细胞死亡传统上被归类为凋亡或坏死。虽然细胞凋亡是一种受调控的细胞机制，但坏死是由过度应激引起的被动细胞死亡。坏死的特征是质膜完整性迅速丧失、细胞器肿胀和线粒体功能障碍，以及缺乏典型的凋亡特征，如核小体间DNA断裂和核浓缩。尽管已知坏死发生在多种病理条件下，但由于相信坏死的非调节性，因此对其进行研究的工作很少。对死亡受体的研究支持调节性坏死机制。Fas和TNFR死亡受体家族的激活通过招募衔接蛋白（如FADD）和上游caspase（如caspase-8）诱导“原型”凋亡途径。有趣的是，在某些细胞类型中，在凋亡缺陷的条件下用FasL或TNFα刺激可诱导具有坏死形态学特征的细胞死亡(Kawahara等人，1998年;Vercammen等人，1997年). Fas/TNFα受体的激活可能导致以凋亡或坏死为特征的细胞死亡，这一事实有力地证明存在与凋亡分离的调节性细胞坏死机制，我们称之为“坏死性凋亡”(Degterev等人，2005年).
RIP1是一种与死亡受体相关的含有死亡域的激酶，但其激酶活性对于诱导死亡受体介导的凋亡是不必要的(Grimm等人，1996年). 然而，在凋亡不足的情况下，死亡受体激动剂激活坏死性下垂需要RIP1激酶活性(Holler等人，2000年). 在我们之前的研究中，我们分离出了多种小分子坏死抑制素抑制剂（Necs）(Degterev等人，2008年;Degterev等人，2005年). 重要的是，我们已经证明Nec-1是RIP1激酶活性的变构抑制剂(Degterev等人，2008年). 使用Nec-1作为工具，坏死性下垂已被发现导致广泛的病理性细胞死亡模式，包括缺血性脑损伤、心肌梗死、兴奋性毒性和化疗诱导的细胞死亡(Degterev等人，2005年;Han等人，2007年;Smith等人，2007年;Xu等人，2007年). 在这里，我们通过对坏死所需基因进行全基因组siRNA筛选，广泛探索了坏死的分子机制和功能意义。我们的研究定义了细胞坏死途径的遗传图谱，阐明了凋亡和坏死凋亡之间的联系，并暗示坏死凋亡是先天免疫的关键调节途径，并表明坏死凋亡在人类疾病中的潜在作用。
结果
坏死性下垂所需基因的筛选
研究表明，zVAD.fmk处理L929细胞可诱导坏死性下垂，而Nec-1可抑制坏死性下坠(Degterev等人，2005年). 利用该模型，我们筛选了覆盖整个小鼠基因组（16873个基因）的Dharmacon siRNA文库中的坏死所需基因(). RIP1 siRNA被用作阳性对照，因为敲除RIP1可以有效阻止zVAD.fmk诱导的细胞凋亡(). 在非靶向siRNA（Dharmacon）转染的细胞中，zVAD.fmk的处理诱导了约80%的细胞死亡。如果siRNA的ATP水平（细胞存活的替代物）高于平板的平均ATP水平>2SD，则该siRNA被评为阳性。使用该标准，666个基因被评分为zVAD.fmk诱导L929细胞坏死所需的候选基因。正如预期的那样，rip1在该分析中被评为命中，为我们的方法提供了验证().
坏死性下垂所需基因的siRNA筛选(一个)第一和第二屏幕的示意图。(B类)L929细胞，未转染(一)，或转染非靶向siRNA（ctrl）或50nM的RIP1 siRNA 48小时(b条)用20μM zVAD.fmk加或不加30μM Nec-1处理18小时。通过使用抗RIP1或抗Tubulin（底部面板）的western blotting分析siRNA转染的L929的裂解物。(C类)相控显微镜照片显示20μM zVAD.fmk处理18小时后，转染指示siRNAs的L929细胞的形态学变化。比例尺：100μm。通过使用CellTiter-Glo测量存活细胞中的ATP水平来评估细胞活力。所有数字中细胞存活率或细胞死亡分析的标准偏差：*=p<0.05，**=p<0.01，***=p<0.001，（n=4）。
为了确认筛选结果，我们使用每个基因的4个单独siRNA重新筛选了666个主要siRNA点击。为了将我们的分析局限于对细胞对坏死敏感性有重大影响的基因，我们要求在4个siRNA中至少有2个siRNA使细胞存活时间比转染非靶向siRNA对照的细胞的存活时间高出3SD以上，并显示表达阳性对照rip1 siRNA的细胞的生存率至少为60%。根据这些标准，432个基因被评为阳性。RIP1再次成为经验证的点击之一，所有4个siRNAs都显示出对zVAD.fmk诱导的坏死性下垂具有保护作用（数据未显示）。
