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神经元。作者手稿；PMC 2009年1月21日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2007年3月1日；53(5): 639–647.
doi（操作界面）：10.1016/j.neuron.2007.01.033
预防性维修识别码：PMC2629495型
美国国立卫生研究院：NIHMS87355标准
PMID：17329205

单个基因靶向神经元跨突触追踪的单突触限制

伊恩·维克沙姆（Ian R.Wickersham）,1中，* 大卫·C·里昂,1中，4 理查德·巴纳德,2,5 森卓马,1 斯特凡·芬克,三，6 卡尔·克劳斯·康泽尔曼,三 约翰·A·T·杨,2和爱德华·M·卡拉威1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

从来没有一种大规模的方法来识别与其他细胞群或特别是单个细胞单突触连接的神经元。可用的最佳工具，跨突触示踪剂，无法区分弱直接联系和强间接联系。此外，从单个细胞开始，没有任何示踪剂被证明足以标记任何连接的神经元。在这里，我们提出了一种仅跨越一个突触步骤的跨突触示踪剂，明确地将突触前细胞直接识别为起始群体。它以狂犬病病毒为基础，在基因上具有针对性，可以在突触耦合神经元中高水平表达任何感兴趣的基因，并牢固地标记与单个细胞的连接。这项技术应该能够比以前更详细地了解神经连接。

简介

我们对神经回路的复杂性和特异性的最新认识表明，用现有技术几乎不可能理解神经回路如何产生感知和行为。因为不同亚回路中涉及的不同神经元类型是混合的，即使是同一类型的相邻神经元，其连接和功能也不同(DeAngelis等人，1999年;Ohki等人，2005年;Song等人，2005年;Yoshimura等人，2005年)，需要能够揭示特定细胞类型和单个神经元之间联系的方法(克里克，1979年). 现有技术(Callaway和Katz，1993年;Douglas和Martin，2004年;吉尔伯特，1983年;格雷，1959年;Mercer等人，2005年;Shepherd和Svoboda，2005年;Timofeeva等人，2005年;扎兰帕和卡拉韦，2006年)非常有价值，但都在不同方面受到了限制。没有人能够整体识别与感兴趣的细胞类型或单个细胞直接相连的细胞。

在所有可用的技术中，跨突触示踪剂似乎可以解决这个问题。通过将示踪剂引入特定的细胞或细胞类型，突触连接的细胞应该被示踪剂标记，因此可以识别为与相关起始细胞突触接触的细胞。已经采取了几种方法来选择性地将传统或病毒示踪剂引入特定的遗传鉴定人群(Braz等人，2002年;DeFalco等人，2001年;Maskos等人，2002年;邹等人，2001).

然而，由于它们依赖细胞机制来运输到突触和跨越突触(Vercelli等人，2000年)，跨突触示踪剂以不同的速度跨越不同的突触：为给定连接提供服务的硬件越多，示踪剂越能有效地穿越它。在跨突触体标记的细胞中积累的示踪剂将开始依次扩散到与其相连的细胞，事实上可以标记出其中连接最紧密的细胞甚至在之前起始种群的弱连接突触伙伴被标记(乌戈里尼，1995年;Ugolini等人，1987年). 其结果是交叉突触数量上不可避免的模糊性：跨突触示踪剂无法区分强间接联系和弱直接联系。因此，它们不能以目前的形式以任何综合的方式用于确定单突触连接。

我们通过构建一种病毒示踪剂克服了这一障碍，该示踪剂只穿过一个突触步骤到达与起始种群直接相连的细胞。因此，单突触连接的细胞被明确标记。此外，该系统在基因上是可针对性的，与所有以前的方法不同，它的功能足以标记连接到单个起始细胞的神经元。

背景和理论

该系统的核心思想是用缺失突变追踪病毒感染感兴趣的细胞群体，该病毒缺失一个或多个跨突触传播所需的基因，并通过在反式仅在最初感染的神经元中(图1A). 由于起始细胞中存在所有病毒基因，病毒可以通过单突触接触从它们传播到细胞(图1B). 然而，由于这些基因不在二次感染的细胞中，病毒无法传播到它们之外。

