跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
乳腺癌研究。2008; 10（5）：R84。
2008年10月15日在线发布。 数字对象标识：10.1186/公元2154年
预防性维修识别码：PMC2614520型
PMID：18922152

乳腺癌中天冬氨酸转氨酶的靶向性研究

约书亚·马歇尔·桑伯格,1 克里斯汀·克纳尔逊,1 布莱恩·克莱姆,1 安德鲁·莱恩,1 阿鲁穆甘县,1 艾伦·西蒙斯,1 约翰·W·伊顿,1 Sucheta Telang公司,1和杰森·切斯尼通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

介绍

相对于邻近的正常细胞，乳腺癌细胞中的糖酵解增加，以产生生存、生长和侵袭所需的ATP和合成代谢前体。糖酵解也是细胞质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）还原形式的关键来源，NADH是电子穿梭到线粒体进行电子传输所必需的。乳酸脱氢酶（LDH）通过将丙酮酸转化为乳酸来调节糖酵解通量，已发现在乳腺肿瘤中高度表达。天冬氨酸转氨酶（AAT）与苹果酸脱氢酶协同作用，将NADH的电子传递到线粒体内膜。草酸盐是LDH和AAT的抑制剂，我们假设草酸盐可能干扰乳腺癌细胞的代谢和生长。

方法

我们检测了草酸盐和AAT抑制剂氨基氧乙酸（AOA）对13MDA-MB-231细胞中的C-葡萄糖利用率、耗氧量、NADH和ATP。然后，我们测定了草酸盐和AOA对正常人乳腺上皮细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的影响，以及对裸鼠BALB/c雌性小鼠MDA-MB231细胞作为肿瘤的生长的影响。我们在MDA-MB-231细胞中体外表达AAT，并研究了草酸盐对细胞抑制作用的影响。最后，我们检测了AAT特异性siRNA转染对MDA-MB-231细胞增殖的影响。

结果

我们发现，正如LDH抑制活性所预测的那样，草酸盐并没有减弱细胞乳酸的生成，但确实具有与AOA抑制AAT类似的抗代谢作用。具体地说，我们发现草酸盐和AOA降低了13C-葡萄糖衍生的碳转化为谷氨酸和尿苷，这两种物质都是线粒体三羧酸循环的产物，也是衡量电子传递链活性的耗氧量。相对于正常人乳腺上皮细胞，Oxamate和AOA还选择性地抑制MDA-MB-231细胞的增殖，并降低无胸腺小鼠中MDA-MB-231乳腺肿瘤的生长。重要的是，我们发现AAT在MDA-MB-231细胞中的异位表达对氧肟酸的抗增殖作用产生了抵抗，并且AAT的siRNA沉默降低了MDA-MB231细胞的增殖。

结论

我们认为AAT可能是开发抗肿瘤药物的有效分子靶点。

介绍

葡萄糖作为厌氧能源和生物合成前体的摄取增加是原发性和转移性乳腺腺癌的常见特征。正电子发射断层扫描（PET）研究-[18F] 氟-2-脱氧葡萄糖已经一致地证明人类乳腺肿瘤相对于邻近的正常乳腺组织运输增加的葡萄糖体内[1]. 因此，了解乳腺癌葡萄糖摄取和代谢的调节可能为开发抗乳腺癌药物提供新的代谢靶点。

原癌基因c-myc在乳腺肿瘤中扩增，与复发和死亡风险增加有关[2]. C-myc通过转录促进乳酸脱氢酶（LDH）A（C-myc驱动生长所需的糖酵解酶）诱导癌细胞糖酵化通量增加[三]. LDH-A是一种可逆酶，可将丙酮酸转化为乳酸，并将还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化为NAD+[4,5]. 与正常乳腺组织相比，恶性乳腺组织中LDH-A的表达和活性增加[6,7]. LDH-A也被转录因子缺氧诱导因子1α（HIF-1）上调，HIF-1是低氧代谢反应的中枢调节器。HIF-1α在乳腺肿瘤中过度表达，与增殖呈正相关，因此在乳腺癌中预后较差[8,9]. 最后，LDH活性随着雌激素的增加而增加，雌激素受体阳性乳腺肿瘤表达的LDH-A水平相对于邻近正常组织增加[10,11]. 综上所述，这些数据表明LDH可能是开发破坏乳腺癌细胞糖酵解代谢的药物的合理靶点。

