简介
组织组织的干细胞模型假设，少量祖细胞维持组织的自我更新和组织结构（由Beachy等人，2004年;克拉克和富勒，2006年). ESCs和成人组织干细胞自我更新和产生多种细胞系的独特能力形成了“干细胞”的基本定义。越来越多的证据表明，癌症可能具有等效的癌症干细胞，定义为在系列移植实验中能够启动和维持肿瘤生长和异质性的一小部分细胞(Al-Hajj等人，2003年;Bonnet和Dick，1997年). 如果癌症真正由少数癌症干细胞维持，那么识别、靶向和消除癌症干细胞的能力对癌症诊断和治疗至关重要。有理论认为，癌症发生的一个关键事件可能是通常仅限于干细胞的自我更新机制的不适当激活。然而，目前尚不清楚正常干细胞程序的激活是否是常见人类上皮癌的普遍特征或必需因素。
鉴于正常干细胞在组织维持中的独特作用，最近的证据表明干细胞命运具有惊人的可塑性。几种类型的成人组织干细胞明显可以重新编程为其他谱系的细胞类型(Slack，2007年). 此外，引入四个基因，c-Myc，10月4日，Sox2、和Klf4公司在小鼠或人类成纤维细胞中，足以对其进行重新编程，使其具有与真正的ESC无法区分的多能性(Takahashi等人，2007年;高桥和山中，2006年). 这些发现增加了其他类型干细胞的可能性，包括癌症干细胞，可能是由适当的基因组合实验产生的。
一些研究试图定义“茎”的核心转录程序，但结果一直存在争议(Fortunel等人，2003年;Ivanova等人，2002年;Ramalho Santos等人，2002年). Fortunel等人比较了三项独立研究中ESCs、神经干细胞（NSCs）和造血干细胞（HSCs）的共享微阵列表达谱，他们发现这三项研究中只有一个基因共享。无法在逐个基因的分析中定义一致的干细胞特征，这可能表明不同类型的干细胞利用不同的机制来实现自我更新和多能性。或者，未能识别出可靠的特征可能是由于干细胞分离、细胞纯度、微阵列平台或统计分析方法的技术差异。因为基因级分析的交集更容易产生噪音，并且固有地受到考虑中技术较差的数据集的限制(图片和2005年2月;Segal等人，2004年;Subramanian等人，2005年)我们假设，高阶系统级分析可以改进干细胞转录程序的组织和分类。这里，我们使用一种称为基因模块图(Segal等人，2004年)确定ESCs和成人组织干细胞的共享表达程序，重点关注多个独立观察一致支持的基因组（称为模块）。我们发现成人组织干细胞可以分为两大组，其中一组与ESCs共享核心转录程序。此外，ESC样转录程序在侵袭性人类上皮癌中经常被激活。c-Myc公司是唯一能够在成人上皮细胞中激活ESC样转录程序的基因，在适当的遗传背景下赋予人类癌症干细胞的基本属性体内.
结果
胚胎和成人组织干细胞相关的基因模块图
为了系统地将ESCs、成体干细胞、疾病状态和调控这些程序的关键途径之间的基因表达程序联系起来，我们创建了一个模块映射干细胞基因(). 我们整理了一份小鼠干细胞数据概要，包括102个小鼠ESCs、NSC、HSC、视网膜干细胞、神经嵴干细胞、毛发隆起干细胞、乳腺干细胞和各种分化细胞的全基因组表达谱(表S1). 我们还汇编了3000多个基因集，包括小鼠干细胞与其分化对应物之间差异表达的特征基因，基因组染色质免疫沉淀（ChIP-ChIP或ChIP-PET）定义的关键干细胞转录因子所占据的基因，由RNA干扰定义的关键干细胞因子进行功能调节的基因，以及编码具有共享功能的蛋白质的基因，如基因本体论和KEGG途径中的基因(表S2). 基因模块图能够无偏见地发现在一种或多种类型的干细胞中协调但可能微妙调控的基因，这些基因得到了多种功能标准和独立、可重复观察的支持（参见补充文本).