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跨复合突触追踪

（A） 将缺失一个或多个跨突触传播所需基因以及单独缺失的病毒基因的缺失突变追踪病毒引入感兴趣的细胞或细胞类型。初始感染和补充病毒基因都必须限于感兴趣的神经元群体。

（B） 由于所有病毒基因都存在于最初感染的人群中，病毒可以通过突触传播到与之直接突触接触的细胞。然而，由于这些细胞中没有缺失的病毒基因，病毒无法进一步传播。

（C） 狂犬病病毒。病毒核心由RNA基因组和相关蛋白组成，并由宿主细胞衍生膜包围，其中嵌入狂犬病病毒糖蛋白（G）。EGFP基因取代了病毒基因组中的糖蛋白（中心）。这种病毒的版本可以包含其天然糖蛋白（SADΔG-EGFP，右上图）或其他一些病毒的糖蛋白。在这项研究中，狂犬病病毒是用来自ASLV-A的糖蛋白假分型的，称为EnvA，该病毒被命名为SADΔG-EGFP（EnvA）（右下图）。

（D） 针对感染。除非将ASLV-A受体基因TVA引入哺乳动物神经元，否则ASLV-A-伪型狂犬病病毒[SADΔG-EGFP（EnvA）]不能感染哺乳动物神经元。这导致受体在细胞表面表达，从而被假型病毒感染。因此，系统的基本要求如下。首先在感兴趣的细胞或细胞类型中插入两个基因：TVA基因，这样病毒就可以进入；狂犬病病毒糖蛋白基因，这样，病毒就可以传播到突触偶联的细胞。然后应用ASLV-A假型病毒。

（E） 遵循这些步骤，TVA表达细胞发生特异性感染；狂犬病病毒糖蛋白的互补性允许病毒直接传播到突触前神经元。这些细胞都表达病毒基因组中编码的EGFP，但病毒不能传播到这些直接连接的细胞之外，因为它们不表达病毒糖蛋白。

我们用狂犬病病毒实现了这个想法(图1C（左），因为它的细胞病变性显著低于其他广泛使用的追踪病毒家族α-疱疹病毒，并且感染效率远高于其他追踪病毒家族(Card等人，1999年;Ito等人，2001年;Lafay等人，1991年;诺冠和雷曼，1998年;乌戈里尼，1995年;Ugolini等人，1987年). 作为跨突触体示踪剂，它以其完整的形式被成功地用于逆行方向跨越突触(Hoshi等人，2005年;Kelly and Strick，2000年;Nassi等人，2006年;乌戈里尼，1995年;乌戈里尼等人，1989年). 此外，狂犬病病毒的跨突触传播已被观察到是特定于连接的神经元，而不是特定于未连接的相邻神经元(乌戈里尼，1995年b). 因此，这里介绍的系统是一种识别感兴趣细胞或细胞类型突触前细胞的方法。

由于完整的狂犬病病毒会非特异性感染，并在多个突触上复制和传播，因此我们的策略需要使用改良的狂犬病毒。为了实施我们的战略，需要进行两项关键的变革。第一种是通过删除产生感染性病毒颗粒所需的基因来修改病毒基因组。这将允许使用上述跨补体方法以单突触方式限制病毒传播。第二个修改是改变病毒的嗜性，使其只能感染基因特定的神经元群体。

我们通过删除狂犬病病毒糖蛋白基因来实施跨补体策略。糖蛋白，嵌入病毒核心周围的膜中(图1C（左），不需要用于病毒基因的转录或感染细胞内基因组的复制，但需要用于跨突触传播(Etessami等人，2000年;Mebatsion等人，1996年;Wickersham等人，2007年). 我们最近描述了一种重组狂犬病病毒，其糖蛋白基因替换为增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的编码序列（称为SADΔG-EGFP，图1C（中右图和右上角）不能传播到最初感染的神经元以外，但由于其糖蛋白基因的缺失使其复制病毒核心的能力保持不变，因此产生的EGFP水平足以清楚地标记出细小的树突和轴突细节(Wickersham等人，2007年). 我们推断，这种病毒将是我们的跨补体方法的理想选择，因为病毒的传播将受到单突触限制，但该病毒仍能在受感染的细胞中复制和表达丰富的EGFP。这将有可能极大地放大来自少量病毒颗粒的信号，这些病毒颗粒可能会传播到少量突触上。

