储备溶液。在电生理记录之前，用5µM柠檬醛、TTX和APV处理神经元24小时。在DMSO中制备1M 4-二乙基氨基-苯甲醛（DEAB；Sigma-Aldrich）的储备溶液。连续稀释产生浓度为100mM、10mM、1mM、0.1mM和0.01mM的DEAB储备。神经元在活动阻滞开始时接受每种浓度的DEAB治疗（1:1000），并持续24小时。

慢病毒shRNA转移载体与慢病毒生产

使用以下引物从pBS-U6中扩增出人类U6（希望之城John Rossi博士）：U6 BamHI F，5'-ataagaatgggcccgggatcagggg-3'和U6 RARαshRNA XbaI R，5'-gctctagaaaaaagacaactgcatcatcatctctgatgatgcagtttgtgtgtctctctcccatccaca-3'，并克隆到pBS（Stratagene）中。然后将U6-RARαshRNA产物亚克隆到HIV U6 GFP-fill CMV-Neo（HU6G-fill CN）（加州大学伯克利分校David Schaffer博士的慷慨捐赠）中，以生成HU6RARαCN。人类突触蛋白（hSYN）-EGFP盒取代CMV-Neo盒，形成HU6RAα-SG。

慢病毒的产生如所述（34）。简单地说，使用磷酸钙法将人胚胎肾293T细胞与转移载体和三种辅助质粒pRSV-REV、pIVS-球状口腔炎G蛋白（VSVg）和pMDL-gag/pol以22.5、14.7、8和5.7µG DNA/15cm板进行转染。48小时后，将八个平板的上清液混合，以2000 rpm转速旋转5分钟，通过0.45µm过滤器，以25000 rpm转速通过蔗糖垫旋转1.5小时，将小球混合并以24800 rpm转速旋转1.5小时后再悬浮在100µl PBS中。

电生理学

在室温下对14–15个DIV培养的神经元进行全细胞斑贴灯记录，其中4–6 MΩ；斑贴吸管内充满含有（mM）120 CsCl，2 MgCl的内溶液₂、5 EGTA、10 HEPES、0.3 Na_三-GTP，4钠₂-ATP，pH 7.35。用外部溶液（mM，100 NaCl，26 NaHCO_三，2.5 KCl，11葡萄糖，2.5 CaCl₂，1.3硫酸镁₄，1.0 NaH₂人事军官₄). 在室温下，用4–6 MΩ的贴片吸液管填充含有（mM）140 CsCl，2 MgCl的内部溶液，从6–8 DIV切片中进行切片培养的贴片灯记录₂、5 EGTA、10 HEPES、0.3 Na_三-GTP，4钠₂-ATP，pH 7.35。连续将切片与外部溶液混合（mM，120 NaCl，26 NaHCO_三，2.5 KCl，11葡萄糖，2.5 CaCl₂，1.3硫酸镁₄，1.0 NaH₂人事军官₄). 对于mEPSC记录，河豚毒素（1µM）和苦毒毒素（100µM。将细胞保持在-60 mV的电压下。对于PhTx记录，在记录之前，将5µM PhTx或溶媒对照液浸泡10分钟。使用Synaptosoft的微型分析程序分析微型反应。

AMPA受体表面免疫细胞化学标记

在AMPA受体表面标记之前，用1µM RA或1µM TTX和100µM APV处理培养的海马神经元（14–15 DIV）。用含有1 mM CaCl的PBS清洗培养物₂和0.5mM氯化镁₂（PBS/Ca²⁺/镁²⁺)含4%蔗糖。将神经元与GluR1或GluR2的一级抗体在37°C下预孵育10分钟，以标记表面AMPA受体，并在冰镇PBS/Ca中清洗²⁺/镁²⁺用4%PFA+4%蔗糖固定后，用无洗涤剂封闭溶液（PBS加2%正常山羊血清，0.02%叠氮化钠）封闭细胞1小时，然后在室温下二次抗体培养1小时。

