Nkx2–5激活Ets-相关蛋白71基因并指定发育中胚胎的内皮/心内膜命运

摘要

心血管系统的形成涉及一系列精确协调的分子和形态发生事件，因此，即使对这一过程的细微扰动也可能以先天性心脏病的形式产生灾难性后果。小鼠大约在胚胎第7.5天（E）开始心脏形成，此时祖细胞通过原始条纹迁移到胚胎的前近端形成新月体(1,2). 作为对许可和抑制信号的响应，心脏祖细胞向背内侧方向迁移，融合并形成线性心脏管，最终形成4腔心脏。虽然心脏的形成在形态学上有广泛的描述(1–三)，控制心脏命运决定的转录网络相对来说是未知的。特别令人感兴趣的是，最近的研究发现，多能干心祖细胞能够在心脏发生过程中产生替代谱系（即心肌、平滑肌和心内膜谱系），尽管控制这些命运决定的转录网络仍不完全确定(4–6).

同源盒转录因子Nkx2–5是果蝇科同源结构域蛋白Tinman，是苍蝇心脏形成所必需的(7). Nkx2–5是在发育中的脊椎动物胚胎的心脏谱系中表达的最早的转录因子之一。有针对性地中断Nkx2–5个在大约E9.5时导致心脏形态发生障碍、严重生长迟缓和胚胎死亡(8,9). 变异心脏的一个显著特征是缺乏心内膜垫(8,9). 使用Nkx2–5-Cre谱系追踪策略的研究表明，在发育中心脏的心内膜谱系中，报告基因表达和内源性Nkx2-5表达(10). 此外，最近的研究表明，Nkx2–5在心脏形态发生过程中在多能干祖细胞中表达(4–6). 总之，这些研究支持Nkx2–5调节心内膜/内皮发育的观点。虽然已经确定了心肌中表达的几个Nkx2–5下游靶点(9,11–13)到目前为止，还没有发现仅限于心内膜的靶基因。

Ets-related protein 71（Etsrp71）是一种新发现的含Ets结构域的转录因子，具有广泛的保守性指出，一个果蝇属ETS域因子(14,15). 保守的ETS结构域负责ETS蛋白家族的DNA结合活性(14). Etsrp71仅与ETS域内的其他家族成员具有同源性，但与该域外的序列没有同源性。此外，关于Ets家族成员在胚胎发生过程中的功能作用的机械信息有限。

在本研究中，我们证明Etsrp71是Nkx2–5的一个新的下游靶基因。Etsrp71在发育中胚胎的心内膜/内皮细胞中短暂表达，并在发育后期和成年心脏中消失。我们还证明Etsrp71缺失胚胎缺乏心内膜和内皮细胞谱系，在胚胎发生早期是致命的。此外，我们证明内皮祖细胞中表达的Tie2是Etsrp71的直接下游靶点。总之，这些数据补充并扩展了我们对Nkx2–5表达的多潜能心脏祖细胞促进发育中心脏和胚胎的心内膜/内皮命运的机制的理解。

结果

下调埃斯特普71Nkx2–5 Null Heart中的表达。

我们之前使用6-kb的上游增强子区域构建了转基因小鼠模型Nkx2–5个将增强型黄色荧光蛋白（EYFP）报告基因导入发育早期的心脏祖细胞群体（E7.75），该基因重述了内源性Nkx2-5表达(16). 为了确定Nkx2-5直接下游靶基因，我们检测了Nkx2-5存在和不存在时心脏祖细胞在离散发育阶段的差异基因表达。我们将Nkx2–5杂合子配对(8)和Nkx2–5-EYFP转基因小鼠：Nkx2-5杂合小鼠产生野生型（WT）、杂合型和无窝卵胚胎，EYFP在发育中心脏祖细胞中表达(图1A类). 虽然在E8.0时，Nkx2–5缺失胚胎与WT同窝婴儿无法区分，但如前所述，在E9.5缺失胚胎中观察到严重的生长迟缓和心脏发育紊乱(图1A类) (8).