我们使用来自诺华GNF小鼠表达图谱资源的微阵列数据文件，在61个正常小鼠组织中检测了zVAD.fmk筛选中确定的基因的表达(Su等人，2004年)并发现成簇的点击显示免疫细胞和神经细胞/组织的表达增加（FDR-调整第页<0.05) (&补充表1&2). 为了进一步定义免疫细胞类型，我们还分析了一个更大的小鼠免疫微阵列面板，该面板包含119个小鼠细胞/组织样本的基因表达谱，其中83%代表各种类型的初级免疫细胞(Hijikata等人，2007年). 我们观察到来自zVAD.fmk筛选的一组基因在巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞中表达增加，另一组基因在B淋巴细胞和T淋巴细胞中表达增强(&补充表3&4). 免疫系统细胞中的富集表达也表明坏死在调节免疫功能中的作用。
zVAD在小鼠组织和原代细胞中的表达模式(一个)zVAD.fmk屏幕上的基因表达谱显示免疫细胞或神经细胞中的表达显著增加（FDR-adjusted第页<0.05），正如诺华GNF1m微阵列数据中观察到的，该数据检查了61个小鼠组织的表达。(B类)来自zVAD.fmk筛选的基因表达谱显示，在小鼠巨噬细胞、树突状细胞和NK细胞或B淋巴细胞和T淋巴细胞中，从RIKEN资源获得的119个小鼠细胞/组织样本的大型微阵列面板中，表达增加。(C类)zVAD.fmk诱导的原代巨噬细胞死亡中的坏死作用。用100μM zVAD.fmk（含或不含30μM Nec-1）对经巯基乙酸刺激的小鼠分离的腹腔巨噬细胞进行治疗或治疗24小时，并用Sytox分析（Invitrogen）测定细胞死亡。
为了进一步证实坏死下垂在免疫系统中的功能作用，我们测试了初级腹腔巨噬细胞对坏死抑制素-1的敏感性。如所示Nec-1抑制了自发性和zVAD.fmk诱导的巨噬细胞细胞死亡，表明坏死在调节激活的原代巨噬细胞存活中起作用，原代巨噬细胞是参与先天免疫的关键细胞类型之一。另一方面，死亡受体介导上皮细胞系如HeLa细胞、293细胞的细胞死亡(Degterev等人，2005年)和MCF10A（数据未显示）对Nec-1的抑制不敏感。
CYLD是一种肿瘤抑制因子和去泛素酶，由家族性圆柱瘤病中突变的基因编码(Simonson等人，2007年)，在微阵列数据集中被确定为在免疫细胞和神经细胞/组织中增加了基因表达(补充表1&2). 已知CYLD在其激活后被招募到TNFα受体，此外，RIP1已被鉴定为CYPD底物(Wright等人，2007年)表明CYLD可能是坏死途径中的关键调节因子。为了证实CYLD在坏死性下垂中的作用，我们比较了CYD敲除和坏死性下坠抑制的效率。如所示，我们发现单个siRNAs敲除cyld的效率与保护L929细胞免受zVAD.fmk诱导的坏死之间存在良好的相关性。为了进一步证实cyld在细胞凋亡中的作用，我们使用抗人cyld的siRNA来抑制其在FADD缺陷Jurkat细胞中的表达。我们发现抑制Jurkat细胞中cyld的表达也能减轻坏死(). 坏死性下垂的发生与自噬的激活和其标志物LC3II的形成增加有关，后者可被Nec-1有效抑制(Degterev等人，2005年). 一贯地，cyld的敲低也抑制了zVAD.fmk处理的L929细胞中LC3II的诱导().
CYLD敲除抑制坏死性下垂(一个)用3种不同的抗cyld（cyld9和cyld11）和rip1（50nM）的siRNA转染L929细胞48小时，用20μM zVAD.fmk处理额外18小时，并按照使用抗cyld、抗RIP1或抗Tubulin抗体通过western blot证实CYD的敲除效率。(B类)用抗人cyld（cyld6和cyld7）的siRNAs电穿孔人类FADD缺陷Jurkat细胞。48小时后，用10ng/ml TNFα处理细胞16小时，并按照细胞裂解物通过western blotting进行分析，如(一个). (C类)抑制cyld-敲除细胞中LC3-II的诱导。用20uM zVAD.fmk处理稳定表达cyld（sh-cyld）或单独载体（vector）shRNA的L929细胞，并用抗LC3-II、抗cyld或抗Tubulin抗体进行western blotting分析细胞裂解物。
由于CYLD调节TNFα信号(Wright等人，2007年)，cyld的需求表明，TNFα信号的自分泌调节可能参与调节细胞对zVAD.fmk诱导的坏死的敏感性。与这种可能性一致的是，TNFR1（TNFRSF1a）被鉴定为zVAD.fmk诱导的坏死所需的基因之一(补充表6). 由于通过表达crmA抑制caspase，一种由牛痘病毒或多肽caspase抑制剂编码的caspase抑制物被发现使L929细胞对TNFα诱导的坏死敏感(Vercammen等人，1998年)我们的结果表明，TNFR1的自分泌调节有助于zVAD.fmk诱导的细胞凋亡。
坏死性下垂的典型途径