干细胞的基因模块分析（A） 干细胞基因模块分析步骤的流程图。
（B） 小鼠干细胞基因模块图：基因集（行）与表达阵列（列）的矩阵，其中红色（或绿色）条目表示基因集中的单个基因在表达阵列中被显著诱导（或抑制）的概率高于预期（FDR<0.05，p<0.01）。每个条目的强度对应于数组中基因集内所有基因的平均折叠变化。这些阵列被标记为分化细胞或干细胞类型。显示了重要基因集的子集；为了清楚起见，删除了多余的基因集。由基因本体术语定义的基因集以黑色列出；由干细胞和分化细胞表达阵列定义的已发表基因集以紫色列出；RNA干扰实验定义的基因集以橙色列出；全基因组染色质免疫沉淀实验定义的基因集以蓝色列出。注意两组干细胞的聚集，标记为“类ESC”和“成人组织干”。
小鼠干细胞基因的模块图显示至少存在两类不同的成人组织干细胞(). 我们发现，四项独立研究的小鼠ESC、三项独立研究中的NSC、胎肝HSC和视网膜干细胞通过类似基因集（统称为“类ESC”）的协同激活聚集在一起，证明ESCs和成体组织干细胞的子集共享强大的转录程序。有趣的是，ESC样信号并非由任何下调基因集组成，这表明受抑制的基因不是共享的，而是在不同类型的干细胞之间赋予特异性。ESC样基因集包括先前在ESCs和NSCs中定义的几种干细胞特征，以及ChIP-PET在ESCs中由Oct4和Nanog占据的选择基因，以及由10月4日，纳克，或Sox2系统在ESC中。一项研究确定的基因特征在其他小组的独立研究中得到了显著的重述，证明了基因模块图在识别共享表达模式方面的优势。将每个基因集中的成员基因组合在一起，形成小鼠ESC样模块（FDR<0.05，p<0.001；表S3). 类ESC模块包含许多转录调控因子，特别是一些与多能性相关的转录调控因子包括Sox2、c-Myc、Dnmt1、Cbx3、Hdac1、和2014年10月1日和纳克不在ESC类模块中，因为它们在ESC中特别表达。这一结果表明，由这些关键ESC调节器介导的部分转录程序，10月4日和纳克，可以通过替代机制在其他干细胞中进行调节。
相反，大多数成人组织干细胞，包括骨髓造血干细胞、神经嵴干细胞、毛发隆起干细胞和乳腺干细胞，通过协调激活不同的基因集（统称为“成人组织干”）聚集在一起(). 来自三项和两项独立研究的骨髓造血干细胞和毛发隆起干细胞分别聚集在一起，表明基因模块图方法准确地聚集了干细胞转录模式。例如，根据两项研究的定义，在毛发隆起干细胞中诱导的基因通过相互阵列中的激活进行交叉验证，并且在骨髓造血干细胞、乳腺干细胞和神经嵴干细胞中相对于其分化的对应物诱导基因。有趣的是，三项独立研究所描述的NSC与ESC聚集在一起，而第四项研究中的NSC则与成人组织干细胞聚集在一起；造成这种差异的原因目前尚不清楚。将每个基因集中的成员基因组合在一起，形成小鼠成体组织干基因模块（FDR<0.05，p<0.001，表S4). 值得注意的是，成人组织干模块中填充了许多分化转录调控因子，例如霍克斯基因，《服务贸易总协定》和叉头家族转录因子、组蛋白甲基转移酶MLL家族和谱系特异性调节因子，如休息因此，基因模块图显示了两类不同的干细胞，我们称之为“类ESC”和“成人组织干细胞”。
为了验证小鼠中定义的干细胞基因模块并识别进化中保守的功能子集，我们将我们的基因模块图分析应用于人类干细胞转录谱概要(图S1A). 与小鼠干细胞模块图类似，我们首先整理了人类干细胞数据概要，包括人类胚胎干细胞、胚胎癌细胞和各种分化细胞的全基因组表达谱(表S1). 我们还汇编了3000多个基因集，包括人类胚胎干细胞及其分化对应物之间差异表达的特征基因，基因组染色质免疫沉淀实验定义的关键干细胞转录因子所占据的基因，以及编码具有共享功能的蛋白质的基因，比如基因本体论和KEGG途径(表S2). 人类干细胞基因的模块图显示了一个健壮的人类ESC样基因模块，该模块是在两项关于人类ESCs和胚胎癌的独立研究中诱导的（成员基因列于表S5FDR<0.05，p<0.0001）。重要的是，人类ESC样模块与小鼠ESC样组件重叠显著（p<10-83超几何分布；图S1B)，但不适用于小鼠成体组织干模块。我们将小鼠和人类之间共享的335个基因定义为核心类ESC基因模块(表S6).
