细胞凋亡是一个基因调控的过程，对生物体的发育至关重要，但其失调会导致神经退行性疾病和癌症2,三凋亡途径中的一个关键事件是细胞色素的释放c（c）来自线粒体。在健康细胞中，细胞色素c（c）位于线粒体膜间空间，作为电子传输链的氧化还原载体。然而，在对许多凋亡刺激的反应中，细胞色素c（c）释放到胞浆中，在胞浆中可以启动凋亡小体复合体的形成，导致caspase激活和随后的细胞死亡4新出现的证据表明，诸如有丝分裂后神经元之类的细胞和必须克服细胞死亡反应的癌细胞都能严格抑制凋亡途径1有趣的是，尽管神经元和癌细胞在形态和功能上存在显著差异，但两者都能广泛代谢葡萄糖5,6在这里，我们研究了相互依赖葡萄糖代谢对神经元和癌细胞抗凋亡能力的增加是否至关重要。
我们评估了内源性细胞色素的能力c（c）使用截断Bid（tBid）激活交感神经元的凋亡。全长Bid在细胞内被切割成tBid，以响应某些凋亡刺激，然后在tBid中充当细胞色素的有效诱导剂c（c）线粒体释放7虽然tBid-GFP质粒DNA在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中的表达导致了快速和完全的凋亡，但神经生长因子（NGF）维持的交感神经元仍然对tBid-GWP的表达具有显著的抵抗力(,补充信息，图S1). 已知交感神经细胞对外源性微量注射细胞色素有抵抗力c（c）因为XIAP对半胱天冬酶的严格抑制。与野生型神经元相比，XIAP缺失的交感神经元对微量注射过量的外源性细胞色素敏感c（c）8然而，我们惊讶地发现内源性的细胞色素c（c）即使在XIAP缺失的神经元中，tBid也不能诱导凋亡(). 尽管tBid没有诱导细胞凋亡，但它完全能够释放细胞色素c（c）在这些神经元中(,补充信息，图S2a). 同样，在神经元中注射Bid BH3肽可诱导细胞色素的有效释放c（c）没有导致死亡的线粒体(补充信息，图S1c,S2b美元). 有趣的是，尽管释放了细胞色素c（c）这些神经元保持线粒体膜电位(补充信息，图S2c)9因此，在NGF维持的神经元中，内源性细胞色素的释放c（c）即使没有XIAP也不能诱导细胞凋亡(补充信息，图S3). 关注这种意料之外的细胞色素后XIAP依赖机制c（c）我们在从XIAP缺乏小鼠分离的神经元中进行了以下所有实验。
内源性细胞色素c（c）释放不能诱导NGF维持的交感神经元凋亡a）将培养的MEF或交感神经元注射tBid-GFP或GFP质粒。细胞存活率通过细胞形态进行量化，并表示为注射后24小时与5小时相比活的和健康的绿色细胞的百分比*表示无MEF存活。显示MEF和神经元的代表性照片；箭头指向注入的细胞。b）XIAP-/-交感神经元或野生型窝友被注射EGFP或tBid-GFP，细胞存活率如（a）所示。c）将tBid-GFP注入交感神经元，并允许其表达24小时。细胞固定，细胞色素状态c（c）免疫荧光分析。线粒体细胞色素阳性神经元百分比c（c）在XIAP-/-神经元中定量。d）XIAP-/-交感神经元要么维持在含有NGF的培养基中，要么剥夺NGF 8小时（有或没有50μM zVAD），然后注射EGFP或tBid-GFP。通过细胞形态量化细胞存活率，并表示为注射后16小时与5小时相比活的和健康的绿色细胞的百分比。e）XIAP-/-交感神经元被剥夺NGF（有或没有50μM zVAD）12小时，然后注射罗丹明或细胞色素c（c）（2.5μg/μl）与罗丹明一起标记注入细胞。在注射后的不同时间点评估细胞存活率。误差条代表三个独立实验的±SEM。
尽管神经元对直接细胞色素有抵抗力c（c）通过tBid释放，交感神经元容易接受细胞色素c（c）-多种凋亡刺激介导的细胞死亡10,11因此，凋亡刺激必须使内源性细胞色素c（c）能够激活神经元的凋亡。事实上，神经生长因子剥夺和足叶乙甙引起的DNA损伤使交感神经元对tBid介导的细胞色素诱导的凋亡敏感c（c）释放(,补充信息，图S1b，c,S4a系列). 由于tBid可能导致线粒体释放多种因子，我们研究了这种观察到的效应是否是对细胞色素增敏的直接结果c（c）的确，注射细胞色素c（c）进入NGF缺失或DNA受损的神经元（在内源性细胞色素之前的某个时间点c（c）释放）也显示出更高的灵敏度(,补充信息，图S4b).
