结果
缺乏LXRβ表达小鼠的年龄依赖性淋巴增生
为了研究LXR在淋巴细胞中的作用，我们检测了年轻人的免疫系统Lxr公司α和Lxr公司β阴性小鼠(Peet等人，1998年)在C57BL/6背景下（>10代回交）。6-8周龄婴儿脾脏、淋巴结和胸腺的流式细胞术分析Lxr公司α和Lxr公司与LXR-充足的对照组相比，β阴性小鼠CD4+和CD8+T以及CD19+B220+B淋巴细胞群的频率没有显著差异(图S1A和数据未显示）。因此，LXR同型的全部缺失不会显著改变T或B淋巴细胞的发育。然而，对老年人造血组织的分析Lxr公司β阴性小鼠（5-6个月）表现为中度脾肿大，脾脏和LN淋巴细胞总数增加（p=0.01）(). 脾脏中T细胞和B细胞的频率没有显著差异，而LNs来自Lxr公司β阴性小鼠的B细胞室持续适度扩张().
缺乏LXRβ小鼠的脾肿大和淋巴细胞扩增（A） 6个月龄WT和LXRβKO小鼠脾脏和LN的总细胞数。（B） 脾脏的大体形态。（C） 来自脾脏和淋巴结的CD4和CD8 T细胞的频率。（D） 有丝分裂原驱动6-8周龄WT、LXRαKO或LXRβKO小鼠脾细胞增殖。用抗IgM（Fab′）刺激细胞2（10μg/mL）、Con A（10μg/mL）或PMA（0.5μM）和离子霉素（100mM）。三72小时后，在最后16小时内，向培养物中添加H-胸腺嘧啶核苷。*p<0.01**p<0.001。（E，F）TCR驱动WT、LXRαKO或LXRβKO小鼠脾细胞增殖。用pbCD3（10μg/mL）刺激纯化的CFSE标记的T细胞。在24小时（E）和72小时（F）时收集细胞，用抗CD4、CD8和7-AAD染色。5×104将计数珠加入样品中作为内部对照。
由于Foxp3+调节性T细胞（Tregs）在维持淋巴细胞内环境稳定方面发挥着重要作用，我们考虑了淋巴增生可能反映Tregs缺失的可能性。然而，FACS分析Lxr公司β阴性脾脏和LN细胞显示CD4+Foxp3+T细胞的频率没有差异(图S1B)激活标记CD69、25和44也没有发现差异(图S1C; 数据未显示）。同样，在小鼠脾脏树突状细胞（DC）的频率上也没有观察到差异Lxrβ阴性小鼠或MHC II类、CD86和CD40表达水平，表明APC未被激活并直接介导淋巴增生(图S2).
接下来，我们检查了Lxr公司α和Lxr公司β在小鼠免疫细胞中的表达。Lxr公司α在腹膜源性巨噬细胞和骨髓源性巨噬细胞中高水平表达，而在静息纯化的B细胞和T细胞中检测到很少或没有mRNA(图S3A).Lxr公司β在巨噬细胞、T细胞和B细胞中表达。我们考虑了淋巴细胞活化可能改变Lxr公司α表达，但我们未能检测到在有或无2μM GW3965（合成LXR激动剂；图S3B). 人类T细胞也表达LXRβ，但不表达LXR-α蛋白(图S3C). 正如预期的那样，GW3965通过自身调节诱导THP-1巨噬细胞中LXRα的表达(Laffitte等人，2001年) (图S3C). LXR的激活诱导了人T细胞中靶基因的表达，但没有导致LXR公司αmRNA(图S3D; 数据未显示）。
LXRβ是淋巴细胞增殖的内在调节因子
我们假设LXR可能调节淋巴细胞的增殖和/或效应功能的获得。为了测试这种可能性，我们检查了三H-胸腺嘧啶掺入WT的全脾细胞，Lxr公司α为空，或Lxr公司用一组促有丝分裂刺激物刺激β阴性小鼠。有趣的是，抗IgM-（Fab′）2-、刀豆球蛋白A-和pma/离子粘蛋白刺激的脾细胞Lxr公司与WT对照组相比，β阴性小鼠加入的胸腺嘧啶核苷显著增多(; 数据未显示）。为了确定这种效应是否是由于固有差异性细胞增殖所致，用pbCD3刺激纯化的CFSE标记的T细胞，并用流式细胞术分析其增殖反应和生存能力。24小时时，在细胞活力或CFSE标记的T细胞稀释度方面没有观察到差异，这表明Lxr公司β阴性T细胞没有固有的早期存活优势(). 然而，72小时和96小时的分析表明，在TCR刺激下分裂的T细胞的绝对数量在Lxr公司β无效T细胞Lxr公司αnull和WT单元(). 因此，LXRβ的表达在本质上调节淋巴细胞对TCR、BCR或药物激活的反应。
LXR配体活化抑制淋巴细胞增殖
在补充研究中，我们询问LXR激活是否改变了淋巴细胞的增殖能力在体外用抗IgM-（Fab′）刺激C57BL/6小鼠的脾培养2或在存在或不存在GW3965、LG68（RXR激动剂）或生理性LXR配体22（R）-羟基胆固醇的情况下使用pbCD3。48–96小时后，用三H-胸苷过夜以测定增殖。LXR和/或RXR激动剂激活LXR显著降低培养细胞的增殖能力(). 同样，22（R）-羟基胆固醇以剂量依赖的方式抑制B和T细胞的增殖。
LXR激活抑制淋巴细胞增殖（A） 抗IgM（Fab′）刺激的WT脾细胞有丝分裂原驱动的增殖减少2（10μg/mL）或pbCD3（10μg/mL）和LXR配体GW3965（2μM）、22（R）-羟基胆固醇（0.156μM–2.5μM）或RXR配子LG268（100 nM），如图所示。三72 H后，将H-胸腺嘧啶核苷添加到培养物中，持续最后16 H。（B）用ConA（10μg/mL）或LPS（100μg/mL）刺激WT、LXRαKO或LXRβKO脾细胞，并用所示的LXR配体GW3965（2μM）、T1317（1μM）和RXR配体LG268（100nM）处理。三72 H后将H-胸苷添加到培养物中，进行最后16 H。（C，D）CFSE稀释，并在24–96 H测定用pbCD3刺激的纯化WT、LXRαKO或LXRβKO T细胞在GW3965和LG268存在下的存活率，如图所示，LXR/RXR激动剂。（F） pbCD3刺激与GW3965和LG268培养的WT T细胞的Annexin和PI染色。（G） CFSE稀释用与铅山羊抗小鼠交联的抗CD3刺激的人T细胞，并用GW3965培养。5×104将计数珠添加到样品（面板C、D、E、G）中作为内部计数对照，并通过流式细胞术进行分析。
为了确定LXR激动剂对淋巴细胞增殖的抑制作用是否依赖于受体，在有或无受体激动剂的情况下，用一组T和B细胞有丝分裂原刺激培养物。LXR单独或与RXR联合激活显著降低三用Con A、抗IgM或LPS刺激的WT脾细胞培养物中H-胸腺嘧啶掺入(和第4页). 类似的减少三H-胸腺嘧啶掺入在来自Lxr公司α阴性小鼠。相比之下，LXR激活对三H-胸腺嘧啶掺入丝裂原刺激Lxr公司β缺失脾细胞(和第4页). 适度下降三在LPS和抗IgM刺激的LG268处理的脾细胞中观察到H-胸腺嘧啶掺入，表明B细胞中存在RXR依赖性、LXR非依赖性效应(和第4页). 然而，在Con A处理的脾细胞中没有观察到这种减少，这表明RXR单独激活不会干扰该系统中T细胞的扩增().