为了深入了解在我们的siRNA筛选中评分的基因的功能，我们使用基因集方法来确定与这些基因簇相关的共同途径。使用分子特征数据库（MSigDB）(Subramanian等人，2005年)，它提供了一个分为不同注释组的约3000组基因的目录，我们针对来自MSigDB的精选基因集（典型路径）和基于基序的基因集（转录因子靶点），对zVAD.fmk诱导的坏死涉及的432个基因的人类同源基因进行了查询。我们确定了被发现显著富集的典型途径(第页与siRNA文库中筛选的全套基因相比，zVAD.fmk的命中率为<0.05）。TNFR1通路的参与非常明确，因为zVAD.fmk屏幕上的多个点击，如TNFR1（TNFRSF1A）、RIPK1、CYLD、JUN和Grb2，在TNF信号中确立了作用。此外，Toll样受体（TLR）通路在经典通路分析中被鉴定为显著富集，也可能参与坏死，因为一些zVAD.fmk命中，如RIPK1、CYLD(Meylan等人，2004年;Yoshida等人，2005年)众所周知，干扰素家族的多个成员（IFNA1、IFNA7和IFNA13）和干扰素诱导基因LRG47/Irgm1也在TLR途径中发挥作用。有趣的是，我们的分析发现，在zVAD.fmk筛查中确定的432个基因中，至少有70个通过围绕TNFR1和TLR信号的先天免疫通路的广泛网络连接，使用通路成分RIPK1、JUN、CD40和SPP1作为锚定点，这些通路成分也是zVAD.fmk点击(). 坏死在先天免疫中的重要作用与zVAD.fmk在免疫系统中的丰富表达一致。该网络为未来探索细胞对坏死性下垂敏感性的调节机制提供了一个框架，以响应多个TLR和死亡受体家族成员。
天然免疫Toll样受体（TLR）信号通路的网络延伸及其在坏死中的参与(一个)网络是通过锚定TLR通路组件（CD40、RIPK1、JUN和SPP1）构建的，这些组件也是zVAD.fmk点击，使用来自文献和高通量酵母双杂交筛选的蛋白质相互作用数据。(B类)自分泌TNFα参与zVAD诱导的坏死性下垂。用指示浓度的抗鼠TNFα抗体（μg/ml）预处理L929细胞1小时，然后用或不用20μM zVAD.fmk或30μM Nec-1处理16小时。(C类)TLR通路参与坏死性下垂。用指定的化学品处理L929细胞19小时。细胞活力的测量如聚I:C；25μg/ml，干扰素γ（IFNγ）；1000U/ml，Nec-1；30微米。
虽然尚不清楚zVAD.fmk治疗会激活TNFR1和TLR通路中的一些信号传导过程，但TNFR1与TLR的激动剂先前已被证明能诱导caspase-非依赖性坏死，我们称之为坏死性坏死(Degterev等人，2005年;Kalai等人，2002年;Temkin等人，2006年;Vercammen等人，1998年;Xu等人，2006年). 与TNFR1在zVAD诱导的坏死中的作用一致，抗体中和TNFα可保护L929细胞免受zVAD.fmk诱导的坏死(). 此外，我们发现，通过与IFNγ和polyI:C（聚肌苷酸：聚胞苷酸）共同处理，L929细胞可以被诱导死亡，polyI:C是一种合成的TLR3双链RNA激动剂，通常用于模拟病毒感染，并且细胞死亡被Nec-1抑制(). 因此，与坏死和先天免疫的联系一致，在干扰素γ存在下，L929细胞中TLR3激活所诱导的细胞死亡需要RIP1激酶活性来诱导坏死。
经典途径富集分析还揭示了谷胱甘肽代谢途径、糖基磷脂酰肌醇途径、参与翻译的蛋白质（包括翻译起始因子）和核糖体蛋白质的参与(补充表5). 通过降低谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）和谷胱甘苷-S-转移酶（GSTA3和GSTO2）的水平提供保护，这有望增加游离谷胱甘素的可用性，与RIP1激活导致细胞内自由基水平增加这一事实相一致，自由基在介导细胞坏死中起着重要作用(Xu等人，2006年;Yu等人，2006年). 同样，通过敲低PGAP1、PIGL和PIGM抑制糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚的生物合成，符合GPI在TNFα信号传导中的要求(福岛等，2004年). 对这些典型通路的识别为zVAD.fmk诱导细胞坏死的分子机制提供了新的见解，也为我们的筛选提供了验证。
转录和翻译在细胞凋亡中的作用
在参与zVAD.fmk诱导的坏死的432个基因中，291个（67%）和281个（65%）可被归类为广泛的分子功能(和补充表6)和生物过程(和补充表7)小鼠基因的类别。核酸结合似乎有富集趋势（未经调整的超几何第页=0.01）和核酸代谢（超几何第页=0.003）zVAD.fmk诱导的坏死相关基因组中的类别与其在siRNA筛查中检测的全球基因组中代表性相关。在使用Benjamini和Hochberg（BH）方法进行调整后，在0.05的水平上，所有功能丰富都不显著，但这可能过于保守，因为功能类别不是独立的。有趣的是，zVAD.fmk清单中的43个基因编码转录因子(补充表6).