细胞色素具有凋亡活性c（c）必须以全酶的形式存在，并带有血红素修复基团12.体外研究已经检测了细胞色素的氧化还原状态c（c）影响其凋亡活性。而有些显示氧化细胞色素c（c）更具凋亡活性，其他人认为这种简化的形式也可以发挥作用13-19特别是，Borutate和Brown最近的一项研究表明，细胞色素的氧化c（c）通过细胞色素c（c）氧化酶促进半胱氨酸天冬氨酸酶的激活，而它被叔甲基苯二胺还原阻止了半胱氨酸蛋白酶的激活18同样，细胞色素被氧化但未被还原c（c）发现可促进渗透性HepG2细胞的凋亡19.确定细胞内氧化还原环境是否影响完整神经元对细胞色素的敏感性c（c），我们用低水平过氧化氢（H2O（运行）2)创造一个更氧化的环境，或细胞渗透性还原型谷胱甘肽（GSH）来模拟一个还原的环境。注射2.5μg/μl细胞色素的神经元c（c）注射后10-16小时内出现大量死亡(). 然而，H2O（运行）2大大提高了神经元对注入细胞色素的敏感性c（c）()而谷胱甘肽处理的神经元具有抵抗力(). 这些结果表明，在完整细胞中，氧化还原环境对细胞色素的能力有显著影响c（c）促进细胞凋亡。
细胞色素的氧化c（c）增加其凋亡活性a）XIAP-/-交感神经元用20-50μM的H2O（运行）220分钟，然后注射细胞色素c（c）蛋白质和罗丹明，或仅罗丹明染料。在注射后的不同时间点评估细胞存活率。b）用10 mM GSH乙酯处理XIAP-/-交感神经元12小时，然后注射细胞色素c（c）与罗丹明或罗丹明单独使用。在注射后16小时评估细胞存活率。c）XIAP-/-交感神经元注射细胞色素c（c）或细胞色素c（c）与10单位/ml细胞色素预孵育c（c）还原酶。在注射后16小时评估细胞存活率。d）XIAP-/-交感神经元注射细胞色素c（c）或细胞色素c（c）与DTT预孵育（随后分离）以减少这种细胞色素c（c）6小时后评估生存率。e）在10 mM GSH存在下，在NGF上剥夺XIAP-/-交感神经元8小时，然后注射EGFP或tBid-GFP构建物。通过细胞形态量化细胞存活率，并表示为注射后16小时与5小时相比活的和健康的绿色细胞的百分比。f）外源细胞色素c（c）（主要是氧化的）以10 uM的浓度添加到神经元提取物中550培养15分钟后测量。测量Abs的对照实验550还原或氧化的细胞色素c（c）也显示了。结果是三个独立实验的平均值（±SEM）。
由于氧化还原环境的变化会产生广泛的影响，我们确定了还原细胞环境抑制细胞色素的能力c（c）-介导的凋亡是细胞色素特异性失活的结果c（c）.培养外源细胞色素c（c）（主要被氧化）与细胞色素c（c）还原酶或DTT使细胞色素减少c（c）(补充信息，图S7a)促进注射神经元凋亡的效果较差(). 因此，氧化细胞色素c（c）是比细胞色素减少更有效的凋亡诱导剂c（c）此外，我们产生了细胞色素的N52I突变体c（c）增加了稳定性20虽然该蛋白在完整细胞中的氧化还原状态尚不清楚，但注射N52I突变细胞色素c（c）与野生型细胞色素相比，进入交感神经元诱导的凋亡显著减少c（c）(补充信息，图S5).