表面生物素化测定

用冷PBS/Mg清洗培养的海马细胞四次²⁺/钙²⁺，并且在冰冷的PBS/Ca中用1mg/ml的Ez-link磺基NHS SS生物素（Pierce，Madison，WI）对表面蛋白进行生物素化²⁺/镁²⁺在4°C下保持20分钟。用0.1 M甘氨酸在冰冷的PBS/Ca中清洗细胞²⁺/镁²⁺阻止表面蛋白质的进一步生物素化。用冷PBS再清洗四次后，用离心法收集细胞。用裂解缓冲液溶解生物素化细胞（PBS与1%triton-X、1%NP-40、10%甘油、25 mM MgCl₂和蛋白酶抑制剂鸡尾酒）。将裂解液离心，以14000 rpm的速度去除细胞碎片和细胞核30分钟。将预清理的裂解液在4°C的温度下结合过夜，使用Ultralink-immoclized链霉亲和素珠沉淀生物素化蛋白。通过1000 rpm离心3 min去除非生物素化蛋白，并用裂解缓冲液洗涤珠子三次。生物素化表面蛋白在75°C下用变性缓冲液洗脱。Western blot分析检测表面表达的AMPA受体。

siRNA效率

转染前20小时，5×10⁵每个孔的HEK293细胞接种在6孔板（BD）中。为了证实RNAi的疗效，将siRNA构建物与适当的靶构建物以3:1的比例联合转染。转染后24小时，细胞在2×10浓度的裂解缓冲液（50 mM Tris[pH7.5]，150 mM NaCl，5 mM EDTA，1%Triton X-100，10µg/ml抑肽酶，1 mM PMSF）中裂解⁴细胞/微升。然后将裂解产物通过25 1/2 G的针，并在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上运行。将蛋白质转移到Immobilon-P PVDF膜（Millipore）中，在TBST（0.2%）中与5%非脂肪乳孵育1小时，并按照标准方案进行免疫印迹。检测采用HRP二次检测，然后采用增强化学发光法（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州）。

KCl诱导的局部翻译

在KCl治疗前，用pSUPER或RARαsiRNA转染神经元四天。简单地说，将玻璃盖玻片上的神经元浸入高钾溶液中一次⁺溶液（12.5 mM NaCl、90 mM KCl、2.6 mM MgSO₄，1 mM NaH2PO₄，26.2 mM NaHCO_三，11 mM葡萄糖，10µM甘氨酸，2.5 mM CaCl₂)在2.5 mM KCl NaHCO中持续1s，然后持续10s_三-缓冲溶液。在室温下重复三次，然后让神经元在37°C下恢复10分钟。培养10分钟后，立即固定神经元进行免疫细胞化学。

切片免疫细胞化学

将海马薄片（400-µm厚）固定在4%多聚甲醛中1小时，用PBS冲洗三次，然后用0.5%Triton-X100渗透1小时，然后用PBS再次冲洗三次。然后用50 mM NH处理切片₄室温下氯化20分钟，用PBS冲洗三次，并在10%的正常山羊血清中封闭1小时。随后在4°C下用RARα和MAP2抗体孵育切片18小时，然后在PBS中洗涤三次一小时。然后在4°C下应用Cy2-共轭山羊抗鼠和Cy3-共轭山羊抗兔二级抗体18小时，然后进行5次1小时PBS洗涤。

