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《美国病理学杂志》。2008年12月；173(6): 1617–1627.
doi（操作界面）：10.2353/ajpath.2008.080433
预防性维修识别码：项目经理2626374
PMID：19008372

周细胞和血管周围成纤维细胞是肾梗阻性纤维化胶原生成细胞的主要来源

Shuei-Long Lin公司,*† 塔蒂亚娜·基塞莱娃,‡ 大卫·A·布伦纳,‡和杰里米·达菲尔德*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

了解瘢痕形成性肌成纤维细胞的起源对于识别炎症损伤导致纤维化的机制至关重要。利用表达增强型绿色荧光蛋白（GFP）的转基因报告鼠模型，在I型胶原α1调控下(coll1a1公司)启动子和增强子，我们检测了肾脏中产生coll1a1细胞的来源。在正常肾脏中，足细胞和周细胞都会生成coll1a1公司GFP增强检测到的转录物，以及纤维化肾脏中的转录物，coll1a1公司-GFP表达可准确识别肌成纤维细胞。为了确定循环免疫细胞对瘢痕形成的直接作用，与coll-GFP小鼠骨髓嵌合的野生型小鼠接受输尿管梗阻诱导纤维化。这些小鼠肾脏的组织学检查显示，少量纤维细胞向纤维化肾脏募集，但这些纤维细胞对间质纤维化没有显著作用。相反，使用动力学建模和时间进程显微镜，我们发现第1A1列-表达GFP的周细胞是纤维化肾间质肌成纤维细胞的主要来源。我们的研究表明，血管损伤或血管因素是周细胞迁移和分化为肌成纤维细胞的最可能触发因素。因此，我们的研究结果有助于将纤维化研究重新聚焦于血管系统损伤，而不是上皮损伤。

肾脏中瘢痕生成细胞的起源对于理解炎症损伤导致纤维化的机制至关重要。与其他器官一样，在健康的肾脏中，没有明确的内源性肌成纤维细胞前体被认为存在。1几项研究提出了从骨髓源性CD34+循环细胞（称为纤维细胞）中衍生肌成纤维细胞，并且发表了相互矛盾的数据，表明单独的骨髓源性肌纤维细胞群体有助于肾脏间质成纤维细胞的形成。2,三,4经过上皮-间充质转化（EMT）的受损上皮细胞也被认为有助于肾脏肌成纤维细胞的形成，一些研究表明上皮细胞是肾脏和其他地方成纤维细胞主要来源。5,6我们最近报道了使用稳健、可复制的基因命运定位技术体内上皮细胞对小鼠肾纤维化中的肌成纤维细胞没有显著作用（Humphreys等人，提交出版的手稿）。我们最近的报告表明，对肾脏中肌成纤维细胞的来源进行新的研究是值得的。

肌成纤维细胞是生成和沉积富含胶原蛋白I和胶原蛋白III的病理性细胞外基质的细胞类型，可导致不可逆的纤维化并导致器官功能障碍。针对中间丝α-SMA的抗体已被广泛用作产生胶原蛋白的肌成纤维细胞的标记物，而其他不太被广泛接受的标记物（如转录因子S100A4）也已被报道用于标记肌纤维细胞。5然而，这些标记物都不是肌成纤维细胞独有的，也没有标记定义细胞功能的蛋白质。

成纤维细胞的一个独特特征是，它们生成并沉积到细胞外基质胶原蛋白I中。我们之前已经在产生I型胶原的细胞中生成了表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的转基因小鼠，α1(coll1a1公司)转录本（coll-GFP小鼠）。7,8这些小鼠表达一个3.5 kb的5′coll1a1公司启动子，3′非编码区的0.5kb和四个上游增强子，驱动EGFP的表达，并已被证明具有高灵敏度和特异性标记胶原蛋白Iα1产生细胞7 （图1A）胶原蛋白I，α1是胶原蛋白I原纤维中最丰富的蛋白质。

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周细胞和足细胞诱导coll1a1公司正常coll-GFP小鼠肾脏中的转录物。答：通过将α1（I）胶原基因启动子（−3122到+111）和DNase I超敏位点（HS）4和5（−7kb和−8kb）连接到GFP，生成了Coll-GFP转基因小鼠。DNase I HS是增强基因转录的位置无关调节元件体内.B类：coll-GFP小鼠正常肾小球的图像（放大倍数=原始×1000）与podocin抗体（红色）共标记，细胞核标记DAPI（蓝色）。右侧面板仅显示红色和蓝色通道。足细胞在肾小球中独家表达GFP，并与足细胞素共定位。抄送：表达Coll1a1-GFP的足细胞与突触素共定位，但不与PDGFRβ（红色）或CD31（红色）定位。医生：小动脉周围coll1a1公司-GFP+细胞被确定围绕在αSMA+血管平滑肌细胞周围并与之密切相关（放大倍数=原始×1000）。电子邮箱：间质的coll1a1公司-GFP+细胞在其整个长度上与管周毛细血管的CD31+（红色）内皮细胞密切相互作用。互动第1A1列-GFP+细胞与内皮细胞有密切的粘附区域，提示有钉突和窝突(箭头)周细胞特征（放大倍数=原始×1000）。传真：三色标记显示EBM（蓝色）、CD31+内皮细胞（红色）和coll1a1公司-绿色荧光蛋白+周细胞（绿色）。请注意coll1a1公司-GFP+周细胞位于皮质肾小管周围血管丛的EBM内（放大倍数=原始×1000）。德国：在用αSMA（红色）抗体标记的皮质间质中，许多间质coll1a1公司-可以看到GFP+细胞，但它们不表达αSMA（放大倍数=原始×400）。

我们用这种小鼠模型研究肾脏疾病中胶原蛋白（胶原蛋白I，α1）生成细胞。我们的研究表明，周细胞、调节毛细血管周围网络微血管完整性的内皮下细胞以及血管周围成纤维细胞是肌成纤维细胞的主要来源，包括蜗牛同源物1（Snai1）和DNA结合抑制剂1（Id1）在内的转录因子在肾纤维化的输尿管梗阻模型中，周细胞分化为肌成纤维细胞时被诱导。