LDH由两个单独编码的亚单位A和B组成，它们结合形成五种预期LDH四聚体的二项式分布：LDH1-B4（也称为LDH-B），LDH2-B三A、 低密度脂蛋白三-B2一2，LDH4-BA三和LDH5-A4（也称为LDH-A）[12]. 草酸盐是一种公认的丙酮酸类似物和LDH-A竞争性抑制剂[13-16]. 草酸盐还抑制天冬氨酸转氨酶（AAT），AAT与苹果酸脱氢酶协同作用，形成苹果酸-天冬氨酰辅酶NADH梭。AAT需要将电子从糖酵解酶衍生的细胞质NADH穿梭到线粒体NADH，然后由电子传递链使用，以产生氧化磷酸化所需的质子梯度[17-19]. 重要的是，草酸盐抑制HeLa宫颈腺癌细胞的糖酵解通量和生长[16]并且对用H-ras转化的成纤维细胞具有选择性毒性[20]，一种癌基因，与邻近正常乳腺组织相比，在50%至70%的乳腺腺癌中过度表达[21-25]. 考虑到乳腺肿瘤中LDH的高活性以及AAT在NADH穿梭到线粒体中的潜在作用，我们推测抑制LDH和AAT的草酸盐可能抑制人类乳腺腺癌的生长。

在目前的研究中，我们证实了草酸盐对乳腺癌细胞具有抗生长作用在体外和体内但发现细胞抑制作用仅次于对线粒体代谢的抑制作用，而非糖酵解作用。特别是，我们认为AAT是就地oxamate的代谢靶点，并证明使用羰基捕获剂、氨基氧乙酸盐（AOA）或AAT特异性siRNA物种选择性抑制AAT可降低乳腺癌细胞的增殖。我们得出结论，AAT可能对乳腺上皮细胞的转化和生长至关重要，因此可能被证明是开发抗乳腺癌药物的有效靶点。

材料和方法

人LDH-A和AAT蛋白的克隆

使用设计在开放阅读框侧面的PCR引物从正常人上皮细胞cDNA中扩增LDH-A和AAT cDNA。然后将PCR产物亚克隆到pET-30b（+）载体中（加州圣地亚哥诺瓦根）。BL21（DE3）大肠杆菌用pET-30b（+）-LDHA和pET-30b（+）-AAT，C-termHis质粒转化活性细胞（加州圣地亚哥诺瓦根）。为了表达和纯化蛋白质，将250mL BL21-LDHA和BL21-AAT转化细胞的培养物在37°C下孵育16小时，并将250mL含有2mM异丙基β-D-1硫代吡喃半乳糖苷（最终浓度=1mM）的Luria Bertani培养基加入到每个培养物中，并在30°C下再振荡4小时。通过离心法收集细菌，并按照Qiaexpressionist方案（加利福尼亚州Qiagen Valencia）进行蛋白质纯化。根据制造商关于LDH-a和AAT蛋白质产品的协议，使用双钦尼克酸蛋白质分析法（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）对洗脱组分中的蛋白质浓度进行量化。

LDH-A测定

用纯化的人酶测定了草酸盐对LDH-A的影响。在300μL 100 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）中，将0.025至0.075单位的LDH-A与还原的β-NADH、0至3 mM丙酮酸钠和0.033%的BSA结合。使用96 well平板阅读器测量340 nm处的吸光度，以确定340 nm/min处吸光度的最大线性变化，作为酶活性的测量。使用Sigma绘图酶动力学模块（Systat软件，加利福尼亚州里士满）测量并分析了几种浓度的草酸盐存在下的LDH活性。