我们认为LXR在全脾培养中的激活可能通过对其他细胞类型的作用间接影响淋巴细胞的扩增。为了解决这个问题，纯化的T细胞被CFSE标记，并在受体激动剂或载体存在下用pbCD3刺激。重要的是，与LXR/RXR配体培养的T细胞在24小时时的存活率没有显著差异，这表明在这些浓度下它们对淋巴细胞本身没有毒性(). 48–96小时培养物的FACS分析显示，LXR激活抑制WT和Lxr公司α空T细胞，但不是Lxr公司β空细胞(). 因此，LXR激活对由LXRβ介导的淋巴细胞增殖具有内在影响。我们还观察到用M-CSF培养的骨髓源单核细胞在发育过程中受到LXR依赖性增殖抑制在体外（未显示数据）。有趣的是，我们未能观察到LXR配体对许多转化的T和B细胞系增殖的影响（包括Jurkat和Ramos；数据未显示）。这一观察结果表明，许多转化细胞已经失去了对LXR抗增殖作用的敏感性。
有效激活T细胞需要两个信号。第一种病毒通过TCR介导，而第二种病毒可以通过多种细胞表面受体传播(Bromley等人，2001年). 为了确定协同刺激是否可以在配体存在的情况下恢复增殖，我们用pbCD3激活纯化的WT T细胞，并添加可溶性抗CD28或rIL-2。正如预期的那样，LXR激活显著降低了pbCD3的增殖反应(); 然而，在培养基中添加抗CD28或IL-2并没有起到解救作用。
接下来，我们研究了LXR对淋巴细胞扩增的影响是否也与核受体超家族的其他成员共享。除LXR外，已知PPARγ和GR都能抑制免疫细胞的炎症反应(小川等人，2005年). 用地塞米松处理T细胞24小时后，75-90%的细胞死亡，而LXR、RXR或PPARγ的激活几乎没有影响(和S5C系列). 有趣的是，与LXR激活相比，PPARγ信号对增殖的T细胞具有适度的生存优势在体外稍后的时间点（未显示数据）。因此，LXRβ激活以不同于糖皮质激素受体和PPARγ的方式调节淋巴细胞的扩增。
为了确定LXR启动的转录程序是否也调节人类淋巴细胞，从正常献血者的外周血中采集纯化的T细胞。用载体或受体配体处理纯化的T细胞，并用pbCD3+/−可溶性抗CD28刺激。与小鼠淋巴细胞相反，LXR/RXR激活在长达72小时的分析培养物中没有诱导细胞凋亡(图S5D). 与小鼠淋巴细胞相似，LXR激活也降低了用pbCD3刺激的人CD8+或CD4+T细胞的增殖能力(和5安). 与小鼠T细胞相比，添加抗CD28能够克服LXR介导的增殖抑制(图S5B)表明小鼠和人类淋巴细胞中LXR的生物学存在细微差异。
LXR激活阻断淋巴细胞的细胞周期进程
LXR抗增殖作用的一个可能解释是，该受体参与了一种凋亡途径，从而减少了淋巴细胞增殖的总数。或者，可能是LXR依赖性转录调节细胞周期进展。对培养的T细胞的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）特征的分析表明，LXR的激活和消融均未改变细胞对pbCD3的反应而增大(; 数据未显示）。然而，在36-48小时对T细胞母细胞的检查清楚地表明，LXR激活的细胞不能有效分裂(). 抗凋亡因子Bcl-xL的转基因过表达或caspase抑制剂ZVAD-fmk的添加比野生型对应物提供了适度的生存优势，但在LXR配体的存在下不能恢复增殖(; 数据未显示），这与LXR对增殖而非细胞活力的主要影响一致。
LXRβ信号调节细胞周期进展（A，B，C）在GW3965（2μM）和LG268（100nM）存在下，用pbCD3（10μg/mL）刺激WT和Bcl-xL tg T细胞36–96小时的CFSE稀释。细胞经7-AAD染色，流式细胞仪分析。（D） 如图所示，用pbCD3、GW3965和LG268刺激WT和LXRβKO T细胞的细胞周期分析。在48小时用碘化丙啶对细胞进行DNA含量染色，并通过流式细胞术进行分析。如图所示，用pbCD3、GW3965和LG268刺激WT T细胞的细胞周期蛋白。（E） 在36小时时，对细胞进行渗透并对细胞内增殖抗原Ki-67、PCNA和topro-3进行DNA含量染色。（F） 收集全细胞裂解物，并在18小时通过Western blot分析p27kip和CDK4的表达。
接下来，我们分析了在有或无LXR配体的情况下活化T细胞的DNA含量。有趣的是，Lxr公司与WT细胞相比，βnull T细胞在36–48小时的S期和G2/M期细胞比例增加，亚2N比例减少(和S6系列). WT但不是Lxr公司经LXR激动剂处理的β阴性细胞显示，细胞在细胞周期中移动的比例显著降低，凋亡的亚2N比例增加(和图S6). 对pbCD3刺激的人类T细胞培养物中DNA含量的分析也表明，24小时进入S期的细胞显著减少，而亚2N组分没有差异（数据未显示）。因此，LXRβ的激活限制了T细胞在细胞周期中运动的能力，导致增殖降低。