材料和方法

Coll-GFP小鼠模型

按照之前在C57BL/6背景中所述，生成并验证了Coll-GFP转基因小鼠。7,8简言之，我们克隆了3.2 kb的胶原蛋白-1（α1）启动子，以及具有7 kb和8 kb 5′启动子增强活性的DNase1超敏位点（HS）。该结构pCol9GFP-HS4,5具有紧邻启动子5′的超敏位点4和5以及启动子EGFP 3′的开放阅读框，当coll1a1公司生成了转录本。如前所述进行基因分型。7,8所有研究均按照哈佛动物资源和比较医学中心批准的方案进行。

骨髓嵌合

骨髓（BM）嵌合小鼠如前所述。9简言之，将来自男性供体的1000万个BM细胞在200μl PBS中注入致命照射（1000 Rads超过30分钟）的同基因女性受体的侧尾静脉，6周后通过荧光确认嵌合就地根据上述方法进行棕黄色被细胞杂交。9简单地说，用1 mol/L硫氰酸钠（80°C，10分钟）培养甲醇-乙酸固定的棕黄色被毛细胞，然后用蛋白酶K消化（37°C，15分钟），用0.1 mol/L HCl培养（37°C,10分钟），再用4%多聚甲醛固定，脱水，并风干。荧光就地杂交小鼠Y染色体特异性探针Star*Fish（Cambio，Cambridge，UK）被添加到制造商的缓冲液中。将载玻片加热（80°C，10分钟），孵育（16小时，37°C），然后在缓冲液中严格清洗，最后安装Vectashide/DAPI（Vector Laboratories）。在所有病例中，100%的白细胞标记为Y染色体阳性。

纤维化小鼠模型

手术前，用氯胺酮/噻嗪（100/10 mg/kg，i.p.）麻醉成年（12至20周）或年轻（P12）小鼠（C57BL/6或coll-GFP）。如前所述进行单侧输尿管梗阻（UUO）（Humphreys等，未发表数据），10在第0、2、3、5、7、10和14天收集肾脏、血液、脾脏和骨髓。在一些实验中，如前所述，通过侧腹切口暴露左侧肾脏的单侧缺血再灌注，并在第0、7和15天采集肾脏。用手术刀在侧面切开创面，用夹子夹住创面，形成全层皮肤创伤。在第2、3、5、7、10和14天解剖伤口进行分析。为了确定第二个炎症信号是否可以诱导纤维细胞进一步分化，在一些实验中，在UUO手术后连续静脉注射脂多糖（6μg/g，L-2880，Sigma）3天，并在第7天处死小鼠进行分析。

组织制备和组织学

如前所述，制备小鼠组织并进行染色。9,10对伤口皮肤进行解剖和横切，以暴露表皮和表皮下肉芽组织的再上皮化，并如上所述进行固定。针对以下蛋白质的初级抗体用于免疫标记：αSMA-Cy3（1:200，克隆1A4，Sigma）、CD14、CD11b、CD11c、CD45、CD16/32、MHC II类（I-A/I-E）（1:200，eBioscience）、CD34、Ly6C、（Pharmingen）7/4、（ABD-Serotec）、Ki-67（1:200，克隆SP6，Fisher）、层粘连蛋白（1:100，Sigma）、NG2（1:500）、血小板衍生生长因子（PDGF）β受体（PDGFRβ[1:500]，podocin[1:200]；S100A4[1:200]DAKO，以及Abcam）和WT1（1:100，Santa Cruz）。荧光缀合的亲和纯化的第二抗体标记（1:400至1:800，Jackson），用Vectashield/4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）固定，如前所述进行图像捕获和处理。9,10研究coll1a1公司-在处死前2小时腹腔注射GFP细胞，5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU），50μg/g。用鸡抗GFP抗体（1:500，Aves Labs）标记五分钟冰冻切片，然后用鸡抗Cy2抗体（1:400）标记，固定后（4%多聚甲醛，1分钟）用2N HCl孵育（15分钟，37°C），然后用0.1 mol/L硼酸（5分钟，室温）孵育两次。用羊抗BrdU抗体（1:200，Abcam）培养切片，然后用抗羊Cy3抗体（1:400）培养切片并按照上述方法安装。为了研究coll1a1产生细胞与内皮细胞和毛细血管基底膜（CBM）的关系，用CD31抗体（1:200，eBioscience）标记冰冻切片，然后用Cy3-结合二级抗体标记，然后用抗层粘连蛋白抗体标记，最后用抗兔Lexa Fluor350抗体标记（1:500，Molecular Probes），并安装了Prolong Gold。如前所述，对组织切片中的特定细胞进行定量。9简言之，各部分与DAPI相结合科尔1a1-绿色和蓝色核共定位鉴定GFP+细胞；αSMA+、NG2+或PDGFRβ+细胞通过细胞核周围大于75%的细胞面积（DAPI检测）染色阳性，Cy3荧光显示抗原表达；通过Cy3荧光阳性核染色鉴定Ki-67+或BrdU+细胞。在每只小鼠原始放大倍数×400的条件下，随机选择10个皮质间质区，对特定细胞进行计数。为了研究纤维细胞向肾脏、脾脏和皮肤伤口的募集，Colla1公司-每只BM嵌合体小鼠在每个时间点研究三只小鼠时，在六个不连续的全矢状面切片中计数GFP+细胞。

血液、脾脏和肾脏的单细胞制备

用柠檬酸钠（0.38%）从下腔静脉采集血液（500μl）。如上文所述，用冰冷的PBS和脾脏及肾脏冲洗出剩余血液。使用Ficoll-Paque PLUS（GE Health care）从柠檬酸化全血中分离外周血单核细胞。通过轻轻按压玻璃载玻片将脾脏分解，收集在PBS中，并去除聚集物（70μm过滤器）。单个细胞重新悬浮在荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中9离心后。在HBSS中用游离酶（0.5 mg/ml，罗氏）和脱氧核糖核酸酶（100U/ml，罗氏。在某些情况下，通过将单个细胞悬浮液重新悬浮在PBS中，然后将其覆盖在不连续的percoll梯度（PBS中为33%，66%）上并离心（20分钟，620×克). 通过使用FACSAria细胞分选分离GFP+细胞，从正常或d7 UUO Coll-GFP小鼠肾脏（PBS和1%牛血清白蛋白中）的单细胞悬浮液中纯化肾成纤维细胞或周细胞。