AAT分析

用纯化的人重组酶测定了草酸盐对AAT的影响。在300μL的反应中，193 mM L-天冬氨酸、12 mMα-酮戊二酸、0.6单位/mL苹果酸脱氢酶、0.2 mM NAD和0.03至0.06单位的人重组AAT结合在一起。使用96孔板读数器测量340nm处的吸光度，以确定吸光度的最大线性变化作为酶活性的测量。在几种浓度的草酸盐存在下测量AAT活性，以确定在体外AAT抑制。使用Sigma绘图酶动力学模块（Systat软件，加利福尼亚州里士满）分析酶活性。

细胞培养

MDA-MB-231乳腺癌细胞（HTB-26，美国型培养物收藏馆，弗吉尼亚州马纳萨斯）保存在补充有10%FCS和庆大霉素硫酸盐的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中（HyClone Logan，UT）。正常人乳腺上皮细胞（HMEC；Lonza，CC-2551，Walkersville，MD）在含有牛垂体提取物、人表皮生长因子、氢化可的松、GA-1000和胰岛素的培养基中保存。

体外细胞增殖试验

MDA-MB-231细胞和HMEC细胞在由牛垂体提取物、人表皮生长因子、氢化可的松、GA-1000和胰岛素配制的相同的富含生长因子的培养基中培养72小时。然后向培养基中添加几种浓度的草酸钠或AOA（西格玛，圣路易斯，密苏里州）48小时，并使用台盼蓝通过光学显微镜计数活细胞，以排除死细胞。培养基中含有葡萄糖（5 mM）和谷氨酰胺（1 mM），并使用可变二氧化碳张力培养箱（Heraeus，Thermo Fisher Scientific，Asheville，NC）在21%氧气（常氧）和5%二氧化碳（37°C）下培养细胞。常规传代时，用PBS和胰蛋白酶清洗细胞。因为培养的细胞会发生突变，所以保存了冷冻储存物，并每隔30天从这些储存物中重新开始活性培养。

软琼脂集落形成试验

MDA-MB-231细胞以25×10的密度进行电镀三每60-mm平板上的细胞数为3ml底部琼脂（0.6%）和2ml顶部琼脂（0.3%）。HMEC细胞作为阴性对照，因为它们不生长在软琼脂中。每五天通过添加一层新的含有指示浓度的草酸盐或AOA的顶部琼脂来喂养细胞。菌落达到最小50μm后，在每个培养皿的1 cm平方截面上随机计数。

无胸腺小鼠中的MDA-MB-231异种移植物

将MDA-MB-231细胞重新悬浮在100μL PBS中，并与100μL冷Matrigel基底膜基质混合（BD Biosciences，Bedford，MA）。合成混合物（200μL，含10×106每个实验组10只BALB/c裸鼠（平均体重20 g）的两侧皮下注射。当异种移植物的质量达到120 mg时，一组小鼠接受15 mg oxamate或0.2 mg AOA的腹腔注射，每24小时注射一次，持续14天。根据以下公式，用游标卡尺每24小时测定一次肿瘤的质量：质量（mg）=[宽度（mm）]2×[长度（mm）]/2[26,27].

这些研究遵循国际公认的指南，并得到路易斯维尔大学动物护理和使用委员会（IACUC#06007）的批准。

乳酸测量

使用在540 nm处读取的基于乳酸氧化酶的分析来测量培养基中的乳酸浓度（爱尔兰威克洛Trinity）。将乳酸数据归一化为细胞数。实验重复进行三次，用平均值±标准差表示。