细胞溶质细胞色素的观察c（c）要求氧化细胞环境促凋亡导致两种预测。首先，tBid诱导细胞色素的能力c（c）释放促进MEF而非NGF维持的神经元凋亡可能是由于其氧化还原环境的显著差异。与此一致，我们发现氧化还原敏感染料5-（和-6）-氯甲基-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H）的平均强度2与MEF相比，DCFDA）在交感神经元中减少了5倍，表明交感神经元的活性氧（ROS）水平降低(补充信息，图S6a). 第二，神经生长因子缺乏，使神经元对细胞色素敏感c（c）-诱导死亡，可能导致氧化细胞环境增加。众所周知，细胞的氧化还原状态在凋亡过程中会发生改变21的确，CM-H测量的ROS强度2神经元NGF剥夺后，DCFDA和二氢罗丹明（DHR）升高超过2.5倍(补充信息，图S6b，c)22,23NGF剥夺后活性氧的增加对细胞色素的产生至关重要c（c）-介导细胞凋亡，因为添加GSH完全抑制NGF剥夺对细胞色素致敏神经元的能力c（c）tBid发布(). 重要的是，我们检查了NGF维持的能力是否存在差异与去NGF裂解物对细胞色素氧化还原状态的影响c（c）如预期，当细胞色素被氧化时c（c）在缺乏NGF的裂解液中保持氧化，与NGF维持的神经元裂解液孵育后迅速减少(). 同样，添加还原细胞色素c（c）导致其在缺乏NGF而非NGF维持的神经元裂解物中氧化(补充信息，图S7b)表明细胞色素c（c）在NGF维持的健康神经元中以不同的氧化还原状态存在，与那些因NGF缺乏而发生凋亡的细胞。
谷胱甘肽是最常见的细胞内还原剂之一，通过清除活性氧维持氧化还原平衡。我们发现内源性谷胱甘肽对维持细胞色素是必要的c（c）在NGF-维持的神经元中处于非活动状态，如用马来酸二乙酯（DEM）去除GSH或用丁硫代二磺胺（BSO）抑制GSH合成，导致ROS增加22并使细胞对细胞色素敏感c（c）(,补充信息，图S8a). 细胞内GSH水平通过还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）维持，NADPH是葡萄糖通过戊糖磷酸途径代谢时产生的24我们检测了戊糖磷酸途径是否对调节神经元的氧化还原状态以及细胞色素起重要作用c（c）-介导的细胞凋亡。用戊糖磷酸途径抑制剂脱氢表雄酮（DHEA）或6-氨基茴香酰胺（6-AN）处理的神经元积累高水平的ROS，并对内源性细胞色素敏感c（c）发布tBid(,补充信息，图S8b). 由于背根神经节（DRGs）的感觉神经元也对tBid释放的细胞色素c有抵抗力，但在DHEA治疗后变得敏感，因此这种效应并非来自颈上神经节的神经元所独有(补充信息，图S9). 总之，这些数据表明，通过戊糖磷酸途径的葡萄糖代谢通过维持GSH水平和直接限制细胞色素来促进神经元存活c（c）-介导的细胞凋亡。
磷酸戊糖分流在细胞色素中的作用c（c）-介导的细胞凋亡a）通过氧化还原敏感染料CM-H的荧光强度观察交感神经元的平均活性氧水平2用0.1mM DEM消耗GSH 30分钟后的DCFDA。b）用0.1 mM DEM处理XIAP-/-交感神经元（NGF-维持）30分钟，然后注射细胞色素c（c）罗丹明或罗丹明染料。在不同时间点评估细胞存活率。c）使用200μM DHEA抑制戊糖磷酸途径24小时后，观察到平均ROS水平如（a）所示。d）XIAP-/-交感神经元（NGF-维持）用200μM DHEA治疗6小时，0.1mM 6-AN治疗24小时，或不治疗，然后注射tBid-GFP或EGFP结构。与注射后5小时相比，16小时时的细胞存活率表示为健康绿色细胞的百分比。误差条表示n≥3的±SEM。
与神经元一样，许多癌细胞也能广泛代谢葡萄糖，这种现象被称为Warburg效应6.研究癌细胞葡萄糖代谢增加是否直接调节细胞色素点的凋亡c（c），我们首先检测了癌细胞对细胞色素胞浆注射的敏感性c（c）.细胞色素c（c）在Smac存在的情况下注射，以消除IAP的活性，这些IAP已知可以阻止许多癌细胞中caspase的激活25因此，重点关注细胞色素的IAP无关机制c（c）监管。而正常细胞在胞浆细胞色素的作用下容易发生凋亡c（c），癌细胞表现出更强的抵抗力(,补充信息，图S10a). 令人惊讶的是，对细胞色素的敏感性降低c（c）与这些癌细胞中细胞内谷胱甘肽水平的增加密切相关(). 有趣的是，用细胞通透性谷胱甘肽（GSH）治疗MEF可增加其对细胞溶质细胞色素的抵抗力c（c）(). 此外，在培养氧化细胞色素时c（c）MEF裂解物对氧化细胞色素的氧化还原状态没有显著影响c（c），氧化细胞色素c（c）与癌细胞产生的裂解物孵育后迅速减少().