凋亡相关基因转录因子结合位点的富集及核酸结合功能来自zVAD.fmk诱导的坏死性下垂二次筛查的432个“hit”基因被分类为(一个)分子功能和(B类)根据PANTHER分类系统对小鼠基因进行生物过程分类。没有注释的基因被排除在点击和全局集分析之外（即在siRNA屏幕中检查的基因）。饼图中显示了至少包含10个基因的类别。分配给每个类别和富集的基因数量第页-值显示在括号中*表示发现丰富的类别（未经调整的超几何第页<0.05）相对于屏幕中检测的全球基因集。按分子功能或生物过程类别分组的指定基因列表见补充表6和7分别是。(C类)使用来自MSigDB和TRANSFAC数据库中定义的TF结合位点的基于基序的基因集，对顺调控元件进行富集分析，尤其是zVAD.fmk诱导坏死相关基因启动子中的转录因子（TF）结合位点。与siRNA文库中筛选出的人类同源基因可映射到的全球基因集相比，我们检测了TF结合基序在zVAD.fmk点击的人类同源序列中的富集情况。条形图显示了使用超几何分布的每条路径的富集p值的负对数。(D类)针对zVAD.fmk的探针的表达谱显示，与坏死抵抗NIH3T3细胞相比，坏死抵抗L929细胞中的表达升高，并将其映射到人类同源基因，并在四种人类细胞系中检测到表达趋势：坏死抵抗Jurkat细胞和坏死抵抗HeLa细胞，HEK293和HEK293T细胞（来自GNF微阵列收集）。对阵列中每个探针的表达式值进行z-score转换。
为了开始表征坏死的调节，我们探索了在我们的siRNA筛选中鉴定的基因的启动子区域是否包含TRANSFAC数据库中定义的共享转录因子结合位点(www.gene-regulation.com)，我们检查了转录因子（TF）靶点（即基于基序的基因集）的MSigDB集合(Xie等人，2005年). 我们发现结合位点丰富（未经调整的超几何第页<0.05）对于TF，如zVAD.fmk诱导坏死相关基因启动子中的MYOG/NF1、MEIS1B/HOXA9、NRF2、HNF4、LEF1、AR、PAX4和PPARG()，表明这些顺式元件参与zVAD.fmk诱导的坏死相关基因的潜在转录调控控制。与这一建议一致，发现雄激素受体（AR）的结合位点在参与坏死性下垂的基因的启动子中富集，AR在zVAD.fmk诱导的坏死性下坠的基因筛查中也很受欢迎(补充表6). 这进一步证明了转录控制坏死性下垂的重要性。
死亡受体介导的细胞凋亡是通过抑制NF-κB转录反应来抑制蛋白质合成而引起的，与之相反，CHX抑制蛋白质合成已被证明可以抑制zVAD.fmk诱导的细胞凋亡(Yu等人，2004年)但不是通过TNFα(补充图1). 因此，通过抑制参与蛋白质翻译的一些重要细胞机制，如Eif3s10、Eif4a1、Eif4e、Eif4ebp2、Eif5b、Pcbp1以及多种核糖体蛋白和参与mRNA剪接的蛋白质，提供了保护(补充表6)可能是由于蛋白质翻译受到抑制。与坏死凋亡是坏死细胞死亡的细胞程序相一致，转录和翻译可能对坏死凋亡的进展至关重要，至少在某些条件下是如此。此外，这些数据表明了一种有趣的可能性，即翻译机制的可用性可能是决定细胞在执行细胞死亡时的选择的另一个因素。
凋亡敏感细胞的基因表达谱
为了检测与细胞对坏死凋亡敏感性相关的转录谱，我们对对坏死凋亡敏感的L929细胞和NIH3T3细胞进行了微阵列分析，我们之前已经证明这些细胞不能发生坏死凋亡(Degterev等人，2005年). 通过比较来自zVAD.fmk筛选的432个hit基因在这两种细胞类型中的表达谱，我们确定了60个zVAD.fmk hit在L929细胞中的表达水平显著高于NIH3T3细胞（FDR-adjusted第页<0.05，折叠式变化>1.5）(补充表8).
为了确定这种转录谱是否保存在已知对坏死凋亡敏感或耐药的其他细胞系中，我们接下来检查了诺华基金会基因组研究所（GNF）细胞系收集的四种人类细胞系（Jurkat、HeLa、HEK293、HEK2903T）的基因表达数据。我们检测的9个基因（EDD1、MPG、CA9、SLC25A15、SIRT5、NPEPL1、DCC1、CD40和COL4A3BP）的趋势似乎是一致的(). 相对于耐药的HeLa、HEK293和HEK293T细胞，这些基因在坏死敏感Jurkat细胞中的表达增加。这些结果表明，zVAD命中基因子集的表达增加可能传递细胞对坏死性下垂的敏感性。
坏死途径的核心成分
TNFα治疗L929细胞强烈诱导细胞凋亡(Fiers等人，1995年). 然而，TNFα也诱导NF-κB的激活，这需要RIP1的中间结构域(Ting等人，1996年). 由于NF-κB的激活是促生存的，因此RIP1 siRNA不能抑制TNFα诱导的L929细胞的坏死(). 另一方面，由于Nec-1特异性靶向RIP1激酶活性且不影响NF-κB的激活，Nec-1抑制TNFα诱导的L929细胞坏死(Degterev等人，2005年) (). 由于RIP1在坏死性下垂的激活中被特异性招募到TNFα受体(Zheng等人，2006年)，TNFα诱导坏死性下垂所需的基因预计是RIP1激酶活性的特异性下游和/或调节因子。
调控坏死和凋亡的基因(一个)L929细胞用40ng/ml TNFα处理20小时，同时或不同时处理30μM Nec-1。用指定的siRNA（tnfr；tnf受体，ctrl；非靶向siRNA）转染的L929细胞用10ng/ml tnfα处理18小时。通过RT-PCR（右下面板）测定L929细胞中TNFα受体的敲除效率。(B类)敲除Parp-2抑制坏死性下垂。转染有指定siRNAs的L929细胞，用20mM zVAD.fmk（左面板）处理18小时，或用10ng/ml TNFα处理20小时（右面板）。以Parp-1为对照，通过RT-PCR测定击倒效率（左下面板）。(C类)敲除Bmf抑制坏死性下垂。用指定的siRNAs（bmf，ctrl，cyld，rip1）转染L929细胞后，按B类通过RT-PCR（左下面板）测定Bmf的敲除效率(D类)Tipe1基因敲除抑制坏死和凋亡。转染有指示siRNAs（tipe1，tnfr，cyld，rip1）的L929细胞按B处理(E类)用10ng/ml TNFα+1.0μg/ml CHX处理转染有指示siRNAs（tipe1，tnfr，rip1，cyld）（40nM）的NIH3T3细胞12小时，同时或不联合处理100μM zVAD，fmk（左下面板）。使用Tipe2作为对照（左上图和右下图），通过RT-PCR测定Tipe1的敲除效率，或通过蛋白质印迹测定RIP1、CYLD（左下图）。细胞活力的测量如.