为了将最初的SADΔG-EGFP狂犬病病毒感染靶向基因定义的靶向神经元细胞群，我们利用了a亚群禽肉瘤和白血病病毒（ASLV-a）受体相互作用的特异性。这种病毒的包膜蛋白（EnvA）可以将病毒特异性感染到表达同源TVA病毒受体的细胞中，这种蛋白存在于鸟类中，但不存在于哺乳动物中(Barnard等人，2006年;Bates等人，1993年;Federspiel等人，1994年;Young等人，1993年). 因此，通过使用EnvA对狂犬病病毒进行假分型(图1C（右下图），我们可以限制由此产生的病毒发酵SADΔG-EGFP（EnvA）的感染，仅限于表达TVA的一小部分神经元细胞(图1D).

通过同时提供狂犬病病毒糖蛋白基因反式在这些最初感染的细胞中，我们允许狂犬病病毒组装并传播到单突触连接的细胞。由于病毒糖蛋白基因不存在于经突触体感染的细胞中，病毒不能在细胞外传播(图1E). 因此，单突触连接的细胞将被明确识别。

在这里，我们证明了我们推论的有效性。我们展示了以下内容。（1） 我们针对狂犬病病毒初始感染的策略有效，SADΔG-EGFP-（EnvA）特别感染表达TVA的哺乳动物神经元。（2） 狂犬病病毒糖蛋白的转录补体对于SADΔG-EGFP在最初感染的神经元之外的传播是必要的和充分的。当糖蛋白不表达时，感染仅限于表达TVA的神经元，但当糖蛋白表达时，则感染通过突触体传播。（3） 这些相同的数据也表明狂犬病病毒的传播是单突触限制的。由于糖蛋白的表达是病毒传播所必需的，它不能从不表达糖蛋白的二次感染细胞经突触传播。（4） 这个系统足够敏感，可以标记对单个启动细胞具有突触前作用的神经元。

结果

我们在新生大鼠脑培养切片中测试了该系统，使用“基因枪”（Bio-Rad，Hercules，CA）转染每个切片中少量相对孤立的神经元，用编码TVA、狂犬病病毒糖蛋白和DsRed2的质粒DNA标记转染的细胞群。转染后第1天，将SADΔG-EGFP-（EnvA）添加到培养孔中，随后使用荧光显微镜监测病毒感染情况，以评分EGFP的表达。

在感染后6天定量检测的6个切片中，发现242个细胞表达DsRed2，其中62个细胞也表达EGFP，表明感染了狂犬病病毒。令人惊讶的是，双标记细胞被大簇病毒感染的神经元包围，其中5424只表达EGFP(图2E–2H和图3). 经仔细检查，没有一个绿色细胞具有胶质细胞的外观。对数十个其他大脑切片进行了测试，得到了定性相似的结果。这些观察结果表明，这些簇中心的红色TVA表达细胞最初被EnvA-伪型狂犬病病毒感染，另外数千个绿色细胞与最初感染的细胞直接相连。为了评估这些推断的有效性，我们进一步测试了EnvA伪型病毒感染的特异性、病毒传播对G表达的要求以及标记神经元之间存在的功能联系。

