肝细胞生长因子（HGF，也称分散因子，SF）是一种多效性生长因子，最初被确定为肝切除大鼠血浆中上升的肝细胞有丝分裂原。1–4HGF/c-Met通路是部分肝切除术（PHx）后最早激活的信号通路之一。5血浆中的HGF蛋白水平在1小时内增加了20倍以上，1然后在三分之二PHx后3-6小时HGF mRNA显著增加。6HGF的快速升高及其与受体c-Met的结合发生在PHx后30分钟内，是肝再生过程中肝细胞增殖的早期信号。c-Met和HGF在肝脏发育中的重要性之前已通过c-Met及HGF基因敲除小鼠得到证实。消除HGF/Met会导致致命的胚胎表型。7–9两个实验室的研究发现，c-met在肝脏中被明确清除。10,11两项研究均表明，肝靶向清除c-Met可阻止三分之二PHx后的再生反应。c-Met对再生的完成至关重要，其清除阻断了肝细胞S期早期的过程。然而，当评估再生能力时，这两项研究中的小鼠的肝脏都发生了显著的组织病理学改变，从而使结果的解释变得复杂。12
siRNA被用来敲除基因在体外 13和体内 14通过转染合成的21到23核苷酸SiRNA，通过RNA聚合酶III或RNA聚合酶酶II启动子以质粒为基础表达短发夹RNA（ShRNA），15和病毒载体。16鉴于体内关于合成RNA的稳定性、免疫应答的诱导以及病毒载体的相关毒性，我们决定使用与非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI）复合的ShRNA质粒来传递ShRNA体内在非病毒载体中，PEI已被证明是一种有效的肝细胞非病毒基因转移载体体内文化方面。17PEI起质子陷阱的作用，保护复合DNA不被降解，从而提高转染效率体内和在体外.18
因此，我们决定使用RNA干扰来沉默HGF和c-Met体内在正常动物（大鼠）中，在没有肝脏病理改变的情况下，检查其清除对肝脏再生的影响。我们通过使用靶向c-Met和HGF的ShRNA直接抑制这些基因，探讨了HGF及其受体c-Met在大鼠肝再生中的作用体内我们提出的证据表明，通过RNA干扰沉默HGF和c-Met在RNA和蛋白质水平上对HGF和Met都有很强的干扰作用。HGF的干扰对肝细胞的增殖动力学有可测量但中等的影响。然而，对Met的干扰在PHx后24小时消除了所有有丝分裂，减少了BrdU的掺入，并增加了细胞凋亡。微阵列分析还表明，Met的抑制导致许多细胞周期和凋亡相关基因的表达发生深刻变化。
结果
载体在肝脏中的细胞分布
采用的ShRNA载体编码了水母GFP的一种红移变体。我们使用含有靶向HGF（由星状细胞表达）的ShRNA的质粒来研究注射后质粒的细胞分布。在冰冻切片或石蜡切片上，星状细胞和内皮细胞很难通过免疫组织化学方法进行评估。为了更好地识别与质粒摄取有关的细胞类型，我们使用了经ShRNA处理的肝脏细胞的混合原代培养物。在第二次注射ShRNA后4小时分离细胞，并培养12小时。培养物中含有肝细胞和足够数量的污染星状细胞、内皮细胞和枯否细胞。如所示大多数肝细胞GFP免疫荧光染色阳性。星状细胞的结蛋白（红色）和GFP（绿色）也呈阳性染色，根据发色团的接近程度产生局部黄色。90%以上的肝细胞和大约60%的星状细胞GFP染色阳性。然而，我们无法检测到大量GFP阳性内皮细胞（由CD31识别，数据未显示）。
通过GFP和结蛋白荧光检测大鼠肝组织中ShRNA的细胞定位。（A） 表达GPF的肝细胞呈绿色（箭头所示）；表达结蛋白的星形细胞呈红色。（B）表达GFP质粒的星形细胞的高倍放大。GFP和结蛋白在星状细胞细胞质的某些区域结球化导致黄色（箭头所示）。
ShRNA对HGF和c-Met mRNA的抑制作用
我们通过注射HGF和c-Met各自的沉默结构来研究其mRNA的抑制。在PHx发生前24小时和发生时，通过肠系膜上静脉注射质粒。绝对定量RT-PCR用于通过使用在体外合成cRNA标准（参见材料和方法中的部分补充文本). 如中所示首次注射后24小时（相当于PHx的时间），ShHGF治疗组大鼠的HGF mRNA比正常对照组减少1.5倍。第一次注射后48小时（第二次注射后24小时），HGF mRNA表达受到2.6倍的抑制。然而，到第3天，HGFmRNA表达几乎与未经处理的对照组相同。错配和打乱处理对HGF mRNA没有影响。