流式细胞术分析

单个电池（1×105)将来自肾脏、外周血单个核细胞或脾脏的细胞重新悬浮在FACS缓冲液中9并与抗CD14、CD11b、CD11c、CD45、MHC II类（I-A/I-E）（PE，1:200，eBioscience）、CD86、CD115、CD34（PE，1-200，Pharmingen）、CD16/32、F4/80（APC，eBioccience，4°C，含1%小鼠血清。在用FACS洗涤缓冲液洗涤后，9并在200μl FACS缓冲液中重复使用，用BD-FACSCalibur流式细胞仪分析细胞。

逆转录PCR

使用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）分离总RNA。纯度由A260至A280测定。使用寡核苷酸（dT）和随机引物合成cDNA。10用特异性引物5′-gAAAATggACAgTCTAgAgACTCTg-3′和5′-g TggCTgATTggCAAgACCTCTg-3′对小鼠Twist进行PCR，50℃退火，35个周期；Snai1，5′-AgCCCAACTATAAgCgAgCTg-3′和5′-CCAggAgAgTCCCAgATg-3′；骨形态发生蛋白-7（Bmp7），5′-TACgTCAgCTTCgAgACCT-3′和5′-gCTCAggAgAgTTggTCGg-3′，50℃，32个周期；Id1，5′-CATgAACggCTgCTACTCAC-3′和5′-gTggTCCCgACTTCAGC-3′，50℃，29个循环；GAPDH 5′-ACTCCACTCACggCAAATTC-3′和5′-CACATTGGgTAggAACAC-3′，50°C退火，23个循环。定量PCR是使用前面描述的方法测定的10以及以下附加引物对：Twist 5′-CCCACTTTTgACgAAgAAAA-3′and 5′-AAAATggAgCCAgTCCACAg-3′，Bmp7 5′-gTACgTCAgCTTCgAgACC-3′and 5’-ggTggCgTTCATgTAggA gT-3′。周细胞和成纤维细胞cDNA的纯度通过排除Kim-1（上皮细胞）、F4/80抗原、Emr-1（巨噬细胞）和CD31内皮细胞转录物的污染而得到确认。11

统计分析

误差线是平均值的SE。计算Td日使用Prism软件（Graphpad）将曲线拟合到细胞数量与时间的关系图。用数学方法计算细胞周期时间Tc（c）导出了一个方程，分析了周细胞进入细胞周期的比例随时间线性增加的细胞数增加。使用Matlab/Simulink软件（Mathworks，Natick，MA）推导并求解方程。

结果

正常肾脏中周细胞、血管周围成纤维细胞和足细胞表达Coll-GFP

表达EGFP的小鼠受coll1a1公司如前所述生成启动子和增强子7,8此处称为Coll-GFP小鼠（图1A）在健康肾脏中，肾小球足细胞表达GFP，表明coll1a1公司转录。足细胞共表达足细胞素（图1B）和突触素（图1C）.系膜细胞不表达coll1a1公司 （图1C）在小动脉和小静脉周围，一群细小的血管周细胞表达coll1a1公司但用αSMA抗体标记的血管平滑肌细胞没有用GFP发出荧光（图1D）.血管周围第1A1列-表达细胞被称为血管周围成纤维细胞。12,13小动脉血管周成纤维细胞与血管平滑肌细胞的比值为0.33±0.05。在皮质和髓质的间质中，管周毛细血管间歇性排列着coll1a1公司产生细胞。这些细胞主要是内皮下细胞，与表达CD31-的内皮细胞直接并列，并显示出花梗样的附着斑块，提示“钉-窝突”coll1a1公司-产生细胞与内皮细胞直接相互作用（图1E类).12,14这些特征定义了肾小管周围coll1a1公司-产生周细胞样的细胞。为了确定它们的位置，内皮基底膜（EBM）被贴上抗层粘连蛋白抗体的标签。在EBM中可以清楚地看到表达GFP的周细胞（图1F）在某些情况下，细胞体位于EBM外，而在EBM内发现有花梗样附着斑块。重要的是，在正常肾脏中没有GFP表达细胞标记为内皮标记物CD31或中间丝αSMA（图1G）肾间质周细胞与内皮细胞的比值为0.40±0.06。

纤维化肾脏中Coll1a1生成细胞与α-SMA表达不完全相关

探讨coll1a1公司-我们诱导了UUO，这是一种用于诱导肾脏炎症性纤维化的稳健和标准化模型。在coll-GFP小鼠梗阻7天后，许多间质细胞表达GFP，但在上皮细胞中未检测到GFP，表明上皮细胞不是I型胶原的来源（图2A）GFP的足细胞表达未受影响，系膜细胞不表达GFP（未显示）。组织切片标记αSMA的表达（图2A）梗阻后7天，肾脏中αSMA+细胞和GFP+细胞之间存在密切但不完全的相关性（图2B类)。值得注意的是，1%coll1a1公司-产生间质细胞不表达αSMA，荧光显微镜下，间质中25%的αSMA+细胞不表达可检测到的GFP水平。因此，并非所有α-SMA细胞都在生成coll1a1公司纤维化肾脏中的信息。据报道，S100A4（成纤维细胞特异性蛋白-1）是肾脏肌成纤维细胞的替代标记物。S100A4的抗体标记与coll1a1公司-产生细胞（图2C类)，表明S100A4是第1A1列-在肾脏中产生细胞。然而，S100A4+细胞共同表达单核细胞/巨噬细胞白细胞标记物（表1），表明体内S100A4标记的白细胞不是成纤维细胞。进一步探索coll1a1公司-我们标记coll-GFP-UUO肾脏组织切片中内皮细胞（CD31）的生成细胞（图2D）、髓系白细胞（CD11b）（图2E）和白细胞共同抗原CD45。小鼠的切片(n个=5/组），在第3、5、7、10和14天，GFP与CD31或CD11b没有重叠，但少量用CD45标记的白细胞表达GFP，量化为共同表达GFP的CD45+细胞的0.09%±0.04%。可以肯定的是，我们检测到白细胞生成coll1a1公司我们从纤维化肾脏中生成了单个细胞，并鉴定出单个细胞清楚地共同表达GFP和CD45（图2F）建议一些coll1a1公司-产生细胞来源于白细胞。