一个重要的警告是，许多干细胞是在培养基中生长的，而培养基中干细胞最一致和最期望的反应之一是增殖。因此，干细胞，特别是ESC模块中表达程序的某些一致性可能是由于增殖基因。因此，我们确定了与增殖直接相关的基因的贡献以及在培养中暴露于血清(Chang等人，2004年;Whitfield等人，2002年). 核心ESC样模块和成人组织干模块中的少数基因（分别为31%和5%）先前已被证明在细胞周期中具有周期性表达，或在对血清的反应中被诱导。值得注意的是，两个干细胞模块都不包含在细胞周期的S期和G2/M期转录诱导的任何基因(Whitfield等人，2002年). 此外，去除与增殖相关的基因集不会影响ESC样干细胞阵列的聚集或小鼠和人类ESC样模块之间的保存，这表明ESC样组件不仅仅是增殖的标志。
ESC模块在人类癌症中的广泛激活及其对癌症预后的影响
以前的研究表明，在肿瘤样本中可以检测到来自少数细胞群体的细胞类型特异性转录物(Perou等人，2000年)这表明在肿瘤的表达谱中可以检测到特定的肿瘤干细胞特征(Liu等人，2007年). 为了研究干细胞表达特征在人类癌症中是否被激活，我们检测了包含核心干细胞特征的基因在“人类癌症简编”中的表达，该简编公开了多种人类癌症及其相应正常组织的表达谱(Segal等人，2004年). 与相应的正常组织相比，ESC样基因模块在各种人类癌症中显著激活，在与癌症相关的各种正常组织中受到抑制(). 相反，成人组织干基因模块具有相反的模式：在与癌症相关的各种正常组织中激活，在与正常组织相关的各种人类癌症中被抑制。因此，这些结果表明，多种人类癌症表现出ESC样的表达模式。
ESC模块在人类癌症中的激活（A） 癌症基因模块图：一个由干细胞基因模块（列）和阵列临床注释（行）组成的矩阵，其中红色（或绿色）条目表示相应模块显著诱导（或抑制）的阵列中包含的具有给定注释的阵列多于偶然预期的阵列（FDR<0.05，p<0.01）。条目的强度与重要性相对应，即−log10（p值）。显示了重要注释的子集；为了清晰起见，删除了多余的注释。
（B-D）ESC样基因在原发性人类肿瘤和相应正常组织中的表达模式是通过层次聚类来组织的。注意正常组织和癌组织中基因的协调调控。每个数据顶部的树状图表示样本中ESC样基因表达的相似性。肿瘤以黑色分支表示，正常组织以绿色分支表示。（C）和（D）中的数据显示了根据ESC样模块的表达将肿瘤分为两类的Kaplan-Meier生存曲线。
（E） 平均日志2先前发表的正常乳腺和FACS分类的CD44+CD24-/低致瘤性乳腺癌细胞表达阵列中ESC样模块中所有基因的表达值(Liu等人，2007年). 每个样本都会显示一条线，指示所有样本的平均表达值。
（F） Pearson值与CD44+CD24-/低致瘤性乳腺癌细胞特征的平均对数相关性2ESC样模块在原发性乳腺癌中的表达价值如（C）所示。
为了研究不同程度的ESC样模块激活是否对人类癌症有临床意义，我们检测了295例原发性人类I期和II期乳腺癌中ESC样基因的表达(van de Vijver等人，2002年). 表达谱是双相的，可以将这些肿瘤分为两类：ESC激活的和ESC表达的(). 具有ESC激活特征的原发性乳腺癌与较差的肿瘤分化显著相关（p<10-16; 数据未显示），与表达干细胞样表型的癌症一致。此外，这些ESC信号激活的肿瘤更有可能发生转移和死亡（p<10-4且p＜10-6分别为；). 因此，ESC样信号是人类乳腺癌预后的有力预测因子。对患者年龄、肿瘤直径、肿瘤分级、雌激素受体状态、淋巴结状态、血管侵犯状态、乳腺切除术与保乳治疗、是否使用化疗、是否使用激素治疗、圣加仑标准和国家卫生研究院共识标准进行多变量分析，证实ESC样信号是转移和死亡的独立预后因素（危险比分别为1.7，p<0.02和2.2，p<0.001）。我们还检测了71例I期和II期肺腺癌患者中ESC样基因的表达(Bhattacharjee等人，2001年). 表达谱是双相的，与ESC再表达特征的肿瘤相比，具有ESC激活特征的肿瘤的死亡风险显著增高（p<0.03；). 这些数据表明，ESC模块的激活程度与多种肿瘤类型的分化不良、转移风险和死亡率增加有关。