实时PCR分析注射了ShHGF和ShMet载体混合物的再生大鼠肝脏中HGF与c-Met的表达（n=3）。通过绝对定量法测定经ShRNA治疗的大鼠和对照组的HGF和c-Met mRNA水平。（A） HGF mRNA显著抑制(P（P）<0.005）PHx后24小时，与不匹配和干扰注入控制相比。PHx后48小时，水平恢复到正常水平。（B） ShMet治疗导致c-Met mRNA显著抑制(P（P）<0.005），在PHx后维持72小时。打乱和错配RNA的注射对c-Met mRNA的表达没有影响。
ShMet治疗也抑制c-Met mRNA(). 第一次注射24小时后，与未经治疗的正常对照组相比，c-Met mRNA减少了1.6倍。首次注射后48小时（PHx后24小时），c-Met mRNA减少了6.2倍。首次注射后72小时，c-MetmRNA明显减少了3倍。注射打乱或错配的ShRNA不会影响c-Met mRNA的表达。
HGF和Met蛋白质的变化
结果如所示在最后一次注射ShHGF RNA 24小时和48小时后，HGF蛋白显著下降。Met蛋白的整体表达出现中度下降（数据未显示），可能反映出已知高度表达Met的内皮细胞没有明显占据ShRNA质粒。然而，当我们检测PHx后24小时内酪氨酸磷酸化Met的表达时，发现了相关变化。由于在PHx后的前24小时内，Met通过酪氨酸磷酸化激活主要发生在增殖细胞（肝细胞，它确实占据了ShRNA质粒）中，因此在PHx之后的前24 h内，Tyr-磷酸化Met的变化往往反映肝细胞中的ShRNA。结果如所示在PHx时（第一次注射ShMet后的时间0，24小时）和PHx后的6小时内，Tyr-磷酸化Met的含量均显著降低。这一点非常重要，因为Met的Tyr磷酸化主要发生在PHx后的前30–60分钟。116小时后，酪氨酸磷酸化蛋氨酸逐渐增加，24小时后反弹增加（与PHx后48小时ShMet处理动物肝细胞增殖显著增加相关，稍后讨论）。
（A） 注射ShFGF RNA导致HGF蛋白减少。HGF蛋白质在全肝匀浆的Western blot中进行测定。29（B） PHx后24小时内酪氨酸磷酸化Met蛋白的水平。使用用Met抗体（SP260）免疫沉淀的全细胞裂解物中的蛋白质进行蛋白质印迹。用抗磷酸酪氨酸抗体检测斑点以检测酪氨酸磷酸化蛋氨酸。首次注射后24小时，酪氨酸磷酸化Met显著抑制（PHx时间，P（P）<0.005），并在PHx后1小时观察到。
ShHGF对PHx后增殖动力学的影响
ShHGF治疗对肝细胞增殖指数的影响如图所示HGF的降低对增殖指数（包括PCNA和BrdU标记指数以及肝细胞有丝分裂指数）有中度但可测量的影响。增殖指数的下降幅度为10%至30%。
（A） ShHGF和惊扰ShRNA-处理大鼠肝细胞核的PCNA标记和（B）BrdU标记。ShHGF治疗导致PHx后48小时BrdU掺入显著抑制(P（P）<0.005）。（C） 用有丝分裂指数（每5200×视场标记细胞数）评估肝细胞有丝分裂的进展。ShHGF治疗组大鼠的有丝分裂指数与干扰的ShRNA-治疗对照组相比受到轻微抑制。
ShMet对PHx后增殖动力学的影响
ShMet治疗对肝细胞增殖指数的影响如所示所有天肝细胞的PCNA标记指数都有中度下降。PHx后24小时对BrdU核标记指数的影响更为显著（ShRNA:4%；打乱RNA：80%）。经ShRNA-处理的动物48小时后的BrdU标记指数恢复到经干扰RNA处理的动物。经ShMet处理的PHx后24小时，肝细胞有丝分裂受到完全抑制（ShMet，0个细胞；干扰RNA，每10 200×光场92个有丝分裂）。然而，经ShMet处理的动物在PHx后48小时和72小时的有丝分裂率超过了经加扰RNA处理的动物的有丝分裂率（48小时后每10 200×视野的有丝分裂率：加扰RNA，78；ShMet RNA，166；72小时后：加扰RNA，75；ShMet RNA，160）。