我们还分析了细胞周期蛋白的表达。对GW3965处理的淋巴细胞的qPCR分析显示，cylin D2、D3和c-Myc正常上调，表明细胞向G1移动（数据未显示）。同样，我们观察到增殖相关抗原Ki-67和CDK 4的正常上调(). 然而，配体处理的细胞保持了细胞周期抑制剂p27kip水平的增加，这表明细胞周期移动能力下降。因此，存活的配体处理细胞在48小时时PCNA表达降低(). 我们还观察到细胞周期蛋白E1和E2的mRNA表达降低（数据未显示），进一步支持我们的断言，即强化LXR激活会降低活化淋巴细胞的细胞周期进程。
LXR信号不抑制淋巴细胞活化
NF-κB信号通路在淋巴细胞活化中起重要作用(Schulze-Luehrmann和Ghosh，2006年). 由于已知LXR可阻断NF-κB依赖性基因表达，我们认为LXR的抗炎作用可能是其对淋巴细胞扩增影响的基础。然而，LXR激活在24小时时并没有显著影响激活标记CD69和CD25的上调(图S7A; 数据未显示）。LXR/RXR激活也不会干扰IL-2的产生(图S7B). 此外，用IL-2重新刺激静止的T细胞导致IL-2应答基因淋巴毒素A和颗粒酶B的类似诱导(图S7C) (Bealing和Smith，2002年;Kovanen等人，2005年). 结合观察结果Lxr公司βnull T细胞不表达更高水平的CD25、CD44或CD69体外(图S1D以及未显示的数据），并且不会在更大程度上上调这些标记物，以响应TCR交联(图S7D)这些数据强烈表明，LXR的增殖调控不是通过改变TCR或IL-2信号或抑制近端淋巴细胞活化来实现的。
我们还讨论了LXR激活必须与TCR信号相关才能阻止增殖的时间。为此，在向培养物中添加LXR/RXR配体之前，用pbCD3激活CFSE标记的T细胞24小时。有趣的是，TCR信号24小时后LXR的激活仅在随后的几轮除法中干扰了扩张(图S8). 如果刺激后2小时冲洗掉LXR配体，则增殖恢复(图S8)表明抑制增殖需要持续的LXR信号。这些观察结果表明，LXR的作用可能由下游靶基因的激活或抑制介导（见下文）。
淋巴细胞活化过程中SREBP-2和LXR转录程序的相互调节
为了确定LXR调节增殖的机制，我们分析了在有或无LXR激动剂的情况下，pbCD3刺激前后小鼠脾T淋巴细胞的基因表达。特别是，我们检测了与从头开始胆固醇生物合成，逆转胆固醇转运和胆固醇摄取。与之前的报告一致，该报告显示胆固醇合成在活化的T细胞中受到刺激(Chen等人，1975年)，我们发现SREBP-2靶基因的整个通路在激活后被诱导(). 脂肪酸和磷脂合成途径也被诱导，与SREBP-1的激活一致（数据未显示）。出乎意料的是，TCR的激活还导致LXR靶基因的伴随性和深度下调，包括参与胆固醇转运的两个关键基因，阿布卡1和抗体cg1(). 相比之下，用LXR培养活化的淋巴细胞可以有效地诱导这些基因。与其他细胞类型（如巨噬细胞）相比，LXR在T细胞中的转录作用更为有限。LXR激活改变了相对较少的基因，绝大多数与胆固醇代谢有关。事实上，在其他细胞类型（例如apoE、PLTP、apoD、ABCG5、ABCG8）中表达的许多LXR靶基因在T细胞中不存在（数据未显示）。我们还注意到，用LXR激动剂培养活化淋巴细胞可以适度促进SREBP-2靶基因的表达(). 这种影响可能是继发于LXR驱动的SREBP-1表达增加，也可能反映ER中胆固醇含量的变化（见下文）。
淋巴细胞活化过程中LXR和SREBP-2转录程序的相互调节（A） 用pbCD3和GW3965（2μM）刺激纯化WT T细胞的SREBP-2和LXR靶基因的DNA微阵列分析。（B） 用pbCD3（10μg/mL）刺激纯化WT T细胞指定时间的mRNA实时PCR分析。（C） 如图所示，用pbCD3和GW3965刺激24小时的纯化WT和LXRβKO T细胞的mRNA实时PCR分析。（D） 用20μg抗CD3e i.p.处理12 h的小鼠纯化WT T细胞mRNA中LXR和LXR靶基因的实时PCR分析（E）如图所示，用抗IgM和GW3965刺激6 h的纯化WT B细胞mRNA的实时PCR研究。（F） 增殖（基础）、血清饥饿（饥饿）和参考WT小鼠胚胎成纤维细胞mRNA的实时PCR分析。
实时PCR对LXR和SREBP1靶基因表达的分析证实，T细胞活化伴随着这些转录途径的快速相互调控。例如，阿布卡1和抗体1表情开始下降，而Ldlr公司和Hmcgr公司激活后2小时表达开始增加(). 关于阿布卡1和抗体cg1在T细胞激活过程中，LXR依赖于LXR，因为T细胞中LXRβ的缺失同时抑制了基础和配体诱导的靶基因表达(). 确定淋巴细胞活化过程中LXR靶基因是否也下调体内向C57Bl/6小鼠腹腔注射抗CD3ε抗体。注射后12 h采集脾脏，从纯化的T细胞中收集mRNA。符合我们的在体外观察，LXR靶基因阿布卡1,抗体cg1和Srebp-1c型激活后显著抑制，而Lxrβ表达保持不变().