上述检查的所有人类癌症表达阵列数据均来自肿瘤组织。然而，多项研究表明，在免疫缺陷小鼠体内移植的基础上，只有一小部分癌症细胞具有启动和维持肿瘤生长和异质性的独特能力(Al-Hajj等人，2003年;Bonnet和Dick，1997年). 为了确定ESC样基因表达程序是否可以在致瘤性肿瘤干细胞亚群中表达，我们首先检测了乳腺癌细胞CD44+CD24-/低亚群中ESC样蛋白基因模块的表达，这些细胞是唯一富集肿瘤干细胞的细胞(Liu等人，2007年). Liu等人之前根据这些富集的致瘤性乳腺癌细胞群相对于正常乳腺组织的特征定义了基因表达特征。这个184基因的特征与我们的335基因核心类ESC基因模块只有四个基因重叠。然而，尽管流式分选群体仅部分富集癌症干细胞，但在六种独立乳腺癌的CD44+CD24-/低群体中，有两种群体的ESC样基因模块相对于正常乳腺组织显著上调()这表明ESC样信号可能在癌症干细胞群体中被激活。我们还研究了这两种特征在一组独立的原发性人类乳腺癌中的共同调节(van de Vijver等人，2002年). 引人注目的是，ESC样信号的表达与这些原发性人类乳腺癌中富含肿瘤干细胞CD44+CD24-/低亚群信号的表达显著相关（R=0.52，p<10-21;). 因此，这些结果表明，ESC样信号可能在癌细胞的致瘤部分被激活。
c-Myc激活成人上皮细胞中的ESC模块
为了进一步了解ESC类模块可能被直接调控的机制，我们进行了如下计算筛选顺式-在ESC类模块基因中富集的调控基序。我们分析了所有903个单路、双路和三路组合顺式-TRANSFAC中的调控基序或通过进化保守性识别(Sinha等人，2008年). 在ESC类模块基因中显著富集的顶部基序或基序组合列于表S7。值得注意的是顺式-在丰富列表顶部出现最多的调控基序包括c-Myc（Myc、MAX和Myc/MAX二聚体的结合基序）和HNF1（HNF1、HNF1:SP1对和HNF1:KROX对的结合基模）。结合之前的数据显示c-Myc对于维持小鼠ESC自我更新是必要的和足够的(Cartwright等人，2005年)它是四个足以对小鼠和人类成纤维细胞进行重新编程的基因之一，以赋予与真正的ESC无法区分的多能性(Takahashi等人，2007年;高桥和山中，2006年)，这个没有偏见顺式-调控基序分析表明c-Myc可能是ESC样程序的主要调控因子。
基于这一结果，我们接下来检查了c-Myc的基因表达谱以及四条其他致癌途径(图片等，2006年). 有趣的是，我们发现c-Myc，而不是其他致癌蛋白，如Src、β-catenin、E2F3和Ras，可以协同诱导原代人类乳腺上皮细胞中ESC样模块的表达(). c-Myc也基本上使成人组织干细胞基因模块失活(). 这一结果表明c-Myc可能在这些明显相互排斥的转录程序之间起到转换的作用。我们同样观察到c-Myc在原代人成纤维细胞和未转化的乳腺上皮细胞系中诱导ESC样模块(图S2A、S2B;Adler等人，2006年;Coller等人，2000年). 此外，335个（26%）ESC样模块基因中的88个先前已被确定为c-Myc靶点(http://www.myc-cancer-gene.org/). 要扩展此结果体内，我们详细研究了局部应用三苯氧胺诱导表皮c-Myc后的转录反应K14-Myc-ER型转基因小鼠(Frye等人，2003年)全身注射三苯氧胺在胰腺β细胞中的表达计划-Myc-ER转基因小鼠(劳勒等人，2006年). 与培养细胞的结果一致，Myc-ER激活协同诱导ESC样模块(,S2C公司). 此外，Myc-ER激活使成人组织干模块沉默(). 以前的研究已经证明表皮中c-Myc的诱导会阻碍毛囊干细胞的功能(阿诺德和瓦特，2001年;Waikel等人，2001年). 因此，我们对成人组织干细胞模块（毛发隆起干细胞的特征）沉默的发现预测了先前观察到的生物表型，并验证了基因模块方法。此外，这些发现表明c-Myc诱导的意外结果是成年上皮中ESC样模块的重新激活。
c-Myc激活上皮细胞中的ESC模块（A） ESC样模块基因（不包括增殖基因）在先前发表的原代人乳腺上皮细胞表达阵列中的表达GFP公司(图片等，2006年). 每行代表类ESC模块中的单个基因，每列是一个表达式数组。每个样本中每个基因的表达水平与转染细胞中该基因的平均表达水平相关GFP公司使用红绿色色标表示。（B） 平均日志2ESC-like基因模块中所有基因的表达值均表示为平均值±SEM。（C）平均对数2成人组织干基因模块中所有基因的表达值均表示为平均值±SEM。