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切片培养中的选择性感染和原位补体

（A–D）最初感染仅限于表达ASLV-A受体TVA的细胞。在这些检测感染选择性的对照实验中，使用基因枪将培养脑片中分离的神经元转染为两个基因，一个编码TVA，另一个编码DsRed2。第二天应用ASLV-A伪型狂犬病病毒[SADΔG-EGFP（EnvA）]，并在第六天拍摄图像。（A和C）DsRed2表达标记TVA转染和（B和D）EGFP表达，表明同一TVA表达细胞随后选择性感染假型病毒。（E–H）原位互补允许跨突触从最初感染的单个细胞传播到单突触连接的细胞簇。用编码TVA的三个基因转染分离的神经元以允许病毒感染，用DsRed2标记转染细胞，用狂犬病病毒糖蛋白基因补充病毒基因组中的缺失。（E） DsRed2荧光表示转染细胞，用虚线标记，位于（F）所示簇的中心。（G和H）围绕单个转染细胞的另外两个集群示例。最初表达EGFP和DsRed2的感染细胞呈黄色。比例尺：200μm。

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跨编译跟踪的更多示例

（A–C）长程病毒从最初感染的单个细胞传播。（A） 感染后8天，一个巨大的绿色细胞簇围绕着一个红色/绿色深层皮质神经元（虚线）。另一个密集的细胞簇也感染了紧邻其上的表层皮层，这与已知的表层向深层的投射相一致；远处深层锥体细胞也受到感染，这与已知的长程层内连接模式再次一致。在最初被感染的细胞的左边是第二个黄色（双标）细胞，显然是继发性的，最近由于周围缺乏绿色细胞而感染。（B–C）来自（a）的中央簇特写。（D–F）更多原位互补的例子：感染细胞簇围绕着孤立的突触后细胞。比例尺：200μm。

为此，SADΔG-EGFP（EnvA）也被用于感染未被转染或被编码TVA和DsRed2的质粒DNA转染的切片，但不感染狂犬病病毒糖蛋白。与ASLV-A对哺乳动物细胞的低水平嗜性相一致，对20个独立的未转染脑片进行检查后，仅鉴定出一个EGFP表达细胞。另一组12片培养物转染了编码TVA和DsRed2的质粒DNA，但未转染狂犬病病毒糖蛋白。转染后第1天，将SADΔG-EGFP（EnvA）添加到培养孔中，并使用荧光显微镜再次监测病毒感染情况，以评分EGFP的表达。在12个切片中，43个细胞表达DsRed2；其中23个红细胞，也只有一个未转染细胞表达EGFP。因此，在狂犬病病毒糖蛋白基因缺失的情况下，病毒感染几乎完全局限于表达TVA的细胞，并且不会传播到最初感染的细胞之外(图2A–2D).

这些实验表明，缺失突变狂犬病病毒的原位互补非常有效。最初的病毒感染仅限于TVA阳性细胞，与狂犬病病毒糖蛋白的交叉互补是传播到这些细胞之外所必需的，这种交叉互补足以将病毒感染从这些细胞释放到切片中它们周围的数千个其他细胞。

这些结果还表明，补体病毒能够从单个起始细胞传播到大量相邻神经元。由于基因枪技术的局限性，细胞在被射杀时通常是成簇射杀的，通常每片细胞都会产生多个红细胞；我们无法调整参数，以便每片转染一个或更少的神经元。尽管存在这种局限性，但在许多情况下，二次感染的神经元簇明显集中在单个DsRed2表达细胞上，如图2E–2H)以及图3A-3C). 表达DsRed2和EGFP的细胞位于EGFP阳性细胞簇的中心，包括具有抑制和兴奋神经元形态的细胞，这表明跨复合狂犬病病毒可以从任何一种细胞类型有效传播（另请参阅下面的配对记录数据）。