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科尔1a1-来自d7输尿管梗阻的GFP+间质细胞与αSMA+间质上皮细胞不完全相关，少数共同表达白细胞标记物CD45。答：coll-GFP小鼠d7-UUO肾脏的显微照片(左侧面板)αSMA抗体联合免疫标记(右侧面板). 注意GFP的上皮小管表达缺失以及αSMA和GFP共同表达的异质性（放大倍数=原始×200）。B类：每个HPF的细胞数量图(左侧面板)、和比例(右侧面板)共表达αSMA的GFP+间质细胞和共表达αSMA+细胞的比例coll1a1公司-正常和d7 UUO肾脏中的GFP。在UUO肾脏中，25%的αSMA+细胞不表达coll1a1公司-GFP但100%的coll1a1-GFP细胞表达dSMA。C–E：coll-GFP小鼠d7UUO肾脏荧光显微照片(C类)S100A4（红色），放大倍数=原始×1000；(天)CD31（红色），放大倍数=原始×1000；或(E类)CD11b（红色），放大倍数=原始×200。传真：单细胞制剂形式的d7 UUO肾显示单细胞共表达CD45（红色）和第1A1列-显示细胞核的GFP（蓝色），放大倍数=原始×1000。

表1

共表达其他细胞标志物的S100A4+间质细胞在纤维化肾脏中的比例

第1列-GFP+α形状记忆合金+CD11b型+CD68型+80层/四层+
%0 (0)6.5 (3.9)93.1 (3.2)74.6 (6.5)28.4 (4.0)

数据表示为平均值（SEM）。 

纤维细胞对产生Coll1a1的细胞数量的贡献较小

进一步探讨骨髓衍生的贡献coll1a1公司-我们制作骨髓（BM）嵌合小鼠，将coll-GFP小鼠BM移植到受照致死的野生型小鼠体内，确认嵌合后，进行UUO手术诱导肾纤维化，并在0、2、3、5、7、10和14天检测肾脏（图3）.少量BM衍生coll1a1公司-GFP细胞仅在血管周围区域检测到，在纤维化肾脏中多见小静脉，但在正常肾脏或对侧无梗阻肾脏中未检测到，这与纤维细胞的描述一致（图3，A，H）然而，在肾矢状切面中，平均只有10个BM衍生coll1a1公司-GFP细胞占所有肌成纤维细胞的比例不到0.1%，这与我们在野生型小鼠中的观察结果一致。BM的招聘模式coll1a1公司-肾脏的GFP细胞与纤维化的发展不一致：而肌成纤维细胞随着时间和平台呈指数增长（参见图4)，纤维细胞在肾脏疾病中出现较晚，随着纤维化的进展数量减少（图3H）.BM衍生coll1a1公司-肾脏中的GFP细胞共同表达CD34（58.1±10.2%）和CD45（100%），组织切片中的一些髓系细胞标记物与先前对纤维细胞的描述一致，15但不表达αSMA（0%）或S100A4（0%）(图3，C–F;表2). 从纤维化肾脏和骨髓来源的肾脏中纯化单细胞coll1a1公司-流式细胞术检测GFP细胞的白细胞标志物（表2）证实CD34和CD45共同表达，但MHC II类和B7-2水平也很高，表明在抗原提呈中可能起作用。肺、心脏、小肠、大肠、肝脏和胰腺不含coll1a1公司-在BM嵌合体中产生细胞。血白细胞不表达coll1a1公司-流式细胞术检测GFP。然而，骨髓和脾脏（红髓）含有少量纤维细胞，这些纤维细胞是在UUO手术48小时内诱导的（图3G）通过流式细胞术，脾纤维细胞具有与肾纤维细胞相似的标记物，明显缺乏CD11b和CD11c，但表达其他髓系树突状细胞标记物（表2）我们将这些研究扩展到损伤后2周出现间质纤维化的单侧肾脏缺血再灌注模型（缺血再灌注后第15天纤维化面积为5.8±0.6%，而假手术为0.2±0.05%）。在这些研究中，嵌合体得到了证实，尽管脾中出现了许多纤维细胞，但在损伤后早期，肾脏在损伤后2天内未发现纤维细胞，而在缺血再灌注损伤后7天和15天，每个肾矢状切面分别发现3.0±1.2和0.6±0.2纤维细胞，进一步支持了我们的数据，即纤维细胞在肾纤维化中的作用很小。我们继续确定纤维细胞在皮肤损伤中的作用。在BM-coll-GFP嵌合小鼠中检测全层皮肤伤口。虽然检测到许多伤口成纤维细胞，但没有发现纤维细胞（图3H）支持我们的观察，即纤维细胞在纤维化的进展中没有直接作用。

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输尿管梗阻时肾脏和脾脏的纤维细胞募集。将雄性coll-GFP骨髓移植到受致命照射的雌性WT小鼠体内。通过评估Y染色体的白细胞，在6周时确认嵌合。答：coll-GFP⇒WT骨髓嵌合小鼠d7 UUO肾脏血管周围GFP+细胞图像（放大倍数=原始×400）。B类：通过嵌合体小鼠d14-UUO肾脏的苦味酸红染色确认该模型中的广泛纤维化。注意显著的血管周围纤维化(箭头)以及间质纤维化。抄送：coll-GFP的UUO肾脏中d7的图像⇒WT-BM嵌合体小鼠显示GFP+细胞共同表达CD34和CD45，证实这些细胞是纤维细胞（放大倍数=原始×400）。E–F：显示BM衍生的d7 UUO肾脏图像coll1a1公司-GFP+细胞缺乏αSMA或S100A4表达（放大倍数=原始×400）。德国：UUO手术后48小时，coll-GFP⇒WT-BM嵌合体小鼠脾脏的红髓，注意存在GFP+细胞。高：纤维细胞募集到纤维化肾脏、脾脏和全厚皮肤伤口的时间过程。肾脏、脾脏横切面和皮肤伤口横切面的细胞数为每个矢状切面。