葡萄糖代谢保护癌细胞免受细胞色素损伤c（c）-介导的细胞凋亡a）将细胞色素注入正常细胞（人类乳腺上皮细胞-HuMECs、MEFs、人类皮肤成纤维细胞-HDFs）或癌细胞系（Sk-Mel 103、HeLa、JM2）c（c）30分钟后评估Smac蛋白和细胞存活率。b）在正常有丝分裂细胞和癌细胞株中测量总谷胱甘肽（GSH），并以GSH占细胞总蛋白的浓度表示。c）用5 mM GSH乙酯处理MEF 15分钟，然后注射细胞色素c（c）1小时后，对注射细胞进行Annexin V阳性评估。照片显示细胞色素的典型Annexin V-FITC染色c（c）注射的细胞（箭头）。d）外源细胞色素c（c）（主要是氧化的）以10μM的浓度添加到正常或癌细胞提取物中550培养15分钟后测量。e）CMH荧光法测定HeLa细胞中ROS的平均水平2DCFDA在不存在或存在磷酸戊糖途径抑制剂DHEA（200μM）的情况下持续6小时。f）添加200μM DHEA，然后注射细胞色素，可抑制各种癌细胞系中磷酸戊糖途径6小时c（c）和Smac蛋白。在3小时时评估细胞存活率。g）JM2和HeLa细胞被剥夺葡萄糖16小时，然后注射细胞色素c（c）和Smac，并评估不同时间点的生存率。图像是细胞色素染色后3小时JM2细胞的代表性图像c（c）注入。误差条表示n≥3的±SEM。
接下来我们研究了通过戊糖磷酸途径增强HeLa和JM2癌细胞的葡萄糖代谢是否有助于细胞氧化还原平衡，从而抵抗细胞色素c（c）事实上，戊糖磷酸抑制剂DHEA的加入增加了活性氧水平，并使这些癌细胞对胞浆细胞色素敏感c（c）(,补充信息，图S10b). 重要的是，葡萄糖缺乏也导致对细胞色素的敏感性增加c（c）(). 总之，这些结果表明细胞色素的能力c（c）诱导细胞凋亡受到氧化还原状态的严格调控，而葡萄糖流量是细胞色素的关键调节器c（c）-介导的细胞凋亡。
通过偶联细胞色素的促凋亡活性c（c）对于戊糖磷酸途径，葡萄糖代谢增强的细胞，如神经元和癌细胞，能够有效地维持细胞色素的限制性环境c（c）-介导的细胞凋亡。这种调节对于再生能力有限、长期存活、有利于癌细胞避免凋亡的神经元具有特别重要的生理意义。通过磷酸戊糖途径的流量可能在多种情况下抑制细胞凋亡。例如，最近研究表明，DNA损伤激活p53后TIGAR上调参与磷酸戊糖途径并促进细胞存活26葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的过度表达也显示通过戊糖磷酸途径增加GSH从而促进肿瘤形成27我们的结果表明，这种抑制细胞凋亡的特殊机制是通过细胞色素的直接失活c（c）.