（A） ShMet和搅乱处理大鼠肝细胞的PCNA标记。在PHx后120小时，肝细胞的PCNA标记指数与打乱处理的动物相比明显中度下降。（B） 肝细胞核的BrdU标记。ShMet治疗显著抑制BrdU的掺入(P（P）<0.005），与PHx后24小时的对照组相比。到第2天，ShMet的水平与打乱的ShRNA对照的水平相当。（C） 用有丝分裂指数评估肝细胞通过有丝分裂的进展。PHx后1天，ShMet处理的大鼠未发现有丝分裂。然而，在PHx后48和72小时，经ShMet处理的大鼠的有丝分裂率超过了经打乱的ShRNA处理的大白鼠。
ShMet治疗后Caspase 3活性增加
正如《补充》中所提到的，在使用ShMet治疗的动物中，许多凋亡相关基因上调。(补充表1). 因此，我们通过Western blot分析研究了caspase 3活性形式的变化。如中所示与正常和干扰RNA处理大鼠相比，经ShMet处理的大鼠caspase 3（p11亚单位）的活性形式增加。首次注射后20小时，与正常PHx治疗大鼠相比，活性形式的表达上调了1.6倍。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的表达在PHx后12小时保持较高水平。
（A） PHx后24小时内活性caspase-3蛋白的变化。使用全细胞裂解物进行蛋白质印迹。用抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体（H-277）对斑点进行检测，以检测活性半胱氨酸蛋白酶-3。将带密度标准化为来自Ponceau染色的Western blot总蛋白。每个数据点代表每个时间点3只大鼠的池。与未经处理和干扰的RNA-处理大鼠相比，在经ShMet处理的大鼠中观察到caspase 3活性形式的p11亚单位上调。PHx后24小时组织切片的（B，C）TUNEL分析。与对照组大鼠相比，ShMet RNA处理组大鼠（B）中的ShMet DNA含量增加。然而，在任何动物中，凋亡肝细胞的百分比从未超过总数的0.5%。
TUNEL分析
鉴于caspase 3活性形式的增加，我们进行了TUNEL分析，通过就地使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）标记基因组DNA，如材料和方法附录的第节。如中所示PHx后24小时，在ShMet治疗组的肝脏中，TUNEL阳性细胞略有增加（平均增加2.5倍），而在仓促治疗组和正常大鼠的肝脏中则很少出现凋亡细胞核，如然而，在任何时候，凋亡的TUNEL阳性肝细胞的百分比都很低，不超过肝细胞总数的0.5%。caspase 3和凋亡数据还表明，注射ShMet直接导致caspase 2的诱导，这不是PEI或所用载体的某些副作用的结果，由于活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶形式上调，TUNEL阳性细胞数量增加，因此在干扰RNA处理的大鼠中未观察到。
微阵列数据分析
基因芯片分析大鼠PHx后第1天服用ShMet后的整体基因表达(补充表1)表明许多参与细胞周期和生长停滞的基因调控异常，包括p21和p53，而胰岛素样生长因子结合蛋白1和CE/BP公司-β被下调。考虑到经ShMet处理的动物在PHx后24小时内BrdU掺入受到显著抑制且无有丝分裂，细胞周期蛋白E1的表达（与细胞生长相关1到S相19)细胞周期蛋白B的表达（与有丝分裂的完成有关20)显著增加。同样有趣的是，在接受ShMet RNA的肝脏中TGF-β受体II的表达高出27倍
ShRNA治疗后无靶向效应和干扰素反应
使用ShRNA的一个主要问题是可能会意外沉默无关基因并诱导干扰素反应。21,22我们使用U95 Affymetrix寡核苷酸阵列分析和比较了经ShRNA治疗的大鼠与未经治疗、假手术和经ShRNA-加扰RNA处理的大鼠PHx后24小时的全局基因表达模式。肝切除后的肝脏和接受ShRNA治疗的肝脏之间的全球基因表达模式没有可检测的差异。干扰素调节基因的表达也没有可检测到的变化（有关详细信息，请参阅补充图1和2).