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输尿管梗阻后，成人肾脏中大多数肌成纤维细胞的出现是由周细胞迁移、增殖和分化引起的。答：UUO手术后0小时、9小时和24小时周细胞的显微照片及其与内皮细胞的关系（标记为CD31表达）。0小时时，周细胞与内皮细胞贴壁，GFP表达较低。在9小时时，GFP表达增加，周细胞所占面积增加，一些周细胞与内皮细胞分离(箭头). 24小时时，许多周细胞已经从内皮细胞中移出(箭头)并显示细胞扩大或扩散的迹象（放大倍数=原始×400）。B类：通过形态计量学评估肾间质中GFP面积的时间进程。到12小时，与假手术组相比，肾脏中的GFP+面积增加，反映周细胞增大或扩散。抄送：间隙数量的时间进程coll1a1公司-UUO手术后的GFP+细胞/HPF。从第0天到第4天coll1a1公司-GFP+细胞。指数曲线与给出T的数据拟合d日2.2天。医生：Ki-67+间隙百分比的时间进程coll1a1公司-GFP+细胞。电子邮箱：NG2与coll1a1公司-GFP+间质细胞。注意在UUO病发生6小时内诱导NG2。传真：αSMA与coll1a1公司-GFP+间质细胞。αSMA的诱导发生晚于NG2。G–H：NG2和PDGFRβ表达的显微照片coll1a1公司-UUO诱导48小时后GFP+间质细胞。注意，右侧面板显示红色和蓝色通道只是为了清晰起见。

表2

肾纤维化后Coll-GFP骨髓嵌合小鼠脾脏和肾脏的纤维细胞表面标记物

CD45型CD14号机组CD115型CD16/32型CD647/4赖氨酸6CCD34型
肾脏IHC++ND（无损检测）++/−ND（无损检测）ND（无损检测）+/−
肾脏FACS++++++/−+++/−
脾脏FACS++++++/−+++/−
I-A/I-E公司B7–2号机组CD11b型80层/四层CD11c公司α形状记忆合金S100A4型Desmin公司
肾脏IHCND（无损检测）ND（无损检测）−−−−−−
肾脏FACS+++−−−ND（无损检测）ND（无损检测）ND（无损检测）
脾脏FACS+++−−−ND（无损检测）ND（无损检测）ND（无损检测）

ND=未完成。 

进行性纤维化中间质胶原生成细胞群的扩张可以用周细胞初始群的增殖来解释

我们以前和目前的研究表明，肌成纤维细胞并非来源于肾上皮细胞或循环白细胞（Humphreys等人，提交出版的手稿）。周细胞可能是肌成纤维细胞的来源，因为周细胞转录coll1a1公司基因位于基底部，分布于肾小管周毛细血管和coll1a1公司-GFP血管周围成纤维细胞沿着小血管分布，类似于肌成纤维细胞。为了进一步研究，我们评估了UUO发育的早期时间点，以追踪周细胞和肌成纤维细胞的外观（图4A）最初可以看到所有周细胞都粘附在毛细血管上，但在UUO后9小时内，周细胞增加了GFP的表达，表明GFP的诱导coll1a1公司转录本和GFP面积增加所检测到的传播增加（图4，A和B）在24小时内，周细胞脱离毛细血管，48小时时周细胞数量显著增加（图4，A和C）。由于GFP转录被抑制后EGFP将在细胞内停留24小时以上，因此观察到的事件不太可能是由于从头开始出现新的细胞类型，周细胞消失。研究人口增长coll1a1公司-GFP细胞进一步用Ki-67抗体标记细胞，Ki-67是一种检测细胞周期所有阶段细胞的细胞周期标记物（图4D）.我们量化了间质的数量coll1a1公司+并将其与coll1a1公司+细胞周期中的细胞（图4、C和D）. There was an exponential increase in第1A1列+肾纤维化发展的前4天，间质中的细胞数量增加了一倍（Td日)共2.2天（图4C）这一增长与coll1a1公司+细胞周期中的细胞（图4D）到24小时，43.7%coll1a1公司+间质细胞处于周期中，48小时时线性增加至>75%。通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍标记染色，在这些时间点没有周细胞凋亡的证据。在其他研究中，据报道，小鼠淋巴细胞或恶性细胞的细胞周期为12小时至45小时。16,17通过研究组织切片不可能准确量化细胞周期时间。18然而，在24小时时间点之前的2小时内coll1a1公司+间质细胞将BrdU并入新DNA中（穿过G1通过细胞周期的S期）表明细胞周期时间coll1a1公司-GFP细胞将在已发表的小鼠细胞增殖研究范围内。我们用一个数学模型来研究填隙物的数量膨胀coll1a1公司+单元格：

方程式M1

其中Nt吨=时间t时的数量，N0=时间0时的数量，P=细胞周期中的比例，以及Tc（c）=细胞周期时间。使用Td日导出Nt吨和t，并假设P在疾病的前2天呈线性增加（来源于图4D)我们计算出，如果加倍时间为2.2天，细胞周期将为45小时。

与恶性细胞或骨髓细胞相比，45小时的细胞周期时间代表了较高的细胞周期，这意味着我们的研究与以下假设一致：coll1a1公司+肾间质中的细胞来自于从内皮下间隙迁移过来的周细胞的增殖。