（D） ESC样模块基因（不包括增殖基因）在先前发表的c-Myc诱导的表皮表达阵列中的表达K14-Myc-ER型转基因小鼠，局部应用三苯氧胺后1天和4天(Frye等人，2003年). （E） 平均日志2ESC-like基因模块中所有基因的表达值均表示为平均值±SEM。（F）平均对数2成人组织干基因模块中所有基因的表达值均表示为平均值±SEM。
c-Myc激活人类癌症中的ESC模块并诱导上皮性肿瘤起始细胞
为了确定c-Myc诱导的ESC模块激活在人类癌症中的后果，我们求助于一个基因定义的，体内人上皮癌模型。原发性癌基因转导的原代人角质形成细胞Ras公司和NF-κB阻遏物的稳定突变体IκBα然后将其移植到免疫缺陷性scid小鼠上，产生分化良好的鳞状细胞癌（SCCs），与真正的人类病变在表型上难以区分(Dajee等人，2003年). 我们用逆转录病毒转导的原代人角朊细胞致癌Ras公司和IκBα，再加上GFP、E2F3，或c-Myc公司.E2F3型作为控制癌基因，因为它促进增殖但不激活ESC样模块(). 注入5×105每个基因组合的转导角质形成细胞以100%的效率导致肉瘤形成，但在基因表达和组织学上存在显著差异。首先，微阵列分析表明，c-Myc，而不是GFP或E2F3，导致生成的SCC中ESC样模块的强烈和协同激活，表明c-Myc的表达足以激活人类上皮性肿瘤中的ESC样组件体内(). 例如，c-Myc诱导SOX2标准是胚胎干细胞中的关键转录调控因子。除了激活特定基因外，ESCs还具有沉默谱系特异性发育调节因子的特征，通常以组蛋白H3 K4和K27甲基化的“双价”染色质域为标志。在先前描述的“二价”染色质结构域中的87个基因中(Bernstein等人，2006年)在我们的表达阵列上有49个；在这49个基因中，有26个基因的表达发生了显著变化，除了两个基因外，其他基因在c-Myc-Ras-IκBα肿瘤中的表达均受到抑制(). 因此，c-Myc表达导致典型ESC二价基因的转录沉默，例如HOX公司基因。引人注目的是，c-Myc-Ras-IκBα肿瘤也特异性激活了癌干细胞的基因表达特征，如CD44+CD24-/低密度人群所定义的(;Liu等人，2007年)表明c-Myc-Ras-IκBα肿瘤中的癌干细胞数量增加。因此，这三个独立的基因信号——类ESC模块、ESC二价基因和富含肿瘤干细胞的CD44+CD24/低细胞信号——表明癌细胞重新编程到类似ESC和潜在癌症干细胞的状态。
c-Myc在癌症中诱导ESC样状态来自转导的原代人角质形成细胞的皮下scid小鼠肿瘤，表达所示蛋白：
（A-C）每行代表一个单独的基因，每列是皮下肿瘤的表达阵列。每个样本中每个基因的表达水平相对于其在所有样本中的平均表达进行了标准化，并使用红绿色色标表示。
（A） ESC样模块中基因的RNA表达。
（B） ESCs中双价染色质结构域受抑制基因的RNA表达(Bernstein等人，2006年).
（C） 富含肿瘤干细胞的CD44+CD24-/低癌细胞亚群特征基因的RNA表达(Liu等人，2007年). CD44+CD24-/低信号由被诱导和抑制的基因组成，如右边的栏所示（红色被诱导；绿色被抑制）。
（D） 皮下肿瘤组织学。
（E） 皮下肿瘤分级。
（F） 皮下肿瘤组织：角质形成细胞分化标记物角蛋白5（K5）、角蛋白10（K10）、谷氨酰胺转胺酶1（Tgase）和角蛋白8（K8）的蛋白表达均为橙色。Hoechst 33342蓝色细胞核染色。
c-Myc公司-转导的肿瘤在组织学外观上也有显著差异(). 尽管E2F3-Ras-IκBα肿瘤具有高频率的有丝分裂像，但与对照组GFP-Ras-I K Bα肿瘤一样，它们是分化良好的鳞状细胞癌，以有丝分裂活跃的细胞粘附在基底膜上为特征，基底膜分层形成嗜酸性细胞，核质比和角蛋白螺旋降低(和S3A系列; 数据未显示）。相反，c-Myc-Ras-IκBα肿瘤形成低分化肿瘤，主要由核多形性的嗜碱性细胞和高核质比的异型性细胞组成。此外，c-Myc公司-转导的肿瘤显示出缺乏分层和组织极性。一位不知道基因型的皮肤病理学家对组织切片上的肿瘤分级证实了c-Myc过度表达的肿瘤分化不良(). 免疫荧光染色显示c-Myc-Ras-IκBα肿瘤失去分化表皮标记物的表达，包括谷氨酰胺转胺酶1和角蛋白10()证明c-Myc足以抑制角质形成细胞衍生癌的分化。c-Myc-Ras-IκBα肿瘤保留角蛋白5和14，角蛋白由包含表皮干细胞的皮肤表皮基底细胞室表达，表明它们仍然表达角蛋白细胞谱系的未分化标记(; 数据未显示）。此外，c-Myc-Ras-IκBα肿瘤激活角蛋白8的表达，角蛋白8是简单上皮的标记物，表明c-Myc诱导去分化(). 同样的组织学结果也见于来自转导的角质形成细胞的肿瘤，这些细胞被放置在失活的真皮上并移植到scid小鼠上（数据未显示）。