核磁共振

我们通过在均匀标记的MDA-MB-231细胞中捕获经草酸盐（40 mM）或AOA（100μM）处理48小时的2D核磁共振（NMR）光谱，研究了草酸盐或AOA对葡萄糖碳流入合成代谢途径的影响13C-葡萄糖（1 gm/L）（在无葡萄糖DMEM中，10%透析FCS）。24小时，4×106将MDA-MB-231细胞置于T75细胞培养瓶中，然后用PBS洗涤，并用含有5 mM[U的DMEM替换培养基-13C类6]-葡萄糖、10%透析FCS和庆大霉素。细胞在含有或不含有40 mM草酸盐或100μM AOA（5%二氧化碳，37°C，96小时）的条件下培养，胰蛋白酶化，并用PBS清洗细胞颗粒。

细胞颗粒和上清液在液氮中快速冷冻，然后在液氮中将其冷冻。离心前，将粉碎后的样品冷冻干燥（5至20 mg），并分别用体积为20至30:1（v/w）（干燥）的10%（v/v）三氯乙酸（TCA）在冰上提取。将混合物在SA-600转子（Sorvall，DuPont，Wilmington，DE）中以15000rpm离心（4°C）30分钟，取出上清液并保存。将残留物再次提取、离心并混合上清液。

在1.5 ml Eppendorf试管中冻干两份最终提取物的等分样品（每份100至200μl）。干燥的提取物样品在100%重水中再次溶解，离心去除颗粒，并装入适当的核磁共振管中。添加DSS（2,2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸钠）作为内部化学位移参考和浓度标准。使用90°激励脉冲，在20°C的瓦里安-伊诺瓦核磁共振波谱仪（瓦里安，帕洛阿尔托，加利福尼亚州）上，在14.1 T下记录核磁共振谱。总相关光谱（TOCSY）实验使用6000 Hz的两维谱宽，t2为0.341秒，t1为0.05秒，循环时间为1.84秒，混合时间为50 ms，MLEV-17产生的B1场强为8 kHz。根据代谢物的1H和13C化学位移以及TOCSY连接性模式确定代谢物。

氧气消耗量

MDA-MB-231细胞在草酸盐（40 mM）或AOA（100μM）中培养24小时。随后，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）分离细胞，并在完整培养基中以1000 rpm离心5分钟。使用Strathkelvin 782氧气计（英国格拉斯哥Strathgelvin仪器有限公司）测量耗氧量。使用5×10测量呼吸率6细胞悬浮在总体积为525μL的DMEM中，37°C下含有10%FBS，持续10分钟。

细胞ATP测定

使用生物发光测定试剂盒（Molecular Probes，Invitrogen，Carlsbad，CA）测量细胞ATP。该测定依赖于荧光素酶对ATP的需求来产生光（在pH 7.8时最大发射约560nm）。简单地说，在草酸盐（40 mM）或AOA（100μM）中生长24小时后，1×106将细胞重新悬浮在含有1 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.5 mM荧光素和12.5μg/ml荧光素酶的反应缓冲液中，轻轻混合，并在光度计中进行测量（TD-20/20，Turner Designs，Sunnyvale，CA）。ATP标准曲线与每个实验同时运行，以生成标准曲线，并根据该曲线进行计算，以确定细胞ATP水平（表示为mol/106单元格）。

NAD+/NADH比值测定

MDA-MB-231细胞在10 cm内生长到70%的汇合处2组织培养板置于适当的培养基中（如上所述）。随后用含有草酸盐（40 mM）或AOA（100μM）的培养基处理细胞。24小时后，用胰蛋白酶将细胞提起，用PBS和1×10洗涤两次6通过离心将细胞制成颗粒。NADH和NAD+根据制造商的方案测定（#ECND-100，生物分析系统，加利福尼亚州海沃德）。简言之，将细胞颗粒重新悬浮在1.5 mL Eppendorf管中，其中100μl NAD+提取缓冲液（含0.40%盐酸）用于NAD测定，或100μl NADH提取缓冲溶液（含0.40%氢氧化钠）用于NADH测定。将提取物在60°C下加热5分钟，然后添加20μl分析缓冲液（含有3.0%三羟甲基氨基甲烷和0.10%BSA），然后添加提取缓冲液（以中和提取物）。将混合物涡旋并以13000rpm离心5分钟。将上清液添加到含有分析缓冲液、乙醇脱氢酶、乙醇、甲基硫酸吩嗪（PMS）和四氮唑染料（MTT）的工作试剂中。在时间零点和15分钟时，使用96-well板读卡器分光光度计记录565nm处的光密度。将吸光度差异与标准溶液进行比较，并用于计算NADH和NAD+浓度。