讨论
PHx后的肝再生是一个极其复杂的过程，需要许多生长因子和细胞因子的相互作用和合作，以及多个途径之间的串扰。在与肝再生有关的各种试剂中，HGF和EGF受体配体是唯一能够刺激在化学定义的培养基中培养的肝细胞DNA合成的试剂。23它们也是唯一能刺激正常小鼠和大鼠肝脏DNA合成的药物。24–28如前所述，HGFor受体c-Met的纯合缺失会导致胚胎死亡。7,9因此，不可能在这种转基因小鼠中研究肝脏再生。最近有2项研究表明c-Met缺失仅针对肝脏。10,11这种情况导致了显著的组织病理学变化。因此，这些小鼠70%的肝切除与高死亡率相关，而30%的肝切除可耐受。这两项研究都得出结论，c-Met为肝脏再生提供了必要的信号，而不是通过EGFR或其他信号细胞因子受体进行补偿。然而，由于肝细胞Met的长期缺失导致显著的肝组织病理学改变，包括脂肪肝和纤维化，这些研究的解释变得复杂。因此，无法确定对肝再生的影响是由于Met本身的缺失所致，还是与Met缺失相关的组织病理学间接相关。
本研究的目的是通过在正常大鼠中部分或完全消除HGF或c-Met，而不诱导任何与长期Met缺失相关的组织病理学改变，分析HGF/Met信号通路在肝再生中的作用。经ShMet和ShHGF处理的大鼠的组织学与对照组完全相似（经干扰RNA处理、错配RNA处理或未经RNA处理）。因此，所获得的结果只能归因于特定基因表达的干扰。
抑制HGF
在之前的研究中，我们发现HGF mRNA在PHx后3小时开始增加。6HGF蛋白（前体和活性异二聚体）在PHx后的前3小时内减少，因为它是从肝脏细胞外基质中预先存在的存储中消耗的。29然而，在新的HGF mRNA表达后，HGF的前体和活性形式在全肝匀浆中均显著增加，从PHx后3小时开始，到PHx后24–48小时达到峰值。29在这项研究中，ShHGF治疗抑制了蛋白质和HGF mRNA。然而，这种“敲除”对肝细胞DNA合成的影响是可以测量的，但并不严重。我们的结果表明，HGF对肝细胞的影响取决于PHx后前3小时内消耗的HGF蛋白储备，3小时后HGF蛋白质的进一步增加主要影响非肝细胞群体，如星状细胞、内皮细胞和胆道上皮。更长时间的HGF抑制方案14需要正确评估新合成的HGF对非肝细胞群的影响。
c-Met的抑制
需要从两个角度检查c-Met抑制的效果：（1）Met的酪氨酸磷酸化发生在PHx的30–60分钟内5; 和（2）HGF和EGF受体之间的信号转导途径有很大的重叠，除非与Met和Fas相关。30
本研究的结果表明，尽管Met和EGFR的信号通路非常相似，但Met具有独特的信号作用，而EGFR或其他与肝再生相关的细胞因子（例如TNF-α、，31去甲肾上腺素32). HGF/Met的信号传导作用，即使在PHx后30–60分钟启动，也可能影响下游信号级联，当肝细胞即将从G进入时表现出来1进入S期（大鼠PHx后6-12小时）。这些信号影响生长相关基因（例如，细胞周期蛋白E1和B、基因p53和p21）以及凋亡相关基因（胱天蛋白酶3、BclX等）。凋亡相关基因的变化可能是由于ShMet治疗后与c-Met的相关性降低，Fas的可用性增加所致。30PHx后24小时观察到的ShMet RNA的总体影响可能是酪氨酸磷酸化-Met减少的结果，如在时间0（首次注射ShRNA后24小时，PHx时）和PHx后1小时，Tyr-phospho-Met的减少可能会影响24小时后的细胞周期事件（BrdU很少，没有有丝分裂）。然而，Tyr-phospho-Met比对照组增加更多，24小时后远远超过对照组。这与PHx后48小时，ShMet中的肝细胞有丝分裂增加有关，高于经干扰RNA处理的动物。顺便提一下，这些结果描述了Met激活和肝细胞有丝分裂之间的24小时信号间隔。Tyr-phosphono-Met的表达（PHx后1小时时的最低抑制约为40%，PHx后约为60%）与PHx后24小时肝细胞相关事件的抑制程度（无核分裂，BrdU掺入极少）之间存在明显差异。这可能反映了内皮细胞中的Tyr-phospho-Met，该细胞不携带ShRNA质粒（数据未显示）。上的数据体内质粒持久性的稳定性也表明质粒在PHx后的第一天丢失(补充图1). 质粒DNA的丢失可能是由于多种原因造成的，包括核酸酶降解、启动子甲基化失活以及细胞复制导致的稀释。质粒的急剧丢失可能导致观察到的短暂沉默。
同样有趣的是，ShMet对肝细胞的PCNA核标记指数没有影响。PCNA核标记出现在所有进入G区的细胞中1G的相位0阶段。除HGF/Met信号通路外，信号通路也有重要贡献，导致肝细胞进入细胞周期。其中包括TNF-α，31,33去甲肾上腺素，32,34和EGFR配体（EGF，35TGF-α，36HB-EGF、，37水飞蓟素38). 我们的研究表明，其他信号足以刺激肝细胞进入G1EGFR总是在大鼠肝脏的酪氨酸残基中磷酸化，并且在PHx后60分钟其磷酸化也显著增加。5然而，HGF/Met信号对肝细胞通过G1阶段，进入S阶段和DNA合成。