我们从zVAD.fmk筛选中筛选了666个主要siRNA点击，以寻找TNFα诱导坏死性凋亡所需的基因(). 在非靶向siRNA-转染细胞中，TNFα导致约80%的细胞死亡。tnfr1 siRNA对TNFα诱导的细胞凋亡具有强大的保护作用，用作阳性对照。如果一个基因的4个siRNA中至少有2个将细胞存活率提高到tnfr1 siRNA所提供水平的至少50%，则该基因被评为阳性。该筛查确定了TNFα诱导细胞坏死所需的32个基因(). 由于这32个基因也是zVAD.fmk诱导的坏死性下垂所必需的，我们假设这32个基因组代表了坏死性通路的潜在核心成分。与此建议一致的是，CYLD，之前已经证明它与RIP1相互作用并调节RIP1的泛素化(Wright等人，2007年)是zVAD.fmk或TNFα诱导坏死性下垂所必需的。重要的是，PARP-2是poly-ADP核糖聚合酶家族的成员(Menissier de Murcia等人，2003年)和Bcl-2家族成员Bmf也是zVAD.fmk或TNFα诱导的坏死性下垂所必需的(). 此外，zVAD.fmk和TNFα诱导的坏死性下垂也需要TIPE1(). TIPE1是TIPE2的密切同源物，在介导死亡受体介导的细胞凋亡和先天免疫中发挥重要作用(Sun等人，2008年).
表1
这些基因调节坏死和凋亡筛选小鼠基因组中16873个基因的siRNA文库，以保护L929细胞免受zVAD.fmk诱导的坏死。666次一次命中被选为存活率高于平均平板存活率2SD以上。在zVAD.fmk诱导的细胞坏死的二次确认筛查中，432个基因被评为阳性。针对TNFα诱导的L929细胞凋亡和TNFα-CHX诱导的NIH3T3细胞凋亡分别筛选666个基因的siRNA。一组32个基因在TNFα诱导的坏死性下垂中被评分为阳性（zVAD/TNF盒）。另一组32个基因在TNFα+CHX诱导的细胞凋亡中（zVAD/apoptosis box）评分为阳性。在所有3个筛选中（zVAD.fmk或TNFα诱导的坏死性凋亡和TNFα/CHX诱导的凋亡），一组7个基因（两个框中）均为阳性。
| 符号 | 身份证 | 名称 | | |
|---|
| 内存57 | 66146 | 跨膜蛋白57 | | |
| 组2 | 14784 | 生长因子受体结合蛋白2 | | |
| Pvr公司 | 52118 | 脊髓灰质炎病毒受体 | | |
| Foxi1系列 | 14233 | 叉头箱I1 | | |
| Jph3型 | 57340 | 亲结蛋白3 | | |
| 拉布25 | 53868 | RAB25，RAS癌基因家族成员 | | |
| S100a7a型 | 381493 | S100钙结合蛋白A7A | | |
| 4933439F11里克 | 66784 | RIKEN cDNA 4933439F11基因 | | |
| 4732429D16瑞克 | 217305 | RIKEN cDNA 4732429D16基因 | | |
| 9430015G10瑞克 | 230996 | RIKEN cDNA 9430015G10基因 | | |
| 生物燃料 | 171543 | Bcl2修正系数 | | |
| 默认1 | 13214 | 防御素β1 | | |
| Eif5b型 | 226982 | 真核翻译起始因子5B | | |
| Dpysl4型 | 26757 | 二氢嘧啶酶样4 | | |
| 命令4 | 66199 | 包含4的COMM域 | | zVAD/TNF公司 |
| Txnl4b型 | 234723 | 硫氧还蛋白样4B | | |
| F730015K02瑞克 | 319526 | RIKEN cDNA F730015K02基因 | | |
| Hspbap1型 | 66667 | Hspb相关蛋白1 | | |
| 美格 | 17136 | 髓磷脂相关糖蛋白 | | |
| Mrcl公司 | 353287 | 甘露糖受体样前体 | | |
| 霍克萨3 | 15400 | 同源盒A3 | | |
| 克尼普1 | 70357 | Kv通道相关蛋白1 | | |
| 高尔特5 | 241391 | UDP-N-乙酰-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶5 | | |
| 奥尔夫1404 | 258881 | 嗅觉受体1404 | | |
| 第2部分 | 11546 | 聚（ADP-核糖）聚合酶家族，成员2 | | |
| Tnfrsf1a型 | 21937 | 肿瘤坏死因子受体超家族成员1a |
| zVAD/肿瘤坏死因子/细胞凋亡 |
| Sycp2系统 | 320558 | 突触复合体蛋白2 |