在通过BCR和PMA/离子霉素激活的原代小鼠B细胞中，也观察到增殖刺激对LXR和SREBP通路的相互调节(; 数据未显示）。在PMA/离子霉素激活的人淋巴细胞中观察到LXR和SREBP靶基因之间存在类似的相互关系(图S9). 我们还检测了C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）在基础条件下、血清饥饿（G1期阻滞）和再喂养（重新进入细胞周期）。实时PCR证实，增殖刺激可触发MEF中LXR靶点的抑制和SREBP-2靶点的诱导。有趣的是，24小时血清剥夺上调了MEF中LXR靶基因的表达(). 用血清上调SREBP-2靶基因，通过再喂养6小时从细胞周期阻滞中释放Ldlr公司和17β-Hsd以及下调LXR靶基因的表达。这些数据反映了在静止和活化淋巴细胞中观察到的基因表达模式，表明LXR和SREBP-2活性的相互调节是细胞周期早期移动的一个普遍特征。
增殖刺激诱导氧化甾醇硫转移酶（SULT2B1）表达并降低LXR配体的可用性
尽管受体的表达保持不变，但LXR靶基因表达的缺失强烈表明T细胞激活期间内源性LXR配体的丰度降低。与这一假设相一致，在HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀的存在下培养原代T细胞，以前证明可以阻断LXR激动剂的产生，导致细胞凋亡减少阿布卡1和抗体cg1表达式(). 此外，甲羟戊酸的添加恢复了它们的表达，表明甲羟戊酸钠途径产生的氧甾醇是维持静止淋巴细胞LXR活性所必需的。最后，通过直接添加内源性LXR激动剂22（R）-HC也恢复了靶基因表达（数据未显示）。
SULT2b1在T细胞活化过程中对LXR信号传导的调节（A） 辛伐他汀和5 mM甲羟戊酸培养的静止WT T细胞LXRβ和ABCG1的实时PCR分析。（B） 抗CD3刺激纯化WT T细胞SULT2b1、ABCC1、LDLR和ABCG1 mRNA的实时PCR分析在体外在指定的时间内。（C） 抗CD3刺激12 h纯化WT T细胞SULT2b1和ABCG1 mRNA的实时PCR分析体内（D）用含SULT2b1或对照腺病毒转导的CAR-tg T细胞中LXRβ、LDLR和ABCA1 mRNA的实时PCR分析。
为了研究T细胞激活过程中LXR配体可用性调节的潜在机制，我们回到了转录谱分析。值得注意的是，随着T细胞的激活，可以快速诱导氧化甾醇代谢酶SULT2B1的表达。SULT2B1催化硫酸盐基团转移到氧化甾醇，使其作为LXR配体失活，并通过ABCC1和其他膜转运蛋白促进其从细胞中输出(Chen等人，2007年;Javitt等人，2001年;Zelcer等人，2003年). 实时PCR显示，SULT2B1和ABCC1均被T细胞增殖刺激物（pbCD3或PMA/离子霉素）快速诱导(; 数据未显示）。重要的是，在活化的T细胞中也观察到SULT2B1的显著上调体内(). 这一观察强烈表明，LXR靶基因表达在T细胞激活过程中通过内源性氧甾醇LXR激动剂的活性代谢受到抑制。为了支持这一假设，来自腺病毒受体表达转基因小鼠的静止初级T细胞中SULT2B1的腺病毒表达(Wan等人，2000年)概述了增殖刺激对LXR和SREBP-2靶基因表达的影响().
LXR通过Abcg1依赖性胆固醇稳态改变抑制增殖
观察到T细胞活化与内源性LXR激活物减少相关，再加上显著调节LXR依赖的固醇转运蛋白，表明LXR可能通过控制胆固醇代谢来调节T细胞增殖。我们排除了限制细胞外胆固醇可用性与LXR激动剂通过补充过量LDL对T细胞增殖的影响有关的可能性。在有或无LXR激动剂的情况下，添加高达100μg/ml的低密度脂蛋白对细胞增殖没有影响(; 数据未显示）。接下来，我们探讨了细胞内胆固醇代谢的LXR依赖性改变与增殖相关的可能性。通过fillipin染色评估整体膜胆固醇含量表明，爆破T细胞中的总胆固醇含量增加，但载体和LXR激动剂治疗之间没有显著差异(). 然而，细胞内胆固醇的转运是复杂的，细胞内的胆固醇池不一定与质膜平衡(Chang等人，2006年;Simons和Ikonen，2000年). 因此，这种粗略的分析并不排除甾醇水平的更细微或区域特异性变化，也不排除稀有甾醇物种（如氧甾醇(Yancey等人，2003年)).