c-Myc诱导ESC样转录程序和肿瘤去分化的能力增加了c-Myc促进上皮癌干细胞形成的可能性。因此，我们进行了限制稀释分析，以确定c-Myc是否足以增加上皮性肿瘤起始细胞的比例(). 将转导的角质形成细胞从5×10稀释为10倍5皮下注射到scid小鼠前50个细胞。带5×105与转导GFP-Ras-IκBα的细胞相比，注射细胞c-Myc或E2F3的共同表达产生的肿瘤生长速度更快，证实了c-Myc和E2F3在肿瘤大规模增殖中的预期作用(). 带5×104注入细胞，两者E2F3型-和GFP公司-与对照组相比，转导肿瘤生长速度慢得多，形成肿瘤的效率低得多c-Myc公司-转导肿瘤(). 引人注目的是，所有16次注射均为5×10三c-Myc-Ras-IκBα细胞形成肿瘤，而注射5×10三GFP-Ras-IκBα或E2F3-Ras-I激酶Bα细胞形成肿瘤(). 事实上，在17次注射中，只有500个c-Myc-Ras-IκBα细胞足以形成肿瘤(). 所有形成的c-Myc-Ras-IκBα肿瘤在组织学上与用5×105单元格(图S3B). 基于泊松分布(Fazekas de St，1982年)我们估计c-Myc使成功的肿瘤起始事件频率从1/330000增加到1/2200，效率提高了150倍。接下来，我们进行了三个c-Myc-Ras-IκBα肿瘤的系列再移植实验，这些肿瘤来源于最初注射的500个细胞，以及两个GFP-Ras-IκBβ肿瘤。首次注射后6周，将肿瘤切除，消化成单细胞悬浮液，然后重新注射到新受体scid小鼠中。GFP-Ras-IκBα肿瘤的两次注射均未形成继发肿瘤。相反，c-Myc-Ras-IκBα肿瘤的三种注射都形成了组织学与原肿瘤相同的继发肿瘤(图S3C)以及相同的生长动力学，为实验创建的肿瘤起始细胞的自我更新能力提供了进一步证据。因此，c-Myc足以诱导癌症干细胞数量的急剧增加。
c-Myc增加肿瘤起始细胞的比例左图：皮下注射表达所示蛋白的转导的原代人角质形成细胞后形成的肿瘤的生长动力学（平均值±SEM）。右图：scid小鼠皮下肿瘤的代表性图片：左侧为c-Myc+Ras+IκB肿瘤，右侧为GFP+Ras+IκB肿瘤。（A） 5×105每次皮下注射的细胞数。照片拍摄于注射后第18天。（B） 5×104细胞。GFP+Ras+IκB的生长动力学是形成的一个肿瘤。E2F3+Ras+IκB的生长动力学是所形成的两个肿瘤的平均±SEM。照片是在第20天。（C） 5×10三细胞。图为第28天。（D） 5×102细胞。Myc+Ras+IκB的生长动力学是形成的三个肿瘤的平均±SEM。照片是在第45天。
表1
| #每次注射的细胞数
|
|---|
| 基因型 | 5 × 105 | 5 × 104 | 5 × 10三 | 5 × 102 | 5 × 101 |
|---|
| GFP+Ras+IκB | 3/3 | 1/7 | 0/10 | 0/10 | 0/10 |
| E2F3+Ras+IκB | 3/3 | 2/5 | 0/12 | 0/12 | 0/10 |
| c-Myc+Ras+IκB | 3/3 | 7/7 | 16/16 | 3/17 | 2017年0月 |
c-Myc-介导的肿瘤启动是细胞自主的，与基因组不稳定无关
c-Myc可能通过增加肿瘤起始细胞（种子）的比例或效率来增加肿瘤起始的成功率；或者，c-Myc可以通过改变肿瘤微环境（土壤）来增强肿瘤干细胞的生态位。为了区分这些可能性，我们进行了一个细胞混合实验。如极限稀释分析中所示，5×104GFP-Ras-IκBα细胞形成肿瘤的速度和效率远低于5×104c-Myc-Ras-IκBα细胞。我们混合了5×104c-Myc-Ras-IκBα细胞和5×104GFP-Ras-IκBα细胞，然后将这些细胞皮下注射到scid小鼠体内(n个=3). 由此产生的肿瘤在组织学上与单独注射c-Myc-Ras-IκBα细胞的肿瘤完全相同，并且仅来源于c-Myc公司-转导细胞(). 缺乏GFP-marked、non的推广-c-Myc公司转基因细胞表明，c-Myc对肿瘤起始的显著改善是一种细胞自主效应，因此可能是由于诱导肿瘤起始细胞的作用。
