乳腺肿瘤进展中上皮和基质组织蛋白酶K和CXCL14的表达

RNA分离和Northern印迹

总RNA采用氯化铯胍法制备(4). Northern blot分析如下所述(27).

免疫组织化学和免疫印迹分析

CTSK表达的免疫组织化学分析基本上如所述(28)使用单克隆抗CTSK抗体克隆CK4（Vision Biosystems），而按照Galina Shurin博士（匹兹堡大学；参考文献。20). 使用Vision Biosystems的细胞裂解物和CSTK（克隆CK4）、CTSL（克隆13C2）、CTSB（克隆CB121）和CTSF（克隆CTF12）抗体进行蛋白质印迹。乳腺病理学家盲目独立地分析表达水平，并根据先前验证的评分模式将其分为−、+、++和+++(26).

细胞增殖、迁移和侵袭检测

为了确定组织蛋白酶抑制剂对二维细胞生长的影响，我们将每孔2000个细胞置于48周的平板中，并在其常规生长介质（对照）中或使用不同浓度的抑制剂进行生长。在接种后第1、3和6天对细胞进行计数（每个时间点两个孔）。三维培养中的增殖分析基本上是以相同的方式进行的。为了确定组织蛋白酶活性的抑制是否影响细胞迁移和侵袭，我们使用Biocoat Matrigel侵袭室（BD Biosciences）对细胞进行了测试，基本上如所述(29). 对于侵入性分析，我们镀2.5×10⁴每个孔的细胞数在36小时后进行分析，而对于迁移分析，我们使用2.5×10⁴在不含Matrigel的Biocoat平板上每孔的细胞数，12小时后测定细胞数。添加细胞时，在分析的顶部和底部孔中以不同浓度（0.33–20μmol/L）添加抑制剂。将上述所有实验重复至少三次。CTSB抑制剂IV、CTSL抑制剂、CTSK抑制剂I购自Calbiochem，而其他CTSK抑制物则由Johann Zimmermann博士（诺华制药）提供。

组织蛋白酶抑制剂对细胞增殖、存活、迁移和侵袭的影响

为了分析组织蛋白酶在乳腺癌上皮细胞和基质细胞中高表达的功能相关性，我们分析了几种组织蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响，这些细胞系是根据各种组织蛋白酶的表达模式选择的。在二维和三维条件下进行增殖分析；在后一种情况下，将细胞包埋在基质胶中。我们发现高浓度（20μmol/L）组织蛋白酶B抑制剂抑制了所有测试细胞系的生长，而低剂量没有明显的效果。CTSL抑制在任何测试浓度下都不会对细胞增殖产生影响，但在10μmol/L时，它似乎改变了生长在Matrigel中的MDA-MB-435细胞的形态(图2A)可能通过减少细胞的侵袭性。为了验证这一假设，我们分析了组织蛋白酶B和L抑制剂在不影响三维培养中细胞增殖的浓度下对MDA-MB-435细胞迁移和侵袭的影响。两种抑制剂都对细胞迁移没有显著影响，但都能有效抑制Matrigel的入侵(图2B)表明上调乳腺癌细胞组织蛋白酶B和L的表达可能促进其降解细胞外基质的能力，增强其侵袭和转移行为。

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图2

组织蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞的作用。A、，MDA-MB-435细胞在Matrigel中的三维生长，存在和不存在指定浓度的CTSB或CTSL抑制剂。MDA-MB-435癌细胞在Matrigel中以高度侵袭的分支模式生长。添加2μmol/L浓度的CTSB抑制剂对细胞没有影响，而在20μmol/L浓度下，它显著抑制了细胞的生长。10μmol/L浓度的CTSL抑制剂抑制细胞的分支生长。B、，在指定浓度下使用CTSB或CTSL抑制剂时测定的迁移和侵袭分析的定量总结。Y轴，通过膜/孔迁移或侵入的细胞数量。数字，代表性实验一式三份。酒吧，实验重复三次，结果相同。C、，MCFDCIS细胞在Matrigel中单独生长或与乳腺基质成纤维细胞（+PBS）共培养。在培养的第8天采集图像。细胞单独形成球状结构，偶尔分支，而与成纤维细胞共培养可显著促进分支生长。D、，绿色荧光蛋白阳性MCFDCIS细胞单独或与成纤维细胞（+PBS）共培养，在有或无指定浓度的CTSK抑制剂的情况下迁移和侵袭。代表性实验一式三份。左侧，细胞的实际图像；正确的，照片中显示的侵入分析的定量总结。Y轴，侵入膜/孔的细胞数量。数字，代表性实验一式三份。酒吧，实验重复了三次，结果基本相同。