| 附件6v1g2 | 66237 | ATP酶，H+转运，溶酶体V1亚单位G2 |
| Nudt13号机组 | 67725 | nudix（核苷二磷酸连接部分X）型基序13 |
| 斯帕塔2 | 263876 | 精子发生相关2 |
| 圆柱瘤 | 74256 | 柱状瘤病1 |
| 变压器8l1 | 66443 | 肿瘤坏死因子α诱导蛋白8-like 1 |
| 网格2 | 14804 | 谷氨酸受体，离子性，δ2 | | |
| Ephx1型 | 13849 | 环氧水解酶1，微粒体 | | |
| Insm2公司 | 56856 | 胰岛素瘤相关2 | | |
| Stx1a标准 | 20907 | syntaxin 1A（脑） | | |
| 拉萨4 | 54153 | RAS p21蛋白激活剂4 | | |
| Plrg1号机组 | 53317 | 多效性调节因子1，PRL1同源物（拟南芥） | | |
| 序号2 | 20382 | 剪接因子，富含精氨酸/丝氨酸2（SC-35） | | |
| 37卢比 | 67281 | 核糖体蛋白L37 | | |
| 事务处理11 | 73681 | tRNA甲基转移酶11同源物（酿酒酵母） | | |
| 0610009D07瑞克 | 66055 | RIKEN cDNA 0610009D07基因 | | |
| Tmem107型 | 66910 | 跨膜蛋白107 | | |
| Sft2d2系列 | 108735 | 包含2的SFT2域 | | |
| Srcap公司 | 546001 | Snf2相关CREBBP激活蛋白 | | zVAD/凋亡 |
| 第6页 | 66413 | 蛋白酶体（前体，巨蛋白酶）26S亚单位，非ATP酶，6 | | |
| Cwc15号机组 | 66070 | CWC15同源物（酿酒酵母） | | |
| 亚当26a | 13525 | a去整合素和金属肽酶结构域26A（testase 3） | | |
| A130070M06型 | 230050 | 假设蛋白质A130070M06 | | |
| 附件6ap2 | 70495 | ATP酶，H+转运，溶酶体辅助蛋白2 | | |
| 异常1 | 24015 | ATP结合盒，E亚家族（OABP），成员1 | | |
| A530021J07里亚克 | 330578 | Riken cDNA A530021J07基因 | | |
| 奥尔夫380 | 259027 | 嗅觉受体380 | | |
| Rai14公司 | 75646 | 维甲酸诱导14 | | |
| 10卢比 | 110954 | 核糖体蛋白10 | | |
| 皱纹2 | 232430 | cAMP反应元件结合蛋白样2 | | |
| Gpr152号 | 269053 | G蛋白偶联受体152 | | |
凋亡和坏死的常见调节因子
因为我们的屏幕上多次点击，如CYLD和Bmf，之前已经显示有助于细胞凋亡，所以我们假设细胞凋亡和坏死可能具有某些共同的调节因子。为了询问zVAD.fmk屏幕上的任何点击是否也需要用于凋亡，我们从zVAD.fmk屏幕中筛选了666个主要点击，以对抗TNFα和CHX诱导NIH3T3细胞凋亡(). 我们选择这个系统是因为我们之前发现，Nec-1不能抑制由TNFα和CHX在NIH3T3细胞中诱导的细胞死亡，而zVAD.fmk可以有效地阻止细胞死亡，这是细胞凋亡的特征(Degterev等人，2005年). 在对照非靶向siRNA转染细胞中，TNFα处理至少可诱导60-70%的细胞死亡，细胞死亡可被cyld和tnfr1的敲除所阻断，但不可被rip1所阻断(). 再次使用tnfr1 siRNA作为阳性对照。如果一个基因的4个siRNA中至少有2个将细胞存活率提高到在同一平板上表达tnfr1 siRNA的阳性对照细胞的至少80%，则该基因被评为阳性。该筛选确定了TNFα和CHX诱导NIH3T3细胞凋亡和zVAD.fmk诱导L929细胞凋亡所需的32个基因(). 这32个基因的表达可能会对细胞对多种细胞死亡刺激的敏感性产生普遍影响。
总的来说，通过比较zVAD.fmk和TNFα诱导L929细胞坏死所需的基因列表以及TNFα和CHX诱导NIH3T3细胞凋亡，我们确定了参与所有3种细胞死亡范式的7个基因(). 与TNFα在所有3种细胞死亡范式中的作用一致，7种因子中有3种先前被证明调节TNFα信号：TNFR1、CYLD（直接与TNFR1复合物相互作用）和TIPE1（也很可能是心尖死亡受体信号复合物的组成部分）。
坏死性下垂在人类疾病中的潜在作用