用配对记录测试突触特异性

观察到的绿色神经元簇，其中心有转染神经元(图2和图3)强烈提示病毒正在从单个细胞向突触前细胞进行跨突触前传播。为了测试病毒传播的突触特异性，我们从假定的突触前和突触后细胞进行了配对全细胞记录(图4). 在电压钳下记录红色通道（表示转染了TVA和狂犬病病毒糖蛋白）和绿色通道（表示感染了SADΔG-EGFP（EnvA）（红/绿细胞））中的细胞荧光，而在电流钳中记录附近的绿色细胞（感染了病毒传播），去极化至激发动作电位。电压钳制红/绿细胞中与绿细胞动作电位同步的突触电流表明存在单突触连接，如图4E和4J与红/绿细胞距离相近的非荧光细胞也被刺激作为对照。由于基因枪通常在一个切片内转染大量细胞，因此没有理想的情况下每块切片只转染一个细胞（见上文）。因此，我们建立了一个仅从红/绿细胞记录的标准，在250μm内没有其他红/绿电池。在11个被刺激的绿色细胞中，有9例（2例失败）在附近的红/绿突触后伙伴中检测到突触电流。在这九个连接对中，有五个激发了兴奋电流（例如。，图4J)而四个诱发的抑制电流（例如。，图4E). 与此形成鲜明对比的是，记录了9对控制对，每个控制对由红/绿细胞附近的非荧光神经元组成，但没有发现任何连接。为了进行比较，从大鼠大脑皮层的急性脑切片中随机取样的相邻神经元在大约10%-20%的时间或更少的时间内连接(汤姆森等人，2002年;Yoshimura等人，2005年)；没有与我们的实验条件相匹配的切片培养的可比较数据。

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病毒传播对最初感染细胞的突触前细胞具有特异性

（A） 靶向突触前和突触后神经元的切片和记录吸管的DIC图像，（B）组合荧光图像，以及（C–D）单通道荧光图像。（E） 假定突触后细胞中的抑制性突触后电流与附近感染细胞的动作电位一致，表明存在单突触连接。（F–J）向兴奋性突触前细胞扩散的类似证据。比例尺：100μm，适用于所有面板。

在我们的薄片培养系统中，理想的突触特异性测试包括每片只转染一个神经元，以及对大量EGFP阳性的假定突触前神经元之间的功能联系进行明确的生理测试。一些技术限制阻止了基于可用方法和资源的此类测试。首先，如上所述，我们无法使用基因枪将转染限制在单个神经元。因此，EGFP阳性神经元不能明确地与特定的、假定的突触后伴侣联系在一起。切片培养中存在大量的细胞死亡，这一事实使这个问题更加复杂，因此，即使出现了孤立的转染细胞，也有可能在观察之前就有第二个突触后神经元死亡。最后，突触接触可以瞬间形成，然后消除(De Paola等人，2006年)增加了在功能分析时标记未连接的细胞的可能性。因此，上述结果必须视为初步评估，并代表该系统特异性的下限。未来使用单细胞电穿孔和数百个突触前神经元的高通量刺激进行的研究可能会提供更明确的测量方法。

讨论

以前从未有过识别与感兴趣的群体单突触连接的细胞的方法，也从未有过通过任何数量的突触连接到单个起始细胞的跨突触标记细胞的方法。我们在这里介绍的系统兼具这两种功能。我们希望它能迅速在体内应用，如下所述，以回答连接和功能方面的主要悬而未决的问题，并开辟全新的研究途径。

这些体外实验结果证明了这一概念：原位互补产生的病毒传播非常有效，病毒可以可靠地从最初感染的神经元传播到切片中周围的数百个神经元。我们还证明，EnvA-伪型狂犬病病毒特异性感染TVA-表达神经元，因此有可能将最初的感染限制在基因定义的人群中。此外，我们证明可以从单个突触后母细胞标记突触前神经元。虽然我们不能常规地将生物列表转染限制在单个神经元上，但在某些情况下，在只有一个DsRed2表达神经元的切片中发现EGFP表达细胞（例如。，图3). 此外，由于皮层中已知的稀疏连接，即使在有几个可能的突触后细胞（DsRed2+EGFP表达）的情况下，绝大多数突触前（仅EGFP）细胞必须只连接到一个突触后电池。我们的配对录音也提供了重要的见解。它们表明，首先，病毒可以从单个细胞有效传播，其次，在绝大多数情况下，这种传播是直接向突触前细胞传播的。在这一点上，我们无法回答病毒是否最终会标记连接到给定起始神经元的每个细胞的问题，除非指出我们有限的配对记录数据，发现没有一个非绿色的细胞连接到附近的红/绿细胞。这个问题的答案将取决于系统的进一步测试和经验。