CTSK在我们测试的任何乳腺癌细胞系中均不表达，但在原代培养的乳腺基质成纤维细胞中高度表达(图1B)与我们在大多数原发性乳腺肿瘤中观察到的情况类似。这种表达模式提出了CTSK可能通过旁分泌相互作用影响肿瘤上皮细胞行为的假设。为了验证这个假设，我们将表达CTSK的乳腺基质成纤维细胞与MCFDCIS细胞共培养(31,32)是Matrigel的一种非侵袭性乳腺癌细胞系。MCFDCIS细胞与乳腺基质成纤维细胞共培养显著改变了细胞的形态(图2C). 镶嵌在Matrigel中的MCFDCIS细胞形成小而圆的腺泡，仅在稍后的时间点（培养8天后），我们观察到偶尔出现分支。将MCFDCIS细胞与乳腺基质成纤维细胞包埋在一起导致广泛分支结构的生长(图2C). 这表明成纤维细胞可能增强MCFDCIS细胞的侵袭力或改变其形成结构的形态，而成纤维细胞中表达的CTSK可能在这一过程中起作用。

为了验证成纤维细胞增强上皮细胞侵袭的假设，我们使用MCFDCIS细胞和乳腺成纤维细胞进行了迁移和侵袭试验。我们用一种表达绿色荧光蛋白的腺病毒感染MCFDCIS细胞，以便这些检测能够区分这两种细胞类型。与乳腺成纤维细胞共培养可显著增强MCFDCIS细胞的侵袭性，但对其迁移无明显影响(图2D). 添加CTSK抑制剂对细胞迁移没有影响，但显著降低了乳腺成纤维细胞对MCFDCIS细胞的侵袭促进作用(图2D和E). 以抑制共培养中入侵的浓度使用的CTSK抑制剂不影响MCFDCIS细胞的增殖（补充图S1）。

总之，这些结果表明基质CTSK的表达可能通过促进侵袭而在乳腺癌的进展中发挥作用，因此可能影响乳腺癌患者的临床结局。

CTSK和CXCL14在正常、良性和恶性乳腺病变中的表达

为了确定CTSK在乳腺肿瘤进展中的表达，我们分析了其在正常乳腺（小叶间质和小叶内基质）、各种良性病变中的表达情况，包括常见的导管增生（UDH）、硬化性腺病（SA）、非增殖性疾病（NP）、放射状瘢痕、活检部位以及ADH、DCIS、，BIDMC数据集中的浸润性和转移性乳腺癌（补充表S2）。我们还分析了CXCL14在一些组织样本中的表达，包括ADH、DCIS、放射状瘢痕和浸润性导管，因为我们对基因表达数据的系列分析表明，CXCL14和CTSK在相同的肿瘤和细胞类型中共存(图1A;表1A). 基质中CTSK表达水平与组织类型之间的关系总结如下表1B; 免疫组化结果的代表性图像见图3A和B（由于这些病例的阳性水平很少，因此未对上皮细胞中CTSK的表达或基质或上皮细胞中CXCL14的表达进行检测。）。

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图3

人类乳腺组织样本中CTSK和CXCL14表达的免疫组织化学分析。A、，CTSK在正常乳腺和各种乳腺良恶性病变中的表达。B、，CXCL14在DCIS和浸润性乳腺癌中的表达。在大多数DCIS中，只观察到基质和肌上皮染色，但在一些肿瘤中，上皮细胞表达高水平的CXCL14。C、，CTSK在原发性侵袭性肿瘤和匹配的远处转移中的表达。