周细胞没有明确的标记物，但在其他研究中，尤其是视网膜周细胞，使用了αSMA、结蛋白、NG2和针对3G5表位的抗体。12,19,20,21,22,23我们标记组织中的αSMA和NG2（图4，E–G）在正常肾脏中，系膜细胞和血管平滑肌细胞表达NG2（未显示），但只有2.8%的周细胞用标记NG2标记。疾病诱导后仅6小时coll1a1公司+细胞数量周细胞NG2表达增加/coll1a1公司+单元格（图4E）与肌成纤维细胞来源于周细胞的假设一致。48小时后，超过一半（53.2%）的coll1a1公司+表达NG2的细胞（图4，E，G）到96小时，所有（100%）coll1a1公司+细胞表达NG2。相反，在正常肾脏中，周细胞不表达αSMA。疾病诱导6小时后周细胞αSMA仍为阴性，24小时后仅6.4%coll1a1公司+细胞表达αSMA。然而，在随后的24小时内，该细胞群中αSMA的表达显著增加（图4F）.发病48小时后，一半以上的间质coll1a1公司+细胞同时表达NG2和αSMA（图4，E–G）因此，根据定义，它们都是肌成纤维细胞。到7天，98%的coll1a1公司+间质细胞表达αSMA（图2B）在其他研究中，PDGFRβ被周细胞和成纤维细胞表达，是内皮细胞募集周细胞的重要受体，在内皮细胞向周细胞发出成功的旁分泌信号中起重要作用。20,24,27在正常成人肾脏中，所有周细胞都被PDGFRβ抗体标记，并且在疾病诱导后coll1a1公司+细胞继续表达PDGFRβ（图4H）与周细胞是肌成纤维细胞前体一致。在正常成年小鼠中，11.0±1.2%的PDGFRβ表达细胞没有表达coll1a1公司-GFP。在任何时候都没有第1A1列+细胞共同表达CD31，这是内皮细胞的标记物。

在新生小鼠中，周细胞表达NG2和αSMA，当周细胞分化为肌成纤维细胞时，这些标记物被保留

令我们惊讶的是，成年肾脏中的周细胞并不表达其他人报道的标记周细胞的标记物。19,20,21,22然而，许多周细胞的研究都集中在新生儿眼睛上。据报道，周细胞随着成熟而失去标记物。12我们假设年轻小鼠的肾周细胞可能保留周细胞标记物并共同表达coll1a1公司-GFP，然后在发育后逐渐失去周细胞标记物。因此，在对幼年小鼠进行UUO手术后，可以使用已建立的周细胞标记来跟踪这些周细胞的命运。对P12（出生后12天的新生儿）coll-GFP小鼠的肾脏进行分析，因为此时肾脏已完全发育。28P12肾脏有许多间质coll1a1公司+内皮下区的细胞（图5A）与CD31+内皮细胞并列。98.4%coll1a1公司+细胞表达NG2，均表达αSMA和PDGFRβ（图5，A–C）因此，在发育完全的新生儿肾周细胞中，周细胞共同表达其他周细胞标记物，这与肌成纤维细胞的定义一致。然而，4天后，在P16中，正常小鼠中只有74.0%的周细胞表达NG2，94.5%表达αSMA，证实随着周细胞在肾脏中成熟，它们会丢失一些周细胞标记物（图5、B和C）。我们在P12小鼠中诱导UUO，观察周细胞的增殖和colla1公司+间质细胞（图5、D和E）然而，在健康小鼠中，周细胞随着时间的推移丢失NG2和αSMA标记物，而在患病小鼠中/colla1公司+间质细胞没有丢失标记物，而是丢失了colla1公司+、NG2+、αSMA+、PDGFRβ+细胞扩增为我们定义为肌成纤维细胞的所有细胞（图5，B–E）因此，这些研究支持成年小鼠的数据，表明周细胞是肾脏肌成纤维细胞的来源。T型钢d日新生鼠周细胞的扩增时间为3.2天，略长于成年小鼠。

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正常新生小鼠肾脏coll1a1公司-输尿管梗阻后GFP周细胞表达周细胞标记物并分化为肌成纤维细胞。答：低倍（放大倍数=原始×200）视图coll1a1公司-P12正常肾脏中的GFP+周细胞。P12正常肾脏周细胞的高倍视野（放大倍数=原始×400）显示与CD31+内皮细胞粘附(上部中央面板)，PDGFRβ的共表达(右上角)、NG2（左下面板和中间面板）和αSMA(下右). 注意，除了NG2阳性染色外coll1a1公司-GFP+周细胞，NG2被切割成一种可溶性的蛋白多糖，与小管基底膜结合。NG2的同位素对照抗体标记显示周细胞或小管膜没有染色（未显示）。B类：显示百分比的时间进程coll1a1公司-GFP+间质细胞，在正常衰老肾脏（P12–P16）或P12小鼠UUO后共同表达NG2。注意，正常肾周细胞随着年龄增长而失去NG2，但UUO可以阻止这种情况的发生。抄送：显示百分比的时间进程coll1a1公司-GFP+间质细胞，在P12小鼠肾脏正常衰老（P12至P16）或UUO后共同表达αSMA。注意，正常肾周细胞随着年龄增长而丢失αSMA，但UUO可以阻止这种情况的发生。医生：数量的时间进程coll1a1公司-P12小鼠和P16健康小鼠UUO后的GFP+间质细胞/HPF。请注意coll1a1公司-UUO后的GFP+间质细胞数量coll1a1公司-健康小鼠的GFP+间质细胞随着年龄的增长而减少。电子邮箱：显示Ki-67+间隙百分比的时间进程coll1a1公司-GFP+细胞。