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图1。

在Nkx2–5无效心脏祖细胞中，Etsrp71在心内膜/内皮细胞系中的瞬时表达下调。(A类)将6千基地Nkx2–5-EYFP-Tg:Nkx2-5±和Nkx2-5-±小鼠交配以产生EYFP⁺Nkx2–5+/+和EYFP⁺E8.0和E9.5时，Nkx2–5−/−窝友。请注意，WT和Nkx2–5突变胚胎在E8.0时无法区分，而在E9.5时，与WT同窝卵相比，Nkx2-5−/−胚胎发育严重迟缓。(B类)6-kb Nxk2–5-EYFP Tg的半定量RT-PCR：Nkx2–5 null vs.6-kb Fxk2-5-EYFP Tg：WT心脏祖细胞。票据减少Etsrp71型Nkx2.5−/−心脏祖细胞中的转录物表达与WT对照相比。(C类)E8.5处Etsrp 71表达的原位杂交技术。明亮的(顶部)和黑暗(底部)图中显示了E8.5心脏横切面的视野，箭头表示心内膜。注意缺少埃斯特普71在E11.5胚胎中表达。(天)RT-PCR分析埃斯特普71在发育中的心脏和胚胎中表达。在指定阶段从发育中的心脏和胚胎中提取RNA，以分析埃斯特普71ATP合成酶（ATPSyn）被用作负荷控制。(E类)共表达埃斯特普71和Nkx2–5个在发育中胚胎的内皮祖细胞中。第2级-GFP⁺用FACS从发育中的胚胎中分离细胞进行半定量RT-PCR（25个周期）。肌动蛋白被用作负荷控制，并在15个循环后进行分析。

分离每个阶段的单个WT和空胎仔胚胎，并进行EYFP⁺如前所述，对细胞进行FACS分类(16). 从EYFP中提取RNA⁺细胞，扩增并处理以进行转录组分析(16). 在Nkx2–5阴性心脏祖细胞的E8.0和E8.5发育阶段，共有86和113个转录物显著下调[参见支持信息(硅)图S1A类]. 其中，18个转录物在两个发育阶段均下调(图S1). 对两个时间段进行分析，以确定通常下调的转录物，以丰富真正的Nkx2-5下游靶点，并尽量减少选择非Nkx2-5靶点但因解剖（继发）缺陷而在空心下调的候选转录物。例如，我们观察到Nppa公司,无购买力平价,最小像素、和挑剔，之前被定义为Nkx2–5的直接下游靶基因(9,11,17)在两个发育阶段，Nkx2–5空的心脏祖细胞中均下调，这进一步支持了筛查的真实性(图1B类和图S1B类). 此外，我们观察到，除了Nppa公司和无购买力平价,埃斯特普71在两个发育阶段的Nkx2–5空祖细胞群中也显著下调(图S1B类). 我们使用从一个独立的WT和Nkx2–5无效祖细胞群体中分离的RNA的半定量RT-PCR分析来证实这些转录组结果(图1B类). 这些转录组和RT-PCR结果支持以下假设：埃斯特普71是Nkx2–5的一个新的下游靶基因。

无Nkx2–5时，Etsrp71的心肌表达严重减弱。

为了进一步探讨Nkx2–5和Etsrp71之间的调节相互作用，我们使用了3.9-kb埃斯特普71包含小鼠和人类之间进化保守区域的启动子片段。我们使用这个3.9-kb的Etsrp71启动子片段来驱动lacZ报告基因，生成了Tg小鼠(图2A类) (20). lacZ报告基因在转基因胚胎中的表达概括了Etsrp71的内源性表达。我们观察到lacZ报告基因在新月体中的表达（E7.75）(图2A类)并且在E8.5时表达仅限于心内膜/内皮谱系(图2B类)和E9.5（数据未显示），然后在E11.5熄灭(图2C类). 因此，我们的结果表明，3.9-kb的上游启动子片段埃斯特普71在胚胎发育早期，含有将Etsrp71表达导向心内膜/内皮细胞系的调节元件。为了确定Nkx2–5是否是Etsrp71的重要上游转录激活物，我们将Nkx2-5±和Nkx2.5±：3.9-kb Etsrp71-Tg成年小鼠配对。采集年龄匹配的WT:3.9-kb Etsrp71 Tg和Nkx2–5 null:3.9-kb Etsrp71Tg胚胎，并评估β-半乳糖苷酶的表达。我们观察到Nkx2–5缺失胚胎中β-半乳糖苷酶的心脏表达严重降低(图2 D–E型). 这些结果进一步支持了Nkx2–5位于Etsrp71的遗传上游，并作为Etsrp 71的转录激活物发挥作用的假设。另一种解释是埃斯特普71启动子活性可能是由于二级效应。因此，我们进行了进一步的研究来检验这一假设。