LXR通过以下途径抑制增殖抗体cg1-胆固醇稳态的依赖性改变（A） 在10μg/mL LDL存在下，用pbCD3和GW3965刺激WT T细胞60小时，CFSE稀释。（B）如图所示，通过fillipin染色在离体或用pbCD3/GW3965激发24小时后显示WT T淋巴细胞质膜的胆固醇含量。（C，D）CFSE稀释纯化的ABCG1−/−、ABCA1−/−和在LXR配体存在下用pma和离子霉素刺激的对照T细胞60小时。（e）如图所示，CFSE稀释用pbCD3刺激的纯化WT T细胞96小时，在GW3965和甲羟戊酸（MVA）存在下。
先前的研究已经证实ABCG1和ABCA1在LXR依赖性甾醇外排和细胞内甾醇运输中起着核心作用。因此，我们测试了在LXR激动剂的抗增殖作用中对这些转运蛋白的需求。净化水处理厂和抗体cg1在GW3965和/或LG268存在或不存在的情况下，pma/离子霉素激活了空淋巴细胞。48-96小时后，通过流式细胞术评估CFSE增殖情况。正如预期的那样，LXR激动剂降低了WT T细胞的增殖能力(和第11节). 然而，在缺乏ABCG1的细胞中，LXR激活的作用显著减弱。我们还分析了LXR激动剂对ABCA1无效和背景匹配（B6/129）ABCA1+/+对照的影响。不幸的是，ABCA1无效突变在C57BL/6背景下是致命的，排除了在相同背景下ABCG1和ABCA1的直接比较。然而，ABCA1表达的缺失并没有改变对LXR激动剂的反应()，表明LXR效应不需要这种转运体。
上述观察结果表明，通过ABCG1转运甾醇是LXR激动剂抑制细胞增殖所必需的。为了有力地支持这一机制，通过向淋巴细胞提供过量的甲羟戊酸（5 mM）（胆固醇和氧化甾醇的前体），可以完全克服LXR激活的抑制作用(). 重要的是，为细胞提供足以进行非甾体修饰（如蛋白质丙内化）但不足以驱动甾醇合成（100μM）的甲羟戊酸水平，对LXR依赖性抑制没有影响。这些数据确定ABCG1是固醇运输途径的关键组成部分，在T细胞激活过程中必须下调。外源性LXR激动剂激活T细胞期间ABCG1的强制表达参与代谢检查点，通过改变细胞内固醇代谢阻止增殖。
内源性LXR信号调节获得性免疫反应
明确确定T细胞中LXRβ信号的内在缺失是否会转化为增殖优势体内，我们使用了一个竞争性的稳态增殖过继转移模型。对于这些研究1×106 Lxr公司将βnull（Thy1.2+）T细胞和同等数量的同源WT（Thy1.1+）T淋巴细胞共同移植到同一B6.RAG null宿主中，并进行1周的稳态增殖。引人注目的是，FACS对宿主动物脾脏和血液的分析显示Lxr公司βnull（Thy1.1−，CD3+）T细胞比同一宿主分离的WT（Thy1.1+，CD3+）T细胞高出很多（p=0.003）().
LXR信号调节T细胞增殖和免疫（A） WT和LXRβKO T细胞的稳态增殖。1×106纯化的WT（Thy1.1+）和LXRβKO T细胞（Thy1.2+）被共同过继转移到B6Rag−/−宿主中。5天后，收获脾脏并用抗CD3和Thy1.1对细胞进行染色，以确定回收的T细胞的频率。每个FACS图代表一只老鼠，图表代表一个实验中的5只老鼠。（B） LXR/RXR配体刺激WT T细胞的稳态增殖。用GW3965预处理WT（Thy1.2+）T细胞在体外用二甲基亚砜预处理对照（Thy1.1+）T细胞18小时在体外18小时1×106每个治疗组的活细胞被共同过继转移到B6Rag−/−宿主中。5天后，采集脾脏，用抗CD3、Thy1.1和Thy1.2染色细胞。每个FACS图代表一个实验中5只小鼠的单个小鼠。（C，D）LXRβKO小鼠抗原特异性免疫反应增强。用1×10免疫WT和LXRβKO小鼠7用人腺病毒5型早期区域1（Ad5e1）转染的同基因MEC。（C） 计算了整个脾脏中抗原特异性CD8+T细胞的频率体外短期免疫后细胞内IFN-γ染色1周在体外用E1B重新模拟192-200（VNIRNCCYI）肽。FACS数据显示，每个基因型2只小鼠，代表每组4只小鼠。（D） CD8 T细胞区室内产生抗原特异性IFN-γ和TNFα的CD8 T细胞的频率。数据表示为每组4只小鼠的平均+/-SEM。每个实验重复两次。
在补充研究中，我们询问LXR的激活是否会阻止WT T细胞的扩张体内为此，我们分别用GW3965或载体预处理纯化的WT Thy1.2+T细胞和WT Thy 1.1+T细胞16小时在体外允许启动LXR转录程序。收集活细胞，1×106将载体（Thy1.1+）和GW3965（Thy1.2+）处理过的细胞注射到B6.RAG阴性小鼠体内。随后在第5-7天分析外周血和脾脏中的Thy1.1+和Thy1.2+CD3+T细胞。与上述功能丧失研究一致，用LXR配体预处理T细胞显著降低了T细胞进行稳态增殖的频率().
LXR调节淋巴细胞膨胀的能力强烈表明，内源性LXR信号可能对获得性免疫反应产生功能性影响。确定LXRβ的缺失是否会增加抗原驱动的增殖体内，我们用1×10免疫小鼠7表达人类腺病毒5型早期区域1（Ad5E1）的Tap缺乏小鼠胚胎细胞（MEC）。计数抗原特异性CD8+T细胞体外免疫后一周，短期内用细胞内IFN-γ和TNF-α染色在体外用E1B抗原E1B重新刺激192-200（VNIRNCCYI）(Toes等人，1998年). 值得注意的是，FACS分析表明，抗原特异性的频率Lxr公司βnull IFN-γ+（p=0.02）或TNFα+（p<0.01）CD8+T细胞比WT细胞高2-3倍(). 因此，在WT小鼠中，抗原驱动的CD8+T细胞扩增受到LXRβ的负调控。综上所述，这些数据确立了LXR依赖的甾醇代谢作为调节T细胞功能和免疫反应的新信号通路。
讨论
适应性免疫的一个重要特征是抗原特异性淋巴细胞能够快速而广泛地增殖以应对抗原挑战。因此，了解影响增殖的信号通路对于了解免疫反应是如何产生和控制的至关重要。许多实验室以前的工作概述了糖酵解代谢在T细胞反应中的重要性(麦克唐纳和塞洛蒂尼，1979年;Rathmell等人，2000年;Vander Heiden等人，2001年). 然而，脂代谢对淋巴细胞功能的影响尚不清楚。我们在此表明，细胞内固醇代谢在获得性免疫反应的控制中具有以前未被认识到的调节作用。胆固醇是膜的基本成分，因此在细胞繁殖中对充足胆固醇的需求是显而易见的。然而，我们的数据表明，在T细胞激活期间，甾醇的细胞内可用性是动态调节的，这与SREBP和LXR介导的转录反应以及细胞周期控制有关。此外，我们发现LXR通过调节ABCG1固醇转运体改变细胞固醇代谢的能力影响淋巴细胞增殖和抗原刺激免疫反应。