AAT的异位表达

使用pIRESneo3载体（Clontech，Mountain View，CA）将人细胞质AAT的开放阅读框转染MDA-MB-231细胞，以创建MDA-MB231/AAT+细胞。MDA-MB-231细胞也用空的pIRES/neo3载体单独转染，以产生MDA-MB231/vect细胞作为阴性对照。该载体包含一个内部核糖体进入位点（IRES），因此允许从一个mRNA翻译两个开放阅读框。用500μg/ml新霉素筛选后，存活细胞稳定表达AAT（经Western blot证实）。所有转染均使用Lipofectamine（Invitrogen，Carlsbad，CA）作为转染试剂进行。MDA-MB-231/AAT+细胞在添加10%FCS和含有250μg/ml新霉素的硫酸庆大霉素（HyClone）的DMEM中培养。

siRNA转染

细胞以65×10的浓度接种三6孔组织培养板中每孔的细胞数（或1×106细胞/T150烧瓶），并在上述5%二氧化碳和37°C DMEM中培养24小时。然后根据制造商的协议，使用寡效胺（Invitrogen，Carlsbad，CA）作为转染试剂，用siRNA转染细胞，最终浓度为100 nM。从预先设计的siRNA文库（Ambion，Applied Biosystems，Austin，TX）中获得了三个siRNA结构体，一个靶向GOT1 mRNA产物（AAT1）的外显子#4，一个目标向GOT1mRNA产物的外显字#3（AAT2），以及一个交叉外显子#1和2（AAT3）。一个非特异性siRNA和寡聚体胺单独作为阴性对照。转染后，将细胞孵育48小时，计算细胞数量，并使用Western blot分析定量蛋白质水平。

结果

草酸盐抑制人重组LDH-A和AAT

以前已经使用从兔肌肉（LDH-A）或猪心（LDH-B）纯化的酶来检测LDH的酶动力学和草酸盐对LDH的抑制作用[19,27,28]. 然而，没有研究检查了草酸盐对纯化的人LDH-A的影响，兔和人LDH-A氨基酸序列之间的差异（77%同源性）可能导致草酸盐亲和力的差异。我们生产了重组人LDH-A，并进行了初步的动力学研究，结果表明，人类LDH-A的Vmax为117μmol/minute/mg蛋白质，丙酮酸的Km为111.8μM（图​（图1a1a个和​和1b）。1亿). 我们证实，草酸盐竞争性抑制人类LDH-A的活性在体外，Ki为136.3μM（使用丙酮酸作为底物）。这些数据表明草酸盐是人LDH-a的竞争性抑制剂，因此可能被证明可用于检测LDH-a抑制对人乳腺癌细胞增殖的影响。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为bcr2154-1.jpg

草酸盐抑制人重组乳酸脱氢酶A（LDH-A）和天冬氨酸转氨酶（AAT）活性在体外（a）使用纯化的人LDH-a进行重组酶分析，如所述。（b） Lineweaver-Burk双倒数图检查LDH-A酶活性与丙酮酸浓度的关系。在80、240或800μM草酸盐存在或不存在的情况下进行激酶分析。（c）体外使用纯化的人AAT进行重组酶分析，如所述。（d） Lineweaver-Burk双倒数图检查AAT酶活性与α-酮戊二酸（KG）浓度的关系。在存在或不存在15、30或40 mM草酸盐的情况下进行激酶分析。数据绘制为平均值±标准偏差。

以前也发现草酸盐抑制纯化的AAT，这是一种通过三羧酸循环和苹果酸-天冬氨酸穿梭物参与线粒体代谢的酶[17,28]. 具体而言，相对于2-酮戊二酸盐（α-酮戊二酸酯），草酸盐可以竞争性地抑制AAT，Ki为28μM。我们证实，草酸盐抑制重组人重组AAT的活性在体外（Vmax=5.2μmol/minute/mg蛋白质，Km=379.1μM，Ki=30.3μM；图​图1c）。1c个). Lineweaver-Burk分析表明，抑制作用几乎与α-酮戊二酸完全竞争（图​（图1d1天).