输尿管梗阻后Coll1a1生成细胞中诱导与纤维化相关的转录因子Snai1和Id1

我们的研究已经确定周细胞是肾脏肌成纤维细胞的主要来源。为了了解周细胞分化为肌成纤维细胞的潜在分子机制，我们选择了与肌成纤维纤维细胞外观相关的候选转录因子或信号分子。有报道称，一些细胞在培养的上皮细胞中促进EMT，但我们最近的研究不支持EMT作为成纤维细胞的来源体内（Humpheys等人，提交出版的手稿）。转录因子Twist与肿瘤发生和EMT有关在体外.29在幼年小鼠中，一些周细胞和其他间质细胞（但不是上皮细胞）表达Twist，核表达水平较低（图6A）在患病肾脏中，由于持续的高背景水平（未显示），无法解释Twist免疫标记。为了进一步研究Twist的诱导，通过流式细胞术分选，从正常肾脏纯化周细胞，从UUO肾脏纯化肌成纤维细胞，依靠GFP荧光将这些细胞与其他细胞分离。纯度通过缺乏上皮、内皮和白细胞标记物（未显示）得到证实。通过逆转录聚合酶链式反应扩增转录物，并通过常规聚合酶链式反应和定量聚合酶链式反应将其与成人全肾（UUO或对照肾）的转录物进行比较。尽管扭曲与对照肾相比，UUO肾中的转录物增加，扭曲转录水平不受周细胞向成纤维细胞分化的影响（图6、B和C）转录因子Snai1和Id1也与纤维化的发展有关。30,31 斯奈伊1与对照肾相比，纤维化肾中的转录物增加，周细胞表达，但与周细胞相比，肌成纤维细胞表达增加（图6、B和C）.标识1与健康肾脏相比，患病肾脏的转录物表达下调，但标识1与周细胞相比，肌成纤维细胞中的转录物增加。此外，转化生长因子超家族的细胞因子Bmp7的转录物被周细胞表达，并在肌成纤维细胞中下调，Bmp7被认为通过调节Id1表达在部分抑制纤维化中发挥作用（图6、B和C）.

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当周细胞分化为肌成纤维细胞时，周细胞上调转录因子Snai1和Id1而非Twist体内.答：P12新生儿肾脏在许多缺乏皮质间质细胞的细胞质和细胞核中显示Twist表达coll1a1公司-GFP表达，也有少数周细胞(箭头)而不是上皮细胞（放大倍数=原始×400）。(B类)PCR和(C类)代表性定量PCR显示扭曲,斯奈伊1，Id1，以及Bmp-7型成人健康肾脏、UUO肾脏（第7天）、纯化周细胞和纯化coll1a1公司-GFP+肌成纤维细胞d7 UUO。与周细胞相比，肌成纤维细胞中蜗牛转录物和Id1转录物上调。

讨论

这些研究确定了两个来源colla1公司-肾纤维化输尿管梗阻模型中的产生细胞：纤维细胞和周细胞。前者对胶原蛋白生成细胞的贡献较小，小于0.1%，而后者的固有细胞群占肾脏肌成纤维细胞的大多数。利用基因命运定位技术，我们最近排除了上皮转分化的重要作用体内肾纤维化输尿管梗阻模型中肌成纤维细胞的出现（Humphreys等人提交）。虽然我们目前的研究不排除内皮细胞转分化，但我们没有发现内皮细胞共表达的证据coll1a1公司-GFP，提示内皮细胞体内不是肌成纤维细胞的重要来源。

我们的研究没有使用基因命运定位技术来跟踪肾周细胞向肌成纤维细胞的分化。然而，动力学分析结合coll-GFP作为周细胞标记物在成年小鼠中的使用强烈表明，大多数（如果不是全部）肌成纤维细胞来源于第1A1列+小动脉周围的间质周细胞和血管周成纤维细胞。研究coll1a1公司+新生儿肾脏中的细胞也证明周细胞是肌成纤维细胞的主要前体细胞。如前所述，我们不能排除成人肾脏中有第二批肾细胞参与正常肾脏中最初不表达的肌成纤维细胞coll1a1公司-GFP，但随后在损伤后诱导GFP表达。可能有少量coll1a1公司正常成人肾脏存在阴性周细胞。少量PDGFRβ+，科尔1a1正常成人肾脏的肾间质中可见阴性细胞，而新生儿肾脏中未见阴性细胞。这些细胞的身份尚未确定，但PFGFRβ对周细胞/肌成纤维细胞没有特异性。虽然我们不能排除内皮细胞转分化为肌成纤维细胞，但我们没有在coll-GFP小鼠中记录到CD31+内皮细胞诱导GFP表达的任何例子。因此，我们已经解释了所有主要的细胞类型（上皮细胞和白细胞），这些细胞可能会导致患病肾脏中的肌成纤维细胞群。

确切地说，周细胞位于EBM内，与相对的内皮细胞形成栓接点。这一定义在很大程度上来源于对新生儿视网膜的研究，其中周细胞与内皮细胞的比率为1.0。在成人肾脏中，我们发现周细胞与内皮细胞的比率显著降低，为0.4，并且并非所有周细胞都完全位于EBM内。然而，几乎所有的周细胞都有证据表明，这些过程延伸至CBM，并直接与下层内皮细胞形成花梗样附着物。在大鼠肾脏的电镜研究中，类似的细胞被称为皮质间质成纤维细胞。13在这种情况下，值得注意的是，最近的几项研究也表明，正常肾脏中的内源性“成纤维细胞”是肌成纤维细胞的前体，尽管没有一项研究使用动力学建模或基因命运图。32,33,34

周细胞是肌成纤维细胞的主要来源，这一事实使纤维化研究的重点重新调整为血管系统。我们的研究没有将上皮损伤作为纤维化的驱动力，而是推测血管损伤或血管因素实际上是周细胞迁移和分化为肌成纤维细胞的最可能触发因素。事实上，已知肾脏UUO会导致肾血流量和肾小球滤过率下调，这表明循环因素可能是周细胞迁移的重要触发因素。了解受损或缺血内皮细胞与邻近周细胞之间的信号需要进一步研究。据报道，周细胞作为旁分泌细胞支持血管完整性，并提供重要的血管生成因子，包括血管生成素-1和-2。12,23,35周细胞缺乏与动脉瘤形成和自发性出血有关。27从内皮细胞到周细胞的PDGF信号传导对于周细胞沿着毛细血管的发育和血管稳定的募集是必要的。最近的眼部研究表明，周细胞和巨噬细胞可能在预定的血管发育退化过程中协同删除内皮细胞。23在这些研究中，周细胞释放血管生成素-2是向内皮细胞撤回生存信号所必需的。在某些情况下，由于异常血运重建，纤维损伤与各种情况下毛细血管的丢失有关。这一点值得注意，因为在肾脏中，纤维化与肾小管周围毛细血管减少有关。36此外，在糖尿病视网膜血管疾病中，周细胞丢失被发现是构成糖尿病视网膜病变的血管异常发展的重要起始因素。26因此，一个中心问题是，纤维化的发展是否会导致肾小管周毛细血管的有效周细胞丢失，而这种有效周细胞的丢失是肾小管周围毛细血管丢失的一个原因，以及许多慢性肾脏疾病中观察到的随之而来的慢性缺血。