为了进一步探讨坏死性下垂在人类疾病中的意义，我们根据已知人类疾病基因数据库分析了zVAD.fmk筛查中的432个基因。有趣的是，我们从zVAD.fmk筛查中发现了33个与人类疾病相关的基因(补充表9). 例如，嗜连接蛋白3（JPH3）与亨廷顿病样2（HDL2）有关。HDL2是一种常染色体显性、进行性、成年发病的神经退行性疾病，病理学上与亨廷顿病相似。尽管HDL2的神经变性机制尚不清楚，但在JPH3的可变剪接外显子中发现了CAG/CTG扩增突变，该外显子与该疾病有关(Holmes等人，2001年). 这种与坏死性疾病和人类疾病有关的基因的联系表明，坏死性疾病可能与这些人类疾病有关，需要在未来进行检查。
讨论
在这项研究中，我们展示了一个广泛的信号网络，它调节坏死，这是一种不依赖于细胞半胱天冬酶的坏死细胞死亡途径。免疫和神经系统中坏死所需基因的丰富表达表明，坏死可能在这两个分区中起到生理细胞死亡机制的作用。有趣的是，具有坏死特征的细胞死亡，称为“III型细胞死亡”，在神经系统正常发育期间发生(克拉克，1990年). 我们认为坏死性下垂可能代表一种“III型”细胞死亡。另一方面，Nec-1延长活化的原代巨噬细胞寿命的能力表明，坏死下垂可能作为一种细胞机制，在感染期间限制和调节活性巨噬细胞的数量。参与先天免疫的细胞对zVAD.fmk治疗的敏感性表明，半胱天冬酶抑制可能代表被病毒侵袭的细胞信号，因此，必须通过激活细胞自杀机制（如坏死）来破坏这些细胞。因此，坏死下垂可能是保护哺乳动物免受外来生物入侵的细胞防御机制。
坏死性下垂的核心调节因子
我们的分析确定了一组25个基因，包括parp2、bmf、pvr、rab25、jph3、mag和foxi1()这是zVAD.fmk和TNFα诱导的坏死性下垂所必需的，但不是凋亡所必需的。这些结果首次揭示了RIP1下游“核心”坏死机制和/或调节因子的组成。坏死细胞死亡的调控是这些基因的一种新功能，强调了坏死性凋亡是调控细胞死亡的一种独立机制，与凋亡不同。
有趣的是，该筛查确定了Grb2，一种含有SH2和SH3结构域的适配器分子，已知其与TNFR1结合，介导c-Raf-1激酶的TNFα依赖性激活(Hildt和Oess，1999年)如zVAD.fmk和TNFα诱导的坏死性下垂所需。Grb2的参与表明MAP激酶在坏死性下垂信号传导中的作用。MAP激酶的多个已知靶点的鉴定，如EDD、SP1、SLC9A1、RGS19，与这种可能性一致。
我们的筛查揭示了PARP-2在zVAD.fmk和TNFα诱导的坏死性下垂中的作用。PARP-2是PARP家族中与PARP-1最接近的同源物，在催化域中具有60%的同源性。先前的研究表明，PARP-1与烷基化剂MNNG（N-甲基-N′-亚硝基胍）诱导的坏死有关，后者需要RIP1(Xu等人，2006年). 如parp1-/-的胚胎致死性所示，PARP-2和PARP-1可以异源二聚并具有部分冗余功能；parp2-/-双但非单突变小鼠(Menissier de Murcia等人，2003年). 研究表明，Parp1和Parp2的寡聚化可以刺激PARP催化活性，帮助DNA缺口后的碱基切除修复。尽管与PARP-1相比，PARP-2的时间进程较晚，但PARP-2在细胞凋亡中也被裂解，这表明PARP-2并不像PARP-1那样是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的理想底物。有趣的是，研究表明，抗半胱氨酸蛋白酶裂解形式的PARP-1（D214A）的表达会导致坏死(Kim等人，2000年). PARP1的激活可催化NAD+水解为烟酰胺和多聚ADP核糖，导致NAD+耗竭，进而可能导致坏死中的能量衰竭(Zong等人，2004年). 因此，持续升高的抗半胱氨酸蛋白酶裂解的PARP-2活性水平可能有助于坏死性下垂的发生。
zVAD.fmk和TNFα诱导的坏死性下垂也需要转录因子FOXI1。FOXI1靶向破坏的突变小鼠表现出由细胞分化缺陷导致的小管酸中毒，其特征是缺乏空泡H（+）-ATPase表达(Kurth等人，2006年). 有趣的是，H（+）-ATP酶Atp6v1g2也是zVAD.fmk和TNFα诱导的坏死性下垂所需的一个位点。液泡H（+）-ATP酶（V-ATP酶）是一种普遍存在的多亚单位泵，负责细胞内细胞器的酸化。抑制V-ATP酶预计会增加酸性细胞内细胞器（如溶酶体）的pH值，而溶酶体水解酶的活性反过来又会增加。
Bmf在坏死中的作用
我们确定Bcl-2家族的一个成员Bmf是zVAD.fmk或TNFα诱导的坏死所必需的。Bmf是Bcl-2家族蛋白中仅有促死亡BH3亚群的成员(Puthalakath等人，2001年). BH3-only蛋白在凋亡和自噬中充当上游信号的整合者。我们的结果表明，Bmf可能在坏死信号传导中发挥类似的作用。Bmf的过度表达可以减少L929细胞的集落形成(Puthalakath等人，2001年); 然而，Bmf诱导L929细胞死亡的机制尚未被直接研究。Bmf-/-小鼠由于这些细胞对一系列凋亡刺激的异常抵抗而发展为B细胞限制性淋巴结病，并加速了γ射线诱导胸腺淋巴瘤的发展(Labi等人，2008年). Bmf-/-小鼠的表型与坏死在调节免疫系统内稳态中的作用一致。我们认为Bmf可能通过介导细胞凋亡和坏死的执行而发挥肿瘤抑制作用。