虽然维持氧化还原稳态是戊糖磷酸途径的主要功能，但通过该途径的流量也可能在其他方面抑制细胞凋亡。例如，通过戊糖磷酸途径产生的NADPH通过一种不依赖于GSH合成的机制使爪蟾卵提取物中的caspase-2保持在非活性状态28.
接受细胞色素处理的神经元c（c）-介导的凋亡必须克服多重阻滞才能发生细胞死亡。我们之前已经证明内源性XIAP是一种有效的细胞色素抑制剂c（c）-介导的神经元凋亡8这里，内源性细胞色素c（c）其本身不能在NGF维持的神经元中诱导细胞凋亡。作为对营养因子剥夺后发育性凋亡的反应，这些神经元不仅表现出XIAP降解以允许半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活，而且葡萄糖摄取显著减少29ROS增加(补充信息，图S6b，c)8,22,23我们的结果表明，这对激活细胞色素至关重要c（c）从而导致细胞凋亡。
细胞内活性氧增加和线粒体损伤在衰老过程中常见，并与许多神经退行性疾病（包括帕金森氏病）中的凋亡细胞死亡相关30,31我们的研究结果提供了一种机制性的见解，即ROS的适度增加如何启动神经元凋亡，以应对线粒体损伤和细胞色素等潜在的非致命事件c（c）释放。
根据大多数标准，神经元和癌细胞确实是截然不同的。不同的癌细胞本身似乎在不同的点抑制了凋亡途径。然而，这些结果表明，神经元进化出的限制凋亡的多种机制可能与某些有丝分裂细胞在癌变过程中所适应的机制相同。
材料和方法
试剂
除非另有说明，否则所有试剂均购自西格玛（密苏里州圣路易斯）或费希尔科学公司（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。胶原酶和胰蛋白酶购自Worthington生化公司（新泽西州Freehold）。GSH:GSSG试剂盒购自Calbiochem（加利福尼亚州圣地亚哥）。马细胞色素c（c）从Sigma购买。zVAD-fmk购自Enzyme Systems（加利福尼亚州利弗莫尔）。Annexin VFITC从研发系统公司（明尼阿波利斯，明尼苏达州）购买。如前所述，从细菌中纯化重组Smac蛋白8MEF是Douglas Green博士（田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院）提供的一份礼物。HDFs和HeLa细胞是从北卡罗来纳州组织培养设施获得的，JM2细胞是埃克逊·霍尔穆哈梅多夫博士（北卡罗来那州查佩尔·希尔北卡罗来娜州北卡罗来尼亚州北卡罗莱纳州北卡罗来纳州）的一份礼物。Sk-Mel 103细胞是Channing Der博士（北卡罗来纳州Chapel Hill北卡罗来那州北卡罗来尼亚州北卡罗莱纳州）赠送的一份礼物。XIAP-/-老鼠是Craig Thompson博士（宾夕法尼亚大学，费城，PA）送的一份礼物。
交感神经细胞培养
从出生后第0-1天的野生型ICR或XIAP缺陷C57BL/6小鼠的颈上神经节中分离出初级交感神经元，并按上述方法进行培养8细胞以每孔10000个细胞的密度被镀在胶原涂层的培养皿上。神经元在含有NGF的培养基中培养4-5天，然后在实验条件下处理。为了去除NGF，用缺乏NGF的培养基冲洗培养物三次，然后向该培养基中添加山羊抗NGF中和抗体。用所用浓度的各种化合物处理细胞：足叶乙甙（20μM）；DHEA（200μM），6-AN（0.1 mM）；数字高程模型（0.1 mM）；GSH-乙酯（10 mM）；BSO（200μM）。
微量注射和细胞存活定量
细胞注射马细胞色素c（c）蛋白质（2.5μg/μl）或Bid BH3肽（8 mM）（AnaSpec8注射后立即计数罗丹明阳性细胞的数量。在注射后的不同时间，使用相同的计数标准确定剩余活注射细胞的数量，并表示为显微注射细胞原始数量的百分比。这种评估存活率的方法与其他细胞存活率测定有很好的相关性，如台盼蓝排斥法和钙黄绿素AM染色法8.