在高等级和低至中级DCIS间基质CTSK水平没有发现显著差异。浸润性导管癌样品在基质中CTSK表达阳性的可能性高于DCIS样品，但这仅具有轻微的显著性(P（P）= 0.02; 校正多次比较后的截止值为0.0071），尽管将表达水平分为四类时发现了显著差异(P（P）= 0.004). DCIS和ADH肿瘤标本的CTSK阳性率无显著差异(表1B). 在良性病变中，UDH的CTSK阳性表达率最高，而放射状瘢痕的阳性表达率最低，但在四种良性病变中的阳性表达百分比没有统计学差异(P（P）= 0.07). 所有四种良性组织样本与正常组织（包括小叶间和小叶内基质）的比较无显著性(P（P）= 0.55). 相反，活检部位组织样本中CTSK的表达水平显著(P（P）<0.0001）比正常组织样本（包括小叶间基质和小叶内基质）更可能呈阳性。CTSK在活检部位始终呈阳性表达，而55%的正常组织样本呈阴性。同样，CTSK也显著(P（P）<0.0001），与DCIS和浸润性乳腺肿瘤相比，活检部位的组织更有可能阳性。CTSK在活检部位的表达始终为阳性，而在DCIS和浸润性导管癌中只有33%为阳性。CTSK在活检部位基质中的表达表明CTSK+肌成纤维细胞在组织损伤中的募集，以及CTSK通过调节细胞外基质降解和血管生成在组织重塑和伤口愈合中的潜在作用。

接下来，我们比较了同一患者组织样本中小叶间基质和小叶内基质之间的CTSK表达水平（分为四类：−、+、++和+++）(表1C). 9例患者小叶间和小叶内基质中CTSK表达不一致。在这9例患者中，有7例（78%）患者的小叶内基质中CTSK表达水平较高，2例（22%）患者小叶间基质中CTSK表达水平较高，但这一差异无统计学意义(P（P）= 0.18). 我们还测试了同一组织样本中基质细胞和上皮细胞之间的CTSK和CXCL14（各分为四类）表达水平是否不同，以确定它们在不同细胞类型中的表达是否相互调节。在所有分析的组织样本中，85个样本在基质和上皮中检测到CTSK表达水平。在63对差异对中，62（98%）对(P（P）<0.0001）基质中CTSK的表达水平高于上皮(表1D). 82份组织样本在基质和上皮中均表达CXCL14。在31对差异对中，28对（90%）在基质中的CXCL14表达水平高于上皮，这种差异也非常显著(P（P）< 0.0001).

最后，我们比较了CTSK在匹配的原发肿瘤和远处转移瘤中的表达。有趣的是，在原发性肿瘤和骨转移的基质中观察到CTSK的高表达，而肝转移的CTSK表达基本为阴性(图3B). 这些结果与CTSK在溶骨性乳腺癌骨转移中的作用一致(13).

总之，CTSK在正常乳腺组织和乳腺良恶性病变的各种标本中经常检测到基质中的表达（在a+或++水平）（总体42%）。在这个水平上很少检测到基质中CXCL14的表达（10%的标本）。大多数CTSK和CXCL14阳性基质细胞是肌成纤维细胞，而DCIS相关的肌上皮细胞和白细胞亚群表现出不同的表达。浸润性导管癌中很少检测到上皮性CTSK表达，而CXCL14在DCIS和ADH肿瘤的一部分上皮细胞中表达。

CTSK或CXCL14表达与患者和肿瘤特征及临床结局的关系

为了确定CTSK或CXCL14的表达是否与临床结果相关，我们利用UMCC和韩国数据集中的临床随访数据对侵袭性乳腺肿瘤进行了免疫组化分析。在韩国数据集分析中的146名患者中，111名和65名患者分别进行了CTSK和CXCL14表达水平分析。基质中CTSK表达水平分为阴性（−或+）或阳性（++或++）。当使用Fisher精确检验评估CTSK表达水平与肿瘤和患者特征、T分期之间的关系时(P（P）=0.02）和雌激素受体（ER）状态(P（P）=0.05）与CTSK阳性显著相关（补充表S3）。T型肝炎患者₁与T分期患者相比，分期肿瘤患者CTSK阴性的可能性更大₂/T型_三而ER-阴性肿瘤比ER-阳性肿瘤更可能对CTSK阳性。在韩国的数据集中，在22名患有T₁肿瘤间质中CTSK阳性，而87例T患者中有52%为阳性₂或T_三肿瘤。在UMCC数据集中，70名T₁肿瘤间质中CTSK阳性，而59例T患者中为41%₂或T_三肿瘤。在韩国的数据集中，60例ER阳性患者中37%的基质中CTSK阳性，而51例ER阴性和未知患者中为57%。在UMCC数据集中，81例ER阳性患者中38%的基质中CTSK阳性，而44例ER阴性患者中为34%。这两个队列在肿瘤阶段CTSK表达和激素受体状态方面的差异可能是由于种族和/或年龄的差异。有必要对较大的独立数据集进行评估，以确定这些变量是否会影响CTSK的表达。