c-Myc介导的肿瘤是细胞自主的，与基因组不稳定性无关（A） 注射5×10的scid小鼠皮下肿瘤4转导的原代人角质形成细胞表达GFP、Ras和IκB（100%GFP+Ras+IκB），5×104表达c-Myc、Ras和IκB（100%Myc+Ras+IκB）的细胞，或2.5×104表达GFP、Ras和IκB加2.5×10的细胞4表达c-Myc、Ras和IκB的细胞（50%GFP+Ras+IκB，50%Myc+Ras+IκB+）。GFP抗体的组织学和免疫组化。（B） 使用基于阵列的比较基因组杂交技术，以图形方式显示皮下肿瘤的全基因组DNA拷贝数变化。比率绘制在日志上2根据染色体位置进行缩放。
除了在基因调控中的作用外，c-Myc的表达还可以在某些环境下诱导基因组不稳定(费尔谢尔和毕晓普，1999年). 这些结果的另一种可能解释是从头开始中的突变c-Myc公司-转基因细胞，导致获得肿瘤起始活性。为了评估这种可能性，我们对所有三种基因型的野生型细胞和肿瘤进行了基于阵列的比较基因组杂交，没有发现任何肿瘤中存在显著的基因组扩增或缺失的证据(). 因此，c-Myc-Ras-IκBα肿瘤中肿瘤起始细胞的增加并不是由于基因组不稳定性的诱导。虽然这些结果并不排除c-Myc可能有助于肿瘤发生的额外功能，但它们支持c-Myc介导的肿瘤发生激活可能是直接发生的这一观点。
讨论
干细胞作为生物发现引擎的模块图
通过组装和关联ESC和不同组织干细胞的基因表达特征，我们创建了一个模块图，可以整合不同的数据来源，并揭示干细胞群体转录程序之间的高阶关系。基因水平分析未能观察到不同实验室鉴定的干细胞特征之间基因表达的共性(Fortunel等人，2003年)模块图能够系统地组织ESC和各种成人组织干细胞，这些细胞由至少两个或多个实验室与其预期的生物邻居进行分析。此外，这张地图证实了没有一个单一的“干细胞”程序在所有干细胞中共享。相反，选择的组织干细胞，尤其是胎肝干细胞、视网膜干细胞和神经干细胞的子集，与胚胎干细胞共享核心转录程序。NSC和视网膜干细胞是唯一被检测出共享ESC模块的正常成人干细胞，这一发现很有意思，可能与以下事实有关：神经化是发育过程中的默认（可能是基态）外胚层命运(Weinstein和Hemmati-Brivanlou，1999年). 相反，大多数被检测的成人组织干细胞，包括神经嵴、毛发隆起、骨髓造血干细胞和乳腺干细胞，都有一个独特的转录程序。该图还定义了这两个干细胞模块的基因组成，这为进一步研究这两个不同干细胞类别的独特分子网络奠定了基础。
除了对不同类型的干细胞进行分类外，基因模块图还促进了干细胞转录程序与人类癌症的联系以及对其控制的机制研究。我们发现ESC样模块在许多侵袭性人类上皮癌中被诱导；ESC模块可以由c-Myc诱导，产生高致瘤性细胞，只需500个细胞即可引发癌症。通过将表达特征模块用作“指纹”，而不是仅仅依赖于几个分子标记，该图可用于建立改进的干细胞分类和定义标准。还需要进一步的研究来确定ESC样信号作为肿瘤干细胞标记物的特异性。此外，该图还可用于询问有关干细胞表达程序在其他疾病状态和正常发育中的作用的其他问题。
通过重新激活ESC转录程序诱导上皮性肿瘤起始细胞的实验研究
由于假定的癌症干细胞的纯化部分可以用几百个细胞启动肿瘤生长，而来自大块肿瘤的数十万个其他细胞则不能，因此癌症干细胞可能是癌症建立和转移的关键来源细胞。我们表明，通过c-Myc介导，在原代人角质形成细胞中重新激活ESC样转录程序，能够产生能够启动上皮肿瘤生长的细胞，其效率与真正的癌症干细胞相当，至少符合当前标准的定义。我们定义的ESC样转录程序具有临床相关性，因为它在人类上皮癌中经常被激活，并预测癌症转移和死亡。此外，从真正的人类癌症中纯化的肿瘤起始细胞中富含ESC样基因模块。我们的研究结果表明，成年上皮细胞中ESC样转录程序的不当激活可诱导上皮性肿瘤起始细胞。因为以前对白血病干细胞的研究已经证明HSC转录程序的重新激活(Krivtsov等人，2006年)据预测，组织特异性成人干细胞程序的重新激活可能是不同上皮癌的癌干细胞的基础。然而，成年上皮细胞中一种ESC特异性转录因子Oct4的异位激活会导致异型增生(Hochedlinger等人，2005年)这表明ESC类转录程序的非谱系激活可能促进癌症。我们的结果支持了后一种观点，并表明ESC样模块激活在常见的人类上皮癌中普遍存在。肿瘤起始细胞数量的增加和转移潜能之间的关系令人感兴趣，但其机理还需要进一步研究。