在涉及DNA显微注射的实验中，将微注射缓冲液中的100纳克/μl tBid表达质粒或EGFP载体注射到神经元或MEF的细胞核中。为了量化注射后的存活率，分别在注射后5小时和24小时对GFP阳性细胞进行计数。细胞存活率表示为注射后24小时活GFP阳性细胞与注射后5小时GFP阳性的细胞的比率。由于tBid是一种快速的死亡诱导剂（在某些条件下），因此细胞中tBid-GFP的可检测表达与凋亡之间的窗口很窄。因此，我们为时间零点选择了一个较早的时间点，以便不排除任何可能在此之后不久死亡的细胞。在tBid-GFP或单独注射GFP不杀死细胞的条件下，随着一些额外的细胞在初始计数后开始表达可见的GFP，这个数字变得大于100%。在发生细胞死亡的条件下，这种死亡被确认为caspase依赖性，因为它可以被zVAD-fmk（50μM）抑制。根据制造商的方案，通过Annexin-V阳性评估细胞存活率。
免疫荧光法评估细胞色素c（c）释放
细胞色素的地位c（c）用免疫荧光检测线粒体是否完整或释放。交感神经细胞表现出带有抗细胞色素的点状线粒体染色c（c）抗体，作为细胞色素丢失c（c）简单地说，培养的交感神经元被固定在4%的多聚甲醛中，并与抗细胞色素孵育过夜c（c）（556432，BD Biosciences）或抗GFP（细胞信号）一级抗体，然后与抗鼠Cy3、抗鼠Alexa 488和抗鸡Alexa 48二级抗体（Jackson Labs）孵育2小时。细胞核用Hoechst 33258（分子探针）染色。
ROS测量
氧化还原敏感染料CM-H2DCFDA或二氢罗丹明（DHR）（分子探针）用于测量交感神经细胞培养物和细胞系中的ROS水平，使用之前描述的方案22.CM-H型2DCFDA在还原时是非荧光的，细胞渗透后被酯酶裂解，并被困在细胞中，在细胞中氧化将其转化为荧光形式。在不同实验条件下处理细胞后，用10μM CM-H培养细胞2DCFDA或10μM DHR 20分钟，然后在PBS中冲洗3次。细胞的荧光强度以图像表示，或通过测量50μM内的像素强度进行量化2使用Metamorph软件或使用Fluoroskan（ThermoLabSystems）平板读取器测量荧光强度。
制备还原细胞色素c（c）和评估细胞色素c（c）氧化还原状态
细胞色素c（c）将其与10单位/ml细胞色素c还原酶（NADPH）孵育，然后注射到神经元中，可使其减少。或者，细胞色素c（c）用0.5 mM DTT减少，然后在PD-10柱上分离（GE Healthcare）。细胞色素的氧化还原状态c（c）通过在纳米滴分光光度计上监测其550 nm处的吸光度进行评估。用于分析细胞色素氧化还原活性的实验c（c）在剥夺NGF后，交感神经元以100000个细胞的密度被镀上，并维持在NGF中，或剥夺NGF 12小时。收集神经细胞裂解物并与氧化细胞色素孵育c（c）（10μM）持续15分钟，然后进行上述分析。对于有丝分裂细胞，氧化细胞色素c（c）（10μM）与200μg细胞裂解物孵育15分钟，然后在550 nm处进行测量。
还原型谷胱甘肽测量
根据Tietze改良方法的制造商方案，使用GSH:GSSG比例试剂盒进行GSH:GSSG的测量32简单地说，细胞在5%偏磷酸中溶解15分钟，离心，上清液中的谷胱甘肽含量通过谷胱甘苷还原酶和NADPH存在下，在412 nm处5,5′-二硫代双（硝基苯甲酸）的比色变化率来测量。将酸性颗粒重新悬浮在1 N NaOH中，并使用Lowry方法（BioRad）测量可溶性蛋白质浓度。总谷胱甘肽（GSH）表示为每μg细胞蛋白中谷胱甘苷的ng。
图像采集和处理
所有图像均通过安装在Leica倒置荧光显微镜（DMIRE 2）上的Hamamatsu ORCAER数字B/W CCD相机获取。图像采集软件为Metamorph 5.0版（Universal Imaging Corporation）。图像被缩小并在Adobe Photoshop中裁剪，以准备最终的图形。