LXR信号在天然免疫细胞中潜在作用的初步线索来自对LXR缺失小鼠的分析，这些小鼠表现出年龄依赖性脾肿大和淋巴结病。这种表型反映了T和B细胞室的扩张，并与之前未被认识到的LXRβ调节有丝分裂原和抗原驱动的淋巴细胞增殖的能力有关。对纯化的原代淋巴培养物的分析表明，生理或药理学配体对LXRβ的激活会降低B细胞和T细胞的增殖能力。相反，LXRβ基因缺失可使细胞免于LXR激动剂的抑制作用，并增强有丝分裂原和抗原驱动的扩增。我们还证明，LXR影响细胞增殖的能力对淋巴稳态和抗原驱动的免疫反应具有功能性后果体内缺乏LXRβ表达的淋巴细胞在稳态和疫苗驱动的增殖模型中均表现出过度反应。因此，内源性LXR信号是免疫反应的重要生理决定因素，而药理性LXR激活具有免疫调节的潜力。
考虑到LXR抑制巨噬细胞NF-κB信号的能力，我们最初怀疑LXR可能干扰TCR信号和参与淋巴细胞活化的近端通路。然而，情况似乎并非如此，因为激活标记物和IL-2的产生不受LXR配体的影响。我们还排除了LXR激活直接导致细胞凋亡的可能性，这是已知的GR激动剂引起的。相反，细胞周期分析表明，LXR信号调节G1-S转换。总之，这些观察结果表明，LXR控制着一个或多个基因的表达，这些基因对细胞周期进程具有抑制作用。为了鉴定这些基因，我们分析了淋巴细胞激活过程中的基因表达。我们发现，一组与胆固醇稳态相关的基因在淋巴细胞激活过程中受到动态调节，外源性LXR配体改变了这一代谢程序。特别是，编码固醇转运体ABCA1和ABCG1的基因——都是LXR靶点——在T细胞受体交联后迅速下调。LXR激动剂的加入强烈刺激了它们的表达。这些发现导致了这样一种假设，即ABCG1作用以抑制增殖的方式改变淋巴细胞中的固醇代谢。证明LXR抑制淋巴细胞增殖的能力显著降低，为该模型中ABCG1的需求提供了明确支持抗体cg1使鼠标无效。通过观察发现，如果淋巴细胞中含有过量的甲羟戊酸（胆固醇和氧甾醇的前体），LXR的抑制作用将被完全阻断，从而确定了与甾醇代谢的明确联系。
我们的结果揭示了内源性固醇信号通路的存在，该通路通过协调调节SREBP和LXR活性来调节淋巴细胞增殖。我们在T细胞活化过程中观察到的SREBP和LXR靶基因表达的变化表明这两种转录因子的内源性固醇调节因子发生了变化。Brown和Goldstein描述了一种调节胆固醇合成的优雅机制，其中SREBP被甾醇敏感蛋白SCAP保持为ER中的非活性前体(Goldstein等人，2006年). 我们数据的一个逻辑结论是，ER（胆固醇和/或氧甾醇）中的甾醇含量在淋巴细胞激活后一定会迅速下降。此外，激活期间LXR靶基因表达的减少表明固醇LXR激活剂的核可用性也降低。事实上，淋巴细胞中LXR靶基因的基础表达依赖于甲羟戊酸途径产生的内源性LXR激动剂。
出乎意料的是，在T细胞激活期间调节LXR活性的机制并不涉及配体生成的改变，而是由于酶促配体代谢的诱导。酶SULT2B1将硫酸盐基团转移到氧甾醇，使其作为LXR配体失活，并促进其从细胞中输出。我们已经证明，通过增殖刺激，SULT2B1在T细胞中的表达显著增加。预计这种诱导会耗尽LXR配体的细胞并抑制LXR靶基因的表达(Chen等人，2007年;Fuda等人，2007年). 事实上，使用腺病毒载体在静止淋巴细胞中表达SULT2B1，再现了增殖刺激对LXR和SREBP基因表达程序的影响。因此，细胞增殖过程中SULT2B1的上调提供了一种优雅的机制，可以影响支持新膜合成和细胞分裂所需的细胞胆固醇代谢变化。其他机制是否也有助于调节细胞增殖过程中的LXR活性仍有待解决。
ABCG1表达阻止增殖的能力与此转运体的固醇底物在调节细胞周期进展的代谢检查点有关。早期对淋巴细胞胆固醇合成的研究发现，通过添加甾醇代谢物（如25-羟基胆固醇）来操纵甲羟戊酸途径，导致G1期阻滞(查克拉巴蒂和恩格尔曼，1991年). 类似地，HMG-CoA抑制剂在多个系统中阻断细胞的增殖。这些研究中的一个复杂因素是，甲羟戊酸途径的抑制也会干扰非甾醇甲羟戊酸酯衍生物（如香叶基香叶醇和法尼醇）的合成。然而，使用低剂量他汀类药物或下游酶抑制剂从非甾体蛋白修饰中解偶联胆固醇合成途径的尝试揭示了细胞周期进展和有丝分裂对胆固醇的绝对需求(Martinez-Botas等人，2001年;Martinez-Botas等人，1999年). 我们在细胞周期中观察到类似的阻滞；然而，我们的基因分析研究表明，我们并没有阻断SREBP-2通路。相反，我们可能会加强固醇流出或重新分配，导致固醇的局部消耗。
众所周知，ABCG1在胆固醇和氧化甾醇流出中起着重要作用(Kennedy等人，2005年;Terasaka等人，2007年;Wang等人，2004年). 最近的研究还报告称，ABCG1存在于细胞内隔间，如内质网和小泡，并且ABCG1的表达通过内质网中甾醇的重新分布刺激SREBP-2的活性(塔尔和爱德华兹，2007年). 我们假设特定细胞隔室（可能是ER）中一种或多种甾醇的充足水平被细胞周期机制读取，作为细胞分裂适当代谢条件的指示。在激活过程中下调ABCG1对维持这些甾醇的区域化可能是必要的。LXR激活对ABCG1的强制诱导降低了该信号固醇的可用性。在缺乏LXR的情况下，增加的甾醇水平会刺激增殖。目前，我们支持胆固醇本身是细胞周期机制感测的甾醇的假设，因为LXR激动剂阻止增殖的能力表明信号甾醇不是LXR拮抗剂。
总之，这项工作概述了LXRβ和甾醇信号在淋巴细胞功能调节中以前未被认识的作用。尽管我们在本报告中的重点是淋巴细胞，但SULT2B1-LXR-ABCG1轴耦合细胞胆固醇代谢和增殖的能力可能适用于许多细胞类型，特别是那些经历快速细胞分裂的细胞类型。最后，鉴于LXR对内源性脂质有反应，而内源性脂质在疾病中的可用性可能会发生改变，我们的结果提出了LXR信号可能会影响人类代谢性疾病（如血脂异常和动脉粥样硬化）中获得性免疫反应的可能性。
材料和方法
小鼠和细胞系
C57BL/6和C57BL-6重组激活基因1缺陷小鼠购自Jackson实验室。Lxr公司α和Lxr公司β-缺失小鼠是D.Mangelsdorf（德克萨斯大学西南分校）赠送的，回交至C57BL/6的小鼠超过10代。BCL-xL转基因小鼠是D.Green（St.Jude’s）赠送的礼物。先前已经描述过ABCG1和ABCA1阴性小鼠(Kennedy等人，2005年;Timmins等人，2005年). Do11.10 CAR转基因小鼠购自Taconic实验室。所有小鼠都在加州大学洛杉矶分校的动物设施中保持在SPF条件下。已描述了表达人类腺病毒5型早期区域1（Ad5E1）的Tap缺陷小鼠胚胎细胞（MEC）(Schoenberger等人，1998年).