鉴于11个记录的绿色细胞中有2个未被发现与最近的转染细胞相连，对本文所述数据最令人不快的解释可能是，病毒在该系统中的传播大多是与突触前细胞直接相连。然而，由于此处用于测试的策略的局限性，有理由对该技术抱有更大的信心。如上所述，基因枪通常在切片中转染大量细胞，而不是理想的系统测试所需的单个细胞。因为，如中所示图3A，单个突触后细胞可以标记数百微米的细胞，我们怀疑这两个未被发现与记录的转染细胞相连的感染细胞与切片中的其他转染细胞相连接。一些转染细胞也可能死亡。测试该系统的更好方法是使用微注射或单细胞电穿孔法在每片细胞中只转染一个细胞(Haas等人，2001年;Rathenberg等人，2003年). 进一步的改进将是使用光学刺激假定的突触前细胞，以及控制，以获得比我们在这里管理的更高的吞吐量。这种严格的测试是必要的，也会受到欢迎。

然而，从根本上讲，我们没有理由相信此处使用的跨复合缺失突变病毒的传播比完整狂犬病病毒的传播具有更少的突触特异性，已发现狂犬病在跨突触传播中比更常用但更具细胞毒性的病毒更具特异性，α-疱疹病毒(乌戈里尼，1995年b;Ugolini等人，1987年).

这里展示的系统使用逆行传播的病毒，因此标记突触前神经元；由于突触后细胞和突触前细胞一样有趣，因此基于顺行传播的病毒建立类似的系统也是可取的。不幸的是，目前还没有已知的狂犬病病毒株或变异株能做到这一点。相比之下，α-疱疹病毒以其野生形式双向传播，而HSV-1追踪毒株H129似乎只是顺行传播(Rinaman和Schwartz，2004年;Zemanick等人，1991年). 尽管我们试图使用广泛使用的α-疱疹病毒伪狂犬病病毒来实现跨互补的想法，但收效甚微（数据未显示）——我们将失败归因于疱疹病毒相对于狂犬病病毒的高细胞病变和低效率(Card等人，1999年;Ito等人，2001年;Lafay等人，1991年;诺冠和雷曼，1998年;乌戈里尼，1995年;Ugolini等人，1987年)-也许值得重新审视这些努力。

在体内实施

我们系统的要求只是将TVA和狂犬病病毒糖蛋白的基因导入感兴趣的细胞，然后在表达TVA后应用伪型病毒。将这两个基因导入体内特定细胞类型有多种选择，例如转基因小鼠或使用带有细胞类型特异性启动子的辅助病毒(Davis等人，2001年;Gou等人，2004年;van den Pol等人，2004年). 单细胞电穿孔(Haas等人，2001年;Rathenberg等人，2003年)提供了将突触前细胞识别为单个已识别神经元的承诺，该神经元的活动和响应特性已被表征。结合脑片制备或体内光学方法，标记单个神经元的输入也应有助于研究功能特性和连接之间的相互作用，而目前基于随机抽样是不可能的。例如，标记的突触前细胞可以在记录突触后细胞的细胞内时受到刺激。这将克服在稀疏连接的结构（如大脑皮层）中发现突触前细胞的困难。

最后，重组狂犬病病毒当然可以包含除EGFP以外的任何感兴趣蛋白质的基因，这带来了无限的可能性。神经活动的基因编码传感器(Chanda等人，2005年;Reiff等人，2005年)例如，结合体内双光子成像(Helmchen和Denk，2005年)应能识别与最初识别的、具有功能特征的和电穿孔的突触后神经元直接相连的细胞的功能特性。相反，包含编码光敏离子通道的基因(Boyden等人，2005年;Li等人，2005年)应该允许突触前细胞的模式化刺激，同时从它们聚集的细胞中进行记录。反式激活剂或重组酶基因可以用于进一步指导突触耦合神经元中的基因表达，事实上，因为狂犬病病毒基因组中有足够的空间容纳更多的基因(McGettigan等人，2003年)，这些方法中的任何一种都可以结合使用。我们认为，这项技术及其衍生的技术可能会对神经科学产生重大影响。