图像采集和量化

为了进行荧光图像分析，从三个或更多独立批次的培养物中随机选择细胞，每批培养物有四个或更多盖玻片。使用Olympus FV1000 BX61WI激光扫描共聚焦显微镜在室温下采集荧光图像，使用Olympus Plan Apochromat 60x油物镜（N.A.1.42，WD 0.15）或Olympus U-Plan Apochromat 100X油物镜（N.A.1.40，WD 0.12），顺序采集设置为1024×1024像素分辨率。设置激光功率和光电倍增管，以确保不同通道之间不会发生可检测到的漏泄。用FV1000成像软件（奥林巴斯）采集细胞的数字图像。从标本的顶部到底部取了八到十个截面，并做出了最亮的点投影。使用相同的激光功率、光电倍增管增益和偏移设置拍摄相同实验的图像。选择这些设置时，最亮样本的像素强度刚好低于饱和度，但当必须清楚确定细胞轮廓或神经元过程轮廓时，来自特定区域（HEK细胞体中心或神经元胞体）的信号除外以获得细胞体或神经元树突的清晰周长。免疫染色蛋白的荧光信号的量化如所述(Nam和Chen，2005年). 简单地说，使用相同共焦设置收集的图像按强度进行相同的阈值分割，以排除扩散/细胞内池，点状物通过计算0.25至4µm之间的超阈值区域数量进行量化²。对每个条件下至少15张图像的结果进行平均，并计算平均值和标准误差。图像定量由经验丰富的研究人员进行，他们对实验条件“视而不见”。

突触体制备

对P15–P21 Sprague-Dawley大鼠海马进行解剖，并在含有33%蔗糖、10 mM HEPES、0.5 mM EGTA、pH 7.4和蛋白酶抑制剂的溶液中轻轻均质。将核和其他碎片在4°C下以2000 g的浓度造粒5分钟，上清液通过3层100µm孔径的尼龙网（Millipore，Bedford，MA）和5µm孔的PVDF注射器过滤器（Millipose，Bedfort，MA）过滤。然后将滤液在4°C下10000g离心10分钟，并去除上清液。然后，将含有突触神经体的颗粒重新悬浮在含有蛋白酶和RNAsin（Amersham，Piscataway，NJ）的适量最低必需培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。然后将等体积的液体注入不透明的微量离心管中。使用50µM放线菌素D（西格玛，圣路易斯，密苏里州）、100µM环己酰亚胺（西格马，圣路易斯，MO）或40µM茴香霉素（西格玛圣路易斯州）在37°C下预处理适当样品30分钟。将适当浓度（100 nM、1 uM或10 uM）的维甲酸（西格玛，圣路易斯，密苏里州）或AM580添加到样品中，在37°C下培养10分钟，然后立即冷冻在干冰中。

原位杂交

14个DIV海马神经元用4%多聚甲醛固定，用0.5%Triton X-100渗透5分钟，在含有0.1%活性DEPC的DEPC PBS中孵育15分钟。然后在54°C下，用Rapid-Hyb缓冲液（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ）在含有0.1%封闭试剂的50%甲酰胺（Roche，Indianapolis，in）中预混合细胞。杂交在54°C下进行，并在50°C下在含有50%甲酰胺的1x SSC中洗涤。细胞与HRP-连接的DIG抗体和兔多克隆MAP2抗体在室温下共同孵育1小时，然后使用Cy3-TSA试剂盒（马萨诸塞州韦尔斯利佩金-埃尔默）进行酪胺信号放大处理。用Cy5-偶联山羊抗鼠抗体检测MAP2。从PCR产物T3和T7 RNA聚合酶位点适配器转录双加氧素标记的GluR1核糖探针。使用的正向引物为5’T3-CAATCACAGGAACATGCGGC 3’和反向引物5’T7-TCTCTGGCTGTATCCAAG 3’。

我们感谢Peng Jin博士（埃默里大学）提供FLAG-FMRP cDNA，Anthony Lamantia博士（北卡罗来纳大学）提供RARE-TK载体，David Schaffer博士（加州大学伯克利分校）和John Rossi博士（希望之城）提供慢病毒载体。我们感谢Marta Soden为切片培养准备工作提供的帮助，Sandhiya Kalyanasundaram为我们提供的技术支持，以及Chen实验室成员对原稿的讨论和评论。这项工作得到了梅布尔和阿诺德·贝克曼基金会、大卫和露西尔·帕卡德基金会、W·M·凯克基金会和NIMH（L.C.）的支持。