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图2。

Nkx2–5是等71页。(A–C)用于生成Etsrp71转基因小鼠系的构造示意图。在发育中的转基因心脏中，在E7.75–E8.5的心内膜前体中观察到β-半乳糖苷酶的表达，并在E11.5时被抑制。(天和E类)Etsrp71-LacZ Tg小鼠与Nkx2–5±小鼠交配，并对其后代进行分析。图中显示了Nkx2–5+/+和Nkx2–5−/-胚胎的环状E8.5心脏的横截面。箭头表示β-半乳糖苷酶阳性的内皮/心内膜。注意，Nkx2–5缺失心脏中β-半乳糖苷酶的表达严重减弱。(F类)鼠标和人的对齐埃斯特普71启动子序列揭示Nkx2–5反应元件的保守性。(G公司)埃斯特普71携带WT（如方框所示）和突变（Mut）NKE（以粗体显示）的启动子被用作放射性标记探针。电泳迁移率转移分析（EMSA）显示，形成了稳定的Nkx2–5-DNA复合物（第2条通道），可以与WT竞争，但不能与Mut探针（第2–4条通道）和超转移（第5条通道）竞争。请注意，myc抗体的热变性（+HD）（超移位分析的对照）无法超移位复合物（通道6）。(H（H）)的上游启动子区域示意图埃斯特普71包含进化保守的NKE（黑条）。体内结合Nkx2–5的ChIP分析埃斯特普71启动子使用myc标记的全长（FL）和突变型（缺乏DNA-结合域，ΔHD）Nkx2-5。免疫沉淀前纯化的DNA作为输入。注释IP，共Etsrp71型仅由表达FL Nkx2–5的细胞携带NKE的启动子。(我)Nkx2–5转录激活埃斯特普71C2C12成肌细胞的基因表达。CMV-myc-Nkx2-5质粒的过度表达导致2-kb-Etsrp71-luc启动子结构的剂量依赖性激活。2-kb中NKE的突变埃斯特普71启动子通过Nkx2–5显著减弱转录激活(n个=每个样品6个；所示数据为平均值±SEM；*，P（P）< 0.001). 折叠变化表示标准化为lacZ表达的萤光素酶活性。

Etsrp71指定发育中胚胎的心内膜/内皮细胞系。

为了研究Etsrp71在胚胎发生过程中的功能作用，我们获得了含有诱捕结构（pGep-SD5）的ES细胞来破坏埃斯特普71(图3A类) (22). 我们使用该靶向ES细胞系生成嵌合体小鼠，并经PCR分析证实。对杂合交配后代的分析表明埃斯特普71在E9.0和E10.5之间，纯合子缺失小鼠无法存活(图S5A类和B类). Etsrp71^−/−胚胎在E8.5时与WT（+/+）同窝卵无法区分(图3B类和图S5B类). 然而，组织学和免疫组织化学分析显示Etsrp71中缺乏心内膜/内皮细胞谱系^−/−心脏和胚胎(图3B类). Etsrp71缺失胚胎中心内膜/内皮细胞谱系的缺失不是由于细胞死亡增加所致(图S5C类)或缺乏细胞增殖(图S5天). 这些数据明确定义了Etsrp71在发育过程中心内膜/内皮细胞谱系发生中的重要作用。为了进一步验证我们的假设，我们使用了qRT-PCR分析，结果显示内皮/心内膜特异性转录物（Flk-1）显著下调，与WT心脏相比，Tie2转录物在空区基本上不存在(图3C类). 空心中Nkx2–5表达的适度减少与我们的(图3C类)和其他(10)观察结果显示Nkx2–5在内皮/心内膜谱系中表达。Bcl2修饰因子（Bmf）的表达没有显著变化，这表明空心基因表达下调是Etsrp71特异性的。总之，这些体内和体外结果证明Etsrp71对心内膜/内皮细胞谱系的规范化很重要。