实验程序

包装细胞系的生产

质粒pAB6中ASLV-A包膜蛋白的胞外和跨膜结构域(Boerger等人，1999年)和pHCMV狂犬病SAD B19糖蛋白基因的细胞质结构域(Sena-Esteves等人，2004年)通过PCR结合并克隆到小鼠白血病病毒（MLV）转移载体pCMMP-IRES-GFP中(Melikyan等人，2004年). 水泡性口炎病毒（VSV）-伪型MLV随后如所述产生(Melikyan等人，2004年)并应用于BHK-21细胞（ATCC），感染倍数（MOI）约为4。四次传代后，用FACSDiva（BD Biosciences，San Jose，CA）对细胞进行高EGFP荧光分选。由此产生的细胞系被命名为BHK-EnvARGCD。

伪狂犬病病毒的产生

BHK-EnvARGCD细胞在12孔板中以2E5个细胞/孔进行电镀。第二天，糖蛋白缺失狂犬病病毒SADΔG-EGFP(Wickersham等人，2007年)以1.5的MOI添加。一天后，将每个孔中的细胞进行胰蛋白酶处理，并重新放置到一个10 cm的板中。2天后收集含病毒上清液，过滤消毒，并在−80°C下将其冷冻在1ml等分中。通过连续稀释和隔夜感染293T-TVA800细胞测定病毒滴度(Narayan等人，2003年)3天后在FACscan（BD Biosciences）上测定荧光分数。

生物列表和病毒应用

如前所述，从3至7天龄大鼠的大脑皮层制备脑片，用于雪貂(Dantzker和Callaway，1998年;McAllister等人，1995年). 第二天，根据制造商的说明，使用Helios基因枪（加州Hercules Bio-Rad）转染切片。每12.5 mg金微载体使用以下质粒。对照组：pCAG-DsRed2，5μg；pCMMP-TVA800型(Narayan等人，2003年)，30微克。实验：pCAG-DsRed2，5μg；pCMMP-TVA800，30μg，pHCMV-RabiesG(Sena-Esteves等人，2004年)，15微克。除DsRed2外，所有转基因均在人巨细胞病毒（CMV）即时早期启动子的控制下表达，DsRed1由CAG杂交启动子驱动(Borrell等人，2005年;Niwa等人，1991年). 转染后的第二天，将20μl病毒储备液（7.8E4 pfu/ml）涂在每片切片的表面。

电生理记录

在应用病毒后的三到九天，将切片转移到用室温人工脑脊液（ACSF）灌注的记录室中，ACSF由124mM NaCl、5mM KCl、1.25mM KH组成2人事军官4，1.3 mM硫酸镁4，3.2 mM氯化钙2，26 mM氯化钠三和10 mM葡萄糖。玻璃记录电极（7–10 MΩ电阻），填充由130 mM葡萄糖酸钾、6 mM KCl、2 mM MgCl组成的细胞内溶液2，0.2 mM EGTA，10 mM HEPES，2.5 mM Na2ATP，0.5 mM钠2GTP、10 mM磷酸肌酸钾和0.3%生物细胞素，用KOH调节至7.25 pH值，用于全细胞电流灯记录。使用荧光和DIC光学靶向细胞。

在用于测试细胞对之间功能连接的成对记录中，潜在突触前细胞记录在电流钳中，潜在的突触后细胞记录在电压钳中。电流注入突触前细胞产生动作电位。从负保持电位对突触后细胞进行常规测试，以检测兴奋性突触后电流和去极化电位，以检测抑制电流和/或“沉默”突触。当突触前细胞中的单棘波产生后未检测到突触后电流时，则使用较长时间的注入电流来产生序列。

致谢

我们感谢Cristina Garcia-Frigola博士的技术援助，感谢Lynn Enquist博士的伪狂犬病病毒库存，感谢Miguel Sena-Esteves博士的pHCMV-RabiesG。这项工作得到了国家卫生研究院拨款编号MH63912、EY10742和CA70810以及德国联邦基金会拨款编号SFB455和SPP1175的支持。

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