在CTSK表达水平的递增逻辑模型中₁阶段是添加到模型中最重要的协变量(P（P）=0.002，调整T级后未知）。使用T₁在模型的阶段，没有其他变量（包括ER状态）显著添加到该模型中。在逻辑模型中包含所有可能的协变量时，T₁与CTSK表达水平仍显著相关(P（P）=0.01），但ER状态不是。

CXCL14水平被分为完全阴性（−）和任何水平的阳性（+、++或+++）。使用Fisher精确检验，CXCL14表达水平的分类与肿瘤和患者特征之间没有显著关联。最具显著性的变量是总体肿瘤分期；与Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌患者相比，Ⅲ期乳腺癌病人CXCL14表达完全阴性的可能性较小(P（P）= 0.13).

在UMCC数据集中，基质和上皮中CTSK阳性表达（定义为++或++）的患者分别占38%和46%。使用Fisher精确检验（补充表S4），CTSK表达与患者特征之间没有显著相关性。在基质中CTSK表达水平的逐步logistic模型中，N第II/III期是最接近显著的协变量(P（P）=0.07，调整N级后未知）。N期II/III患者发生CTSK阳性基质的可能性较小。至于上皮细胞中CTSK的表达水平，最显著的协变量是小叶或小叶与导管混合组织学(P（P）= 0.09). 小叶或小叶与导管混合组织学患者的上皮细胞CTSK阳性率低于单纯导管或其他组织学患者。然而，上述各项均无统计学意义。

为了确定CTSK在基质或上皮中的表达是否影响临床结果，我们使用逐步增加的Cox比例风险模型分析了UMCC数据集中CTSK水平和RFS之间的关系（总中位RFS为107个月，有72例RFS事件和55例受检RFS患者）。与较长RFS显著相关的协变量，按添加到模型的顺序，是诊断时的年龄48至59岁（第二个四分位数）、疾病I或II期（与III期相比）、既往放疗和孕酮受体阳性（见补充表S5）。基质中的CTSK表达水平和上皮中的CTSK表达水平均与RFS无显著相关性，尽管有足够的失败率达到约80%，无法检测到每个变量的约2.2的危险比（补充表S6）。

我们还通过log-rank检验分析了UMCC数据集中总生存率（定义为从诊断到死亡的时间）与CTSK表达水平之间的关系。127例有生存数据的患者中位总生存期为122个月。未发现明显关联(P（P）=0.51和0.75，对于基质和上皮中的二分CTSK）。在127名有生存数据的患者中，73人死亡；34人死于乳腺癌，39人死于其他原因。超过50%的死亡原因不是乳腺癌。

拨款支持：美国国家癌症研究所SPORE乳腺癌拨款CA89393和Dana Farber/哈佛癌症中心拨款CA006516（S.J.Schnitt、R.Gelman、Y-H.Chen和K.Polyak）；国防部拨款W8IXWH-04-1-0452，国家癌症研究所拨款CA116235，美国癌症学会拨款RSG-05-154-01-MGO（K.Polyak）；Susan G.Komen基金会奖学金（胡锦涛）；国防部拨款BCO30054（P.Argani）；国家癌症研究所授予CA107469和CA090876（C.G.Kleer）。

我们感谢Diana Calogrias帮助我们采集人体组织样本，感谢Beatriz Feldstein帮助我们进行免疫组织化学评分和记录，感谢Johann Zimmermann博士（诺华公司）提供CTSK抑制剂并推荐抗体。