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图3。

Etsrp71对心脏形态发生和心内膜/内皮细胞谱系的规范至关重要。(A类)的示意图埃斯特普71基因和靶向破坏。(B类) (顶部)E8.5+/+和Etsrp71−/−胚胎同窝卵的形态外观。请注意，在E8.5时无法区分完整的WT和Etsrp71突变胚胎。(中部)WT和无效胚胎的组织学分析表明，与同窝出生的WT相比，无效胚胎中缺乏心内膜/内皮谱系（末端）和血管系统（PHV，原发性心脏静脉；DA，背主动脉）。(底部)野生型和Etsrp71缺失胚胎中α-内粘蛋白的免疫组织化学分析进一步表明，缺失胚胎中不存在心内膜/内皮谱系（野生型显示箭头）和血管系统。高倍视野显示，与WT同卵双胞胎相比，空心缺乏心内膜（箭头表示α-内粘蛋白表达的心内膜）。(C类)使用来自单个Etsrp71 WT（黑色）和空（白色）E8.5心脏的纯化RNA进行qRT-PCR分析（一式三份）。WT心脏中的转录水平被认为是1，而在突变心脏中未检测到Etsrp71转录（*）。注意Etsrp71突变心脏中Flk1转录物的显著下调和Tie2转录物的基本缺失（**，P（P）< 0.001). 每次分析一式三份，重复两次。

观察到埃斯特普71^−/−胚胎缺乏心内膜/内皮细胞谱系，进一步的特征是Tie2转录物的基本缺失，我们假设Tie2是Etsrp71的直接下游靶点。我们将Tie2-lacZ转基因小鼠交配(18)进入埃斯特普71空背景。与证明在E8.0和E9.0时心内膜和内皮细胞系中β-半乳糖苷酶表达的WT同窝对照组相比，在埃斯特普71无胚胎(图4A类;n个=每个阶段3）。这些结果进一步支持了我们对埃斯特普71空胚（参见图3). 有趣的是，β-半乳糖苷酶的胚胎和/或胚外表达在埃斯特普71E7.75时胚胎为空(图S6A类). 这些结果表明，在没有Etsrp71的情况下Tie2启动子活性的丧失可能是心内膜/内皮规格丧失的次要后果。因此，进行了进一步研究，以检查Tie2是否是Etsrp71的下游靶点。以前的研究已经确定了关键的上游和内含子模块第2级将Tie2表达导向内皮/心内膜谱系的基因(18,23)上游启动子片段和内含子增强子启动子片段都含有几个进化上保守的Ets-binding元件(图S6B类). 我们使用ChIP分析证明Etsrp71有能力结合UPF内进化保守的EBE，但不结合第2级体内基因(图4B类). 我们进一步利用上游启动子片段进行转录检测，以确定Etsrp71作为第2级基因表达。我们观察到Etsrp71的表达导致显著的剂量依赖性激活第2级基因表达(图4C类)而EBE突变(图S6B类)完全消除了报告基因表达的激活(图4C类). 这些结果进一步支持了我们的假设，即Etsrp71是铁2基因。

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图4。

Etsrp71转录激活第2级基因。(A类)将Tie2-lacZ Tg和Etsrp71±小鼠交配，以分析所示发育阶段WT（+/+）和Etserp71缺失（−/−）同窝胚胎中β-半乳糖苷酶的表达。注意Etsrp71缺失胚胎中没有β-半乳糖苷酶表达。(B类)Etsrp71结合到第2级基因。Etsrp71在上游启动子片段（UPF）和增强子模块中的启动子占据率第2级使用ChIP分析评估基因。注意Etsrp71仅与UPF结合（不是第2级基因）。(C类)Etsrp71反式激活UPF的Tie2表达。图中显示了与荧光素酶（Luc）报告子融合的2.1-kb UPF的示意图。C2C12成肌细胞的转录分析显示，Etsrp71（黑色）对luc活性的诱导具有剂量依赖性。Ets-binding位点的突变完全消除了转录活性（hatched）（*，P（P）< 0.001). 每次分析一式三份，重复两次。

讨论

我们研究的总体目标是破译控制心脏形态发生的Nkx2–5介导的转录网络。本研究报告了3项重要发现。首先，利用转基因、转录组和分子生物学技术，我们确定Etsrp71是心脏祖细胞中Nkx2–5的一个新的下游靶点。其次，我们已经确定Etsrp71是表达Nkx2–5的多潜能心脏祖细胞的心内膜/内皮细胞命运的重要调节器。第三，我们已经确定Etsrp71是第2级基因。