草酸盐减少葡萄糖衍生碳进入三羧酸循环产物的通道

鉴于人类LDH-A对草酸盐的敏感性，我们假设草酸盐会减少细胞内乳酸的生成。我们检测了草酸盐对MDA-MB-231细胞分泌乳酸的影响，令人惊讶的是，每个细胞分泌的乳酸没有差异（对照组为89±11 mg/dL/106细胞+40 mM草酸盐，88±14 mg/dL/106单元格）。为了更好地阐明草酸对糖酵解通量的代谢影响，我们用统一标记的[U-13C类6]-葡萄糖，并检查了13C使用2D-NMR-TOCSY分析。数字​图2a2a个和​和2b2亿显示了未经处理和经草酸盐处理的MDA-MB-231细胞的TOCSY光谱区域，这些细胞包含一些感兴趣的代谢物，包括谷氨酸/谷胱甘肽、乳酸和丙氨酸。具体而言，1.40/4.38 ppm的交叉峰代表12C-乳酸，而卫星峰（位于识别方块的角落）代表13C标记的乳酸。我们确认相等13C-[U细胞内乳酸的富集-13C类6]-未经处理和草酸盐处理的细胞中的葡萄糖（比较图​图2a2a个和​和2b）。2亿). 这些数据表明，氧肟酸暴露于MDA-MB-231细胞并不会显著抑制LDH-A活性就地.

保存图片、插图等的外部文件。对象名为bcr2154-2.jpg

Oxamate抑制葡萄糖转化为三羧酸循环的几种产物、耗氧量和细胞内ATPMDA-MB-231细胞在含有1 g/L[U-13C类6]-葡萄糖，暴露于（a，c）PBS或（b，d）40 mM草酸盐。48小时后，清洗活细胞，用10%三氯乙酸（TCA）提取，冻干并溶解在100%重水中。在标准化采集条件下，在14.1 T下记录光谱，循环时间为5秒。13通过间接检测2D-NMR全相关光谱（TOCSY）中的质子来定量C同位素。代表13C-标记的谷氨酸/谷胱甘肽（Glu/GSH）、丙氨酸（Ala）和（a，b）乳酸和（C，d）尿苷碱以红色方框突出显示。细胞在40 mM草酸盐存在或不存在的情况下培养24小时，然后（e）使用氧气计测量耗氧量，（f）使用光度计测定ATP浓度。同时运行ATP标准曲线。数据绘制为平均值±标准偏差。

以数字表示​图2a2a个和​和2b，2亿，2.60/4.05 ppm和2.20/4.05 ppm的峰值代表谷氨酸/谷胱甘肽部分，卫星峰（同样位于识别方块的角落）代表13C-标记的谷氨酸/谷胱甘肽。我们观察到的更少13草酸盐治疗组中的C-标记谷氨酸/谷胱甘肽（图​（图2b），2亿)这表明草酸可能会降低葡萄糖衍生物的转化率13C转化为谷氨酸。葡萄糖通过糖酵解途径转化为丙酮酸，然后通过LDH-A转化为乳酸，或者通过漏斗状通道进入线粒体中的三羧酸循环，丙酮酸产生的碳可以并入包括谷氨酸在内的三羧酸循环相关的几种代谢物中。根据观察13氧肟酸处理细胞中谷氨酸的C富集，且在13我们推测，氧肟酸可能抑制了三羧酸循环。