实验性地创造具有多种上皮癌干细胞特性的细胞的能力具有几个潜在的重要意义。目前，从人类肿瘤中纯化肿瘤干细胞受到患者异质性以及新鲜和大容量肿瘤样本可用性的限制。此外，目前的标记物可以富集但不能完全纯化人类肿瘤干细胞。我们的发现为获得上皮癌干细胞提供了另一种途径，为改进癌症诊断和治疗提供了许多新的可能性。例如，基因诱导的肿瘤起始细胞的基因表达谱可用于识别在该人群中富集的细胞表面或分泌蛋白，可用于指导早期癌症的识别、进一步纯化和基于血液的检测。实验创建的肿瘤起始细胞的统一来源也可用于药物筛选，以确定特定靶向癌症干细胞的化合物。此外，癌症研究的一个关键目标是确定癌症干细胞产生和自我更新的机制。实验创建和基因定义的肿瘤起始细胞提供了解剖这些过程的时间和功能动力学的可能性。
c-Myc作为干细胞转录程序的开关
c-Myc公司代表可能在正常干细胞生物学中发挥作用的几种致癌基因之一，也可能促进癌症干细胞的形成。我们的发现是，c-Myc激活了ESC样程序，但下调了成人组织干细胞程序，这与之前的研究一致，这些研究表明，持续的c-Myc促进ESC和癌症的自我更新并阻止分化，但相反，随着毛发隆起和骨髓中干细胞的耗竭而促进分化(Arnold和Watt，2001年;Arvanitis和Felsher，2006年;Cartwright等人，2005年;Waikel等人，2001年;Wilson等人，2004年). 最近发现c-Myc是足以将小鼠或人类成纤维细胞重新编程为胚胎干细胞的四个关键基因之一，这突显了c-Myc作为ESC命运执行者的重要性。这种独特的功能可能与c-Myc对染色质进行全局重编程的能力有关(Knoepfler等人，2006年;Wu等人，2007年). 肿瘤干细胞的概念最近受到了小鼠淋巴瘤中常见（>1/10）肿瘤起始细胞的观察的挑战(Kelly等人，2007年)；有趣的是，最大的影响来自Eμ-Myc公司模型。我们的数据为这些发现提供了潜在的解释，并加强了c-Myc公司作为致癌基因。
我们的结果表明，类ESC程序不仅仅是一个扩散特征。ESC-like程序源自一个没有与增殖相关基因集的基因模块图，在多种人类癌症中被激活，并预测死亡率和转移。此外，通过E2F3过表达强制进入细胞周期能够激活增殖信号，但不能诱导ESC样信号或增强肿瘤起始，这表明c-Myc的作用不仅仅是驱动细胞增殖。然而，我们无法证明ESC样信号相对于增殖信号具有独立的预后价值；目前尚不清楚ESC样信号是在罕见的肿瘤干细胞中表达，还是在人类癌症样本中的大肿瘤中表达。因此，需要进行更多的研究来解决这些重要问题。
实验程序
数据分析
对ESC-like基因模块进行的所有分析都包括和排除了模块内的增殖基因，并且无论这些基因是包含还是排除，结果都是一致的。除了图中显示了包含增殖基因的类ESC基因模块。为了清楚起见，单位为英寸，分析结果显示使用ESC类模块排除了增殖基因，因为E2F3诱导增殖基因(图S4)但不是ESC类模块的其余部分。
细胞培养与基因转移
人类的编码区域c-Myc、E2F3、Ha-Ras G12V、和IκBαM，以及GFP被亚克隆到LZRS逆转录病毒载体中。病毒的产生如前所述(Robbins等人，2001年). 从正常人皮肤分离的原代人角质形成细胞每隔12-24小时连续转导一次。我们通过免疫染色验证了基因转移效率高于99%。
动物研究
将悬浮在100μl PBS和50μl Matrigel中的细胞注入8周龄scid小鼠皮下。随访肿瘤生长10周。对于连续繁殖分析，在皮下注射到scid小鼠之前，将皮下肿瘤切除、切碎并消化成单细胞悬浮液。所有动物研究均按照斯坦福大学相关机构审查委员会的要求进行。
组织分析
为了进行组织学分析，将每个皮下肿瘤的一部分固定在10%福尔马林（Sigma-Aldrich）中，并嵌入石蜡中。用GFP特异性抗体（Abcam）在福尔马林固定的石蜡切片上进行免疫组织化学。每个皮下肿瘤的另一部分在OCT中进行snap冷冻以进行免疫荧光。细胞核用Hoeschst染料33342染色。使用的主要抗体对角蛋白5（Covance）、角蛋白8（Abcam）、角素10（Neomarkers）、角蛋白酶14（Covanse）和谷氨酰胺转胺酶1（Biomedical Tech）具有特异性。
比较基因组杂交
从皮下肿瘤中分离、消化基因组DNA，然后通过直接掺入Cy5进行标记。从正常供体血液中分离的DNA被用作参考，并用Cy3标记。如前所述，将标记的肿瘤和参考DNA竞争性地与人类cDNA微阵列杂交(Pollack等人，1999年).