有趣的是，Bmf的敲除阻断了zVAD.fmk和TNFα诱导的细胞凋亡，但没有阻断TNFα/CHX处理的NIH3T3细胞的凋亡。尽管Bmf被认为是一种促凋亡分子，但这一结果表明，至少在死亡受体信号通路中，Bmf主要参与调节坏死，而不是凋亡。Bmf的激活可能以刺激和细胞环境依赖的方式诱导细胞凋亡或坏死。
肿瘤发生中的坏死？
包括cyld和edd1在内的2个肿瘤抑制基因和4个Ras相关蛋白Rab25、Rasa4、Rassf7和Rassf8在调节坏死性下垂中的作用表明，坏死性下移可能在肿瘤发生中起作用。Rab蛋白参与调节细胞内膜转运(Pfeffer，2007年). 在包括卵巢癌和乳腺癌在内的多种癌症中发现了Rab25基因表达失调(Cheng等人，2004年). 另一方面，RASA4/CAPRI（RAS p21蛋白激活物4）是上皮细胞转化的抑制因子(Westbrook等人，2005年)，作为钙依赖性Ras GTPase激活蛋白（GAP），在刺激细胞内钙升高后，使Ras-MAPK途径失活(Lockyer等人，2001年). RASA4在调节坏死和凋亡方面的共同作用可能为其作为肿瘤抑制剂的作用提供了潜在机制。DAB2IP/AIP1是另一种Ras-GAP和一种ASK1相互作用蛋白，先前已被证明与RIP1结合以介导内皮细胞（EC）中ASK1-JNK/p38信号的激活(Zhang等人，2007年). 我们发现DAB2IP的敲除部分抑制了细胞凋亡，但对细胞凋亡没有影响（数据未显示）。由于已发现DAB2IP和RASA4这两个GAP介导RIP1的信号传导，因此可能有多个Ras-GAP蛋白参与介导不同细胞类型的RIP1下游信号传导以调节细胞死亡。最后，Rassf7和Rassf8是Ras-association domain家族（RASSF）的成员，是以保守基序（RalGDS/AF6-Ras association-（RA）域）为特征的Ras效应器，被认为是调节Ras介导的一些生长抑制反应的假定肿瘤抑制因子。RASSF家族某些成员的过度表达，如Rassf6，已被证明会触发caspase依赖性和caspase非依赖性细胞死亡。Rassf家族也参与调节死亡受体介导的细胞死亡(池田等人，2007年).
我们认为，当半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活失败时，坏死性下垂可能被选择性激活，这可能发生在病理条件下，如病毒感染或致癌突变。自从细胞凋亡缺陷被认为是癌症的标志之一以来(哈纳汉和温伯格，2000年)在凋亡缺陷的癌细胞中，凋亡作为一种后备细胞死亡机制，可能在肿瘤发生中起着非常重要的作用。
材料和方法
siRNA筛选
使用覆盖大部分小鼠基因组的16873个siRNA库（Dharmacon小鼠激酶和磷酸酶、G蛋白偶联受体、可药用基因组和剩余基因组库，赛默飞世尔科学公司）进行siRNA筛选。根据制造商（Qiagen）的协议，使用HiPerFect转染试剂通过反向转染方法，将培养在384孔白板（Corning）中的小鼠纤维骶管瘤细胞系L929细胞自动转染50nM siRNA。转染48小时后，用20μM泛酶抑制剂zVAD.fmk处理细胞，再培养18小时以诱导细胞凋亡。使用CellTiterGlo ATP分析（Promega），使用基于发光的ATP水平作为存活细胞的替代标记来测量生存能力。每个平板上都有阳性对照（ripk1，Dharmacon）和阴性对照（非靶向对照siRNA:siCONTROL非靶向#2，Dharmcon）。屏幕重复执行。如果每个基因的siRNAs的存活率高于重复平板上平板的平均ATP值>2个标准偏差（SD），则将其归类为“hits”。
在确认筛选中，每个池中的4个siRNA分别转染到细胞中，并使用与主筛选相同的程序进行筛选。在TNFα三级筛选中，用单个siRNA转染L929细胞，48小时后，用40ng/ml TNFα处理72小时再延长12小时诱导细胞凋亡。
人类蛋白质相互作用网络
该网络是通过反复连接相互作用蛋白，从全基因组相互作用组屏幕和HPRD中精选的文献条目中提取数据而构建的(Mishra等人，2006年). 为了进行网络分析，将小鼠成分映射到人类同源基因（同源基因）(Wheeler等人，2008年). 该网络使用图论表示，将组件（基因产物）抽象为节点，将组件之间的关系（例如交互）抽象为边，用Perl编程语言实现。