PDGFRβ已被用作周细胞的标志物，并通过内皮细胞旁分泌PDGFB而被认为是周细胞募集和存活的重要受体。健康成人肾脏中的所有周细胞都表达PDGFRβ，所有肌成纤维细胞继续表达PDGFR-β。PDGF分泌被认为是肌成纤维细胞的自分泌生长因子在体外，但它的作用体内肾脏纤维化的发生和发展尚不清楚，37尽管在皮肤伤口愈合中，PDGFRβ阻断已被报道可延迟伤口闭合。38巨噬细胞对于肾脏成纤维细胞的增殖和基质沉积的诱导是必要的。39未来的研究应确定巨噬细胞传递的PDGF在纤维化和周细胞分化的启动中是否重要。据报道，NG2是眼睛和大脑周细胞的标记物，但报告表明NG2仅由活跃的周细胞表达，这与我们在肾脏的发现一致。12我们的研究表明，静止的周细胞下调并丢失周细胞标记物，只有在损伤诱导激活后才能获得这些标记物。

转录因子S100A4与肾脏纤维化的发展密切相关。40然而，我们的研究发现S100A4存在于巨噬细胞中，而不存在于胶原生成细胞中。我们之前已经证明巨噬细胞在肾脏和其他器官纤维化的发展中起着重要作用。10,39这种机制需要巨噬细胞向肌成纤维细胞发出信号，因为巨噬细胞本身不生成胶原基质。对于之前报道的S100A4在纤维化中的作用的一种解释是，它是纤维化前巨噬细胞发育中的一个重要转录因子。需要进一步研究来阐明这是否是S100A4的作用机制。

在接受EMT的上皮细胞中研究了许多被假定为调控纤维化发展的基因在体外,41,42,43还有一些证据确凿体内为了确定周细胞向成纤维细胞分化的潜在调节因子，我们选择了候选转录因子。扭曲转录物不受分化调节，但周细胞有斯奈伊1和标识1，与周细胞相比，它们在肌成纤维细胞中持续上调，并且Bmp-7型与周细胞相比，肌成纤维细胞中的表达下调，这与它们在纤维化发展中的作用一致。需要进一步研究来确定这些转录因子和细胞信号分子在周细胞分化和迁移中的确切作用。

虽然肾纤维化研究的重点是上皮细胞作为纤维化的原因，但我们发现周细胞是肌成纤维细胞的来源可能并不奇怪。有报道称周细胞可以分化为血管平滑肌细胞、成纤维细胞、成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。12,44在疾病状态下，周细胞向成骨细胞分化被认为有助于异位钙化。在纤维化皮肤病中，周细胞被确定为成纤维细胞的主要来源，45在肝脏和胰腺中，星形细胞与内皮细胞并列，可能是一种特殊的周细胞。46有趣的是，足细胞表达coll1a1-GFP，这表明它们在肾小球瘢痕形成中可能比先前认为的更为重要。在coll-GFP小鼠的肾毒性肾炎小鼠中，系膜细胞和足细胞都生成coll1a1转录物（手稿正在准备中）。健康的肾小球基底膜不含纤维胶原，尽管可能含有少量非纤维胶原I型α链，47,48很可能是由足细胞合成的。足细胞与周细胞共享coll1a1-GFP表达的事实表明，足细胞在内皮健康中具有周细胞样作用。因此，有趣的是，仅足细胞中血管内皮生长因子的基因缺失足以引发内皮细胞死亡和严重的血栓性肾小球损伤。49

我们的研究证实存在一种被定义为纤维细胞的细胞，该细胞不表达αSMA。虽然我们在受损的肾脏、脾脏和骨髓中检测到纤维细胞，但在循环中未检测到，这表明纤维细胞在局部分化为第1A1列+来自预先存在的细胞或来自循环白细胞（如单核细胞）的细胞。此外，脾脏和骨髓损伤中的募集模式，以及肾脏缺乏持续募集和皮肤创伤中没有募集，表明它们是急性期应答细胞，而不是成纤维细胞。它们在脾脏中的存在与高表达的抗原呈递分子相结合，表明它们的功能更像树突状细胞，而不是成纤维细胞。然而，纤维细胞似乎构成了一类新的髓样树突状细胞，因为它们缺乏CD11b，并且表达CD34。

总之，我们的研究确定了coll1a1公司+正常肾脏周细胞是肾纤维化输尿管梗阻模型中肌成纤维细胞的主要来源。

致谢

感谢Sushrut Waikar博士（哈佛医学院）协助数学建模，Deneen Kozoriz（HMS）协助FACS分类，William Stallcup博士（伯纳姆研究所）协助抗NG2和抗PDGFRβ抗体，Inna Gitelman博士（以色列本古里安大学），Jing Yang博士（UCSD）协助抗扭转抗体，以及Dr。Martin Pollak（HMS）检测抗足细胞素和抗突触足蛋白抗体。

脚注

向哈佛医学院炎症研究实验室Jeremy S.Duffield请求转载第个马萨诸塞州波士顿Blackfan Circle 4号楼02115。电子邮件：ude.dravrah.hwb.scir@dleiffudj或Shuei-Long Lin，电子邮件：gro.cmutn@lsnil公司.

由NIH拨款DK73299（J.S.D.）、美国肾脏病学会（Gottschalk Award）、Promedior Inc.Genzyme肾脏创新项目（J.S.D）以及台湾国家科学委员会NSC-095-SAF-I-564-601（S.L.L.）的一项奖助支持。

这些研究在2007年旧金山美国肾脏病学会年会上作了部分介绍。

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文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会