通过基因阻断策略，我们和其他人已经证明，缺乏Nkx2–5的胚胎扰乱了心脏形态发生，包括缺乏心内膜垫和心内膜发育受到干扰(8,9). 最近的报告显示Nkx2–5在心内膜表达(10)表达Nkx2–5的心脏祖细胞的心内膜命运(4–6)支持Nkx2–5是心脏发生过程中内皮/心内膜谱系的重要调节因子的假设，尽管其分子机制尚不清楚。小鼠的最新研究(24)和斑马鱼(25,26)据报道，Etsrp71/ER71对发育中胚胎内皮/心内膜谱系的形成至关重要。然而，Etsrp71的转录调控尚不清楚。在本研究中，我们定义了一个转录网络，其中Nkx2–5调节Etsrp71，以确定发育中胚胎的心内膜/内皮命运。我们还认识到，Nkx2–5并不是Etsrp71基因表达的唯一调节器，因为在Nkx2-5缺失的心脏中，心内膜谱系和Etsrp71-表达分别受到干扰和降低，但它们并不缺失，表明包括Nkx家族成员在内的其他因素也可能在Nkx2–5存在或不存在的情况下调节Etsrp71基因的表达。虽然几个Nkx2–5下游靶基因的转录激活在心脏发生过程中至关重要(9,11–13)，Nkx2–5与其他细胞因子的协同作用对于维持心脏生成和造血过程中的基因表达也是至关重要的(27,28). 因此，Nkx2–5缺失心脏中Etsrp71启动子活性的丧失可能是由于Nkx2–5在多能心脏祖细胞中的协同功能的丧失。重要的是，我们的研究进一步支持了在心脏发育过程中产生替代血统的祖细胞群体。

其他研究支持双电位前体细胞的存在(29). 事实上，小鼠的血统追踪研究表明，心内膜和大量心肌是由普通的Flk-1发育而来的⁺前体细胞(30). 其他几份报告支持近轴骨骼肌细胞和主动脉平滑肌细胞的共同前体细胞的概念(31)流出道的头部骨骼肌和心肌细胞(32)、心肌和造血细胞(16)内皮细胞和血管平滑肌细胞(33). 这些研究强烈表明，单个多能干/祖细胞对心脏和其他器官内不同谱系的细胞有贡献。此外，使用ES/EB系统的血统追踪研究支持Nkx2–5个⁺/法兰-1⁺/岛1⁺能够分化所有3种心脏谱系（心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞）和造血谱系的心血管祖细胞(4–6). 此外，斑马鱼也有心肌和心内膜谱系的共同祖细胞的报道(34)在鸡细胞系QCE-6中(29). 虽然这些祖细胞群体已经被确定，但指导其后代命运的分子网络仍不清楚。在本研究中，我们将Etsrp71确定为Nkx2–5的直接下游靶点。

我们使用基因断裂技术的第二个发现是，Etrsp71对于胚胎发生期间心内膜/内皮细胞谱系的规范化非常重要。其他几种Ets家族转录因子的胚胎表达已被证明在内皮细胞中表达，但时空表达模式更为广泛(35)这表明Etsrp71在发育过程中可能比其他家庭成员发挥更大的限制作用。我们和其他人(24)已证明Etsrp71在内皮/心内膜谱系发育早期表达，突变胚胎干扰心脏发育，缺乏心内膜/内皮谱系。然而，我们的研究首次证明了Nkx2–5下游靶基因在发育过程中的心内膜/内皮命运规范中的重要作用。

有针对性地中断第2级基因导致胚胎致死，内皮细胞数量严重减少，心脏形态发生受到干扰，这进一步强调了发育过程中心内膜/内皮细胞系与心肌细胞之间的关键相互作用(36). 然而，内皮细胞系中Tie2的转录调控尚不清楚。我们的第三个发现支持了Tie2是Etsrp71的直接下游靶点的假设。我们的数据显示，Etsrp71结合在第2级基因并调节其表达，这得到了研究的进一步支持，研究表明缺失(23)或突变(37)上游启动子序列中的EBE显著消除体内Tie2启动子活性。未来的研究将确定额外的Etsrp71靶点以及它们在胚胎发育期间建立心内膜/内皮细胞谱系中的作用。因此，我们的研究揭示了之前未描述的Nkx2–5转录网络，它对于发育中胚胎的心内膜/内皮命运的规范和发生至关重要。

材料和方法

补充材料

致谢。

脚注

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