培养基、试剂、抗体和流式细胞术
GW3965、T090117和GW7845由T.Willson和J.Collins（葛兰素史克）提供。在添加10%热灭活FCS、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、10 mM Hepes（均来自Gibco）和50μM 2-ME（Sigma-Aldrich）的RPMI 1640中培养淋巴细胞。7-AAD、碘化丙锭、膜联蛋白V、抗鼠CD25（PC61）、CD3（2C11）、CD4（RM4-5）、CD8（53-6.7）、CD28（37.51）、CD69（HI.2F3）、Foxp3（FJK-16s）和抗人CD4（RPA-T4）、CD八（RPA-T8）、Ki-67（B-56）和PCNA（PC-10）购自Bd biosciences和eBioscience。纯化的抗人CD3（OKT3）购自Ortho Scientific。小鼠rIL-2购自Peprotech。在分析之前，将Flowbright计数珠（Invitrogen）添加到FACS管中，以使CFSE稀释曲线正常化。按照制造商说明（Bdbiosciences）进行细胞内PCNA和Ki-67染色。使用FlowJo软件（Treestar，Inc）在FACSCalibur或LSR（Becton Dickinson）上分析细胞。
细胞纯化和细胞计数
在一些实验中，使用阴性选择富集小鼠或人类T细胞。对于小鼠，使用Pan T或B细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）进行T细胞或B细胞富集，并根据制造商说明选择MidiMACS色谱柱（Miltenxi Biotec）。对于人类T细胞，按照制造商说明使用Rosette Sep（干细胞技术）进行富集。流式细胞术证实纯度>95%。细胞计数在改良Neubauer血细胞仪上使用台盼蓝排除法进行。所有报告的LN细胞计数均来自2个腹股沟LN和4个腋窝LN。对于腺病毒转导，纯化的CAR转基因T细胞与腺病毒在完全培养基中以10:1的MOI孵育1小时。然后将细胞清洗两次，并以1×10的速度重新悬浮6完整培养基中每毫升细胞数。
扩散研究
对于三H-胸腺嘧啶掺入研究，最初使用ACK裂解缓冲液制备小鼠脾单细胞悬浮液。将整个脾细胞置于96个圆形底板（2×10）中5细胞/孔），并用LPS（10μg/mL）、Concavalin A（10μg/mL）、抗IgM（Fab′）刺激2（10μg/mL）或PMA（0.5μM）和离子霉素（100 mM）。细胞在37°C/5%CO下培养24–96小时2并用脉冲三最后16小时的H-胸腺嘧啶核苷。对于一些研究，通过上述阴性选择从脾脏和淋巴结中纯化和富集T细胞或B细胞。如前所述，用CFSE（分子探针）标记单细胞悬液(里昂和教区，1994年). 如上所述刺激细胞。CFSE标记人T细胞，并在96孔平底板（2×105细胞/孔）。一些培养物接受2μg/孔可溶性抗CD28。在指定的日期，用7-AAD和5×10培养细胞，对细胞进行CD8和CD4表面表达染色4在流式细胞仪分析之前，对加入试管的珠子进行计数。
免疫和稳态增殖试验
用于免疫研究WT和Lxr公司皮下接种1×10β阴性小鼠7辐照（3000 rad）TAP缺乏-Ad5E1-MEC。第7天处死小鼠，从脾脏中计数抗原特异性CD8+T细胞，如下所述(Schoenberger等人，1998年). 用E1B培养单细胞悬浮液5小时192-200在Brefeldin A（BD生物科学）存在下，2.5μg/mL的肽（（aa:VNIRNCCYI）A&A labs LLC）体外根据制造商的方案，对细胞进行CD8和CD4表面表达染色，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒（BD biosciences）固定和渗透，并对细胞内IFN-γ和TNFα进行染色。用于稳态增殖研究1x106将纯化的LXRβnull（Thy1.2+）T细胞和WT（Thy1.1+）T淋巴细胞共同移植到同一B6.RAG null宿主中。采集外周血和脾脏，染色CD3和Thy1.1表达，并用FACS分析。
RNA分离、DNA微阵列和实时PCR分析
对于DNA微阵列，使用Trizol（Invitrogen）和进一步纯化的RNEasy柱（Qiagen）从细胞中分离出总RNA。在加州大学洛杉矶分校微阵列核心进行Affymetrix 430 v2.0的制备和杂交，并使用GeneSpring GX 7.3（安捷伦科技）分析数据。对于实时PCR，如上所述分离总RNA。使用Taqman逆转录试剂盒（Applied Biosystems）用随机六聚体逆转录1微克总RNA。使用Applied Biosystems 7900HT序列检测器进行Sybergreen（Diagenode）实时定量PCR检测。结果显示重复实验的平均值归一化为36B4。
蛋白质分离与分析
在添加蛋白酶抑制剂（Roche Molecular Biochemicals）的溶解缓冲液（10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、10 mM Tris-HCl、pH 7.4、1%SDS）中制备总细胞裂解物。样品在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至硝化纤维素。用抗-hLXRα和hLXRβ（Perseus Proteomics）、抗P27kip（Cell Signaling）和抗CDK4（Santa Cruz Antibodies）在1:1000过夜时探测膜，以检测其表达。羊抗鼠和驴抗兔（DAKO）在1:3000的温度下在室温下使用1小时，并用化学发光（ECL，Amersham Pharmacia Biotech）进行可视化。
统计方法
实时PCR数据，在体外增殖试验和细胞计数表示为平均值±标准偏差。抗原特异性T细胞和稳态增殖T细胞的频率表示为平均值±标准误差（S.E.M）。所有的统计分析都是使用学生的t检验进行的。p<0.05的概率值被认为具有统计学意义。
补充材料
01
图S1。LXR阴性小鼠T和B淋巴细胞的正常分布。（a） 来自6-8周龄雄性WT的脾细胞，Lxr公司α−/−和Lxr公司β−/-小鼠用抗CD4、CD8、CD19和B220染色。B细胞的频率显示在上面板中，CD4和CD8 T细胞的频率标记在下面板的右上象限中。（b） 来自WT和Lxr公司对β−/−小鼠进行CD4和细胞内Foxp3染色。（c） 来自WT的脾细胞，Lxr公司α−/−和Lxr公司β−/-小鼠用抗CD4、CD8、CD44和CD25染色。FACS图代表每个基因型重复5次以上的一只小鼠。
图S2。老年LXRβ阴性小鼠APC表型正常（a，b）来自5个月大WT的脾细胞和Lxr公司对β−/−小鼠进行CD11c、MHC II类、CD40和CD86表达染色。FACS图代表每个基因型一只小鼠重复超过3次。
图S3。LXRβ在静止和活化的淋巴细胞中表达（a）C57BL/6腹腔巨噬细胞、骨髓源性巨噬细胞的实时PCR分析，体外纯化脾B和T细胞。（b） 如图所示，用pbCD3和LXR配体激活纯化的脾T细胞24小时，并进行实时PCR分析。（c，d）纯化的人类T细胞与LXR配体和PMA/离子霉素培养24小时，如图所示。（c） 在指定时间收集全细胞裂解物，并通过Western检测LXRα和LXRβ的表达。（d） 在指定时间收集mRNA并分析Lxr公司α,Lxr公司β、 实时PCR表达。
图S4。LXR功能的获得抑制B淋巴细胞增殖。6-8周龄WT的脾细胞，Lxr公司α和Lxr公司用抗IgM（Fab′）刺激β−/−小鼠2如图所示，用LXR和/RXR配体处理培养物。三72小时后，将H-胸苷添加到培养物中，持续最后16小时。
图S5。LXR功能的获得负向调节人CD4 T细胞的扩增，但可以通过协同刺激进行挽救，并且不会诱导细胞凋亡。（a、b、c）纯化CFSE标记的人类T细胞，并用pbCD3、可溶性抗CD28和LXR配体刺激，如图所示。在指定时间对培养物进行CD4、膜联蛋白和PI染色。5×104将计数珠加入样品中作为内部计数对照（d）用pbCD3活化纯化的WT小鼠T细胞，并用LXR、RXR、GR、PPARγ配体或DMSO对照培养。24h后用7-AAD染色。，流式细胞仪分析。
图S6。LXR公司β信号传导调节细胞周期进程。WT和Lxr公司如图所示，用pbCD3和LXR/RXR配体刺激β−/−T细胞。在指定时间用碘化丙啶对细胞进行DNA含量染色，并用流式细胞仪进行分析。
图S7。LXR功能的获得和丧失不会干扰激活或IL-2信号。（a） WT T细胞上CD69和CD25的表达体外或如所示在LXR/RXR配体存在下用pbCD3活化24小时后。（b） 纯化的WT T细胞经pbCD3激活24小时后，用Brefeldin A培养并用PMA/离子霉素重新刺激，产生IL-2。刺激5h后，用CD4和CD8抗体对细胞进行染色，然后固定、渗透、细胞内IL-2染色并进行流式细胞术分析。（c） 实时PCR分析Lta公司和格兹姆用pbCD3刺激纯化的WT T细胞5天，休息18小时，然后用IL-2再刺激8小时。（d） WT上CD69和CD25的表达，Lxr公司a−/−和Lxr公司用pbCD3激活24小时后的β−/−T细胞。
图S8。抑制增殖需要持续的LXR信号。（a） CFSE稀释用pbCD3刺激纯化的WT T细胞72小时。此外，指示培养物在24小时时接受LXR/RXR激动剂。（b） 培养物用LXR/RXR激动剂预处理2 h，然后清洗，放置在新鲜培养基中，并用pbCD3刺激。72小时后收集细胞并用流式细胞仪进行分析。5×104加入计数珠作为内部计数控制，并通过流式细胞仪对样品进行分析。
图S9。人类淋巴细胞激活期间SREBP-2和LXR转录程序的相互调节。实时PCR分析阿布卡1,抗体cg1,Ldlr公司,嗯,标准4从体外纯化的人外周血淋巴细胞或用pma/离子霉素刺激4h。
图S10。IRF-3不影响TCR介导的淋巴细胞LXR靶基因的下调。实时PCR分析阿布卡1和抗体cg1来自纯化的WT和红外线3体内外或用pbCD3刺激18小时后的−/−T细胞。
图S11：。LXR通过以下途径抑制增殖抗体cg1-胆固醇稳态的依赖性改变。纯化的CFSE稀释抗体cg1用pma/离子霉素和LXR配体刺激−/−和WT T细胞96小时。5×104加入计数珠作为内部计数对照，并通过流式细胞术分析样品。