数字​图2c2厘米和​和2d二维显示以8.00/5.95 ppm为中心的交叉峰模式，对应于尿苷的H6、H5环质子（UTP和UDP）。尿苷的碳来自天门冬氨酸，天门冬胺酸是由草酰乙酸在三羧酸循环中的转氨作用产生的。未经处理的MDA-MB-231细胞中的卫星峰（图​（图2c）2厘米)表明尿苷碱（UXP）包含来自正常三羧酸循环的碳，其中13C-标记以乙酰辅酶A的形式进入（通过丙酮酸脱氢酶）和胸膜反应，在胸膜反应中，丙酮酸的相邻碳通过丙酮酸酯羧化酶转化为草酰乙酸。然而，在草酸盐处理后，这些卫星峰完全消失，这表明13碳并没有被纳入尿苷中，并且在MDA-MB-231细胞中的正常三羧酸循环被草酸盐处理所抑制（图​（图2d二维).

我们检测了MDA-MB-231细胞在暴露于和不暴露于40 mM氧肟酸盐24小时（这是任何细胞抑制作用之前的一段时间）的情况下的耗氧量（直接测量电子传递链活性），并观察到耗氧量下降了61%（5×106每组细胞数；图​图2e）。第二版). 我们还发现，24小时后，草酸盐降低了ATP的稳态浓度（每个细胞的ATP减少33±3%；图​图2f）第2页)并观察到40 mM草酸盐处理的MDA-MB-231细胞的NAD+/NADH比率略有下降，但具有统计学意义（未经处理，NAD+=9.41±0.63μM，NADH=7.02±0.33μM；NAD+/NADH=1.34；+40 mM草酸盐，NAD+=9.68±0.54μM，NADH=8.11±0.33µM，NAD+/NADH=1.19）。我们怀疑，NAD+/NADH比率的这种有限下降可能反映了使用NAD+/NADH作为辅因子的多种其他酶的补偿作用。

AOA减少了葡萄糖衍生碳转化为三羧酸循环产物的通道

AAT是一种磷酸吡哆醛依赖酶，在氨基酸代谢和三羧酸循环中起主要作用。当与苹果酸脱氢酶结合时，AAT催化苹果酸-天冬氨酸NADH梭的活性，促进还原当量在线粒体膜上的净转移[29]. 具体地说，AAT负责天冬氨酸和谷氨酸的相互转化，以及α-酮戊二酸和草酰乙酸的共同转化。抑制AAT而非LDH-A有望减少葡萄糖衍生碳向谷氨酸和尿苷的转化，并减少氧气消耗。氨基氧乙酸是一种抑制AAT的羰基捕获剂，因为它依赖磷酸吡哆醛作为辅酶[30]. 这种抑制作用与使用的AOA浓度直接相关[31]. 尽管AOA的Ki值尚未公布，但它之前已被确定为AAT的中等强效抑制剂体内，需要1.0 mM才能实现足够的抑制[32]. 然而，最近的研究表明，AOA在抑制M-A穿梭方面更有效，AAT抑制只需要0.1 mM体内[30].

我们证实AOA抑制重组人细胞质AAT（IC50=515±35μM），然后检查100μM AOA对均匀标记[U-13C类6]-使用2D-NMR-TOCSY分析葡萄糖。数字​图3a3a年和​和3b第3页展示未经处理和AOA处理的MDA-MB-231细胞的TOCSY光谱区域，其中包含谷氨酸/谷胱甘肽、乳酸和丙氨酸峰值。AOA对葡萄糖代谢的影响反映了暴露于草酸盐后观察到的结果。我们观察到13C-标记的谷氨酸/谷胱甘肽卫星峰和13暴露于AOA后C并入乳酸中（图​（图3b）。第3页). 我们还发现，经AOA处理后，尿苷卫星峰完全消失，这表明13碳未被纳入尿苷中（图​（图3d三维).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为bcr2154-3.jpg

氨基氧乙酸（AOA）抑制葡萄糖转化为三羧酸循环、耗氧量和细胞内ATP的几种产物MDA-MB-231细胞在含有1 g/L[U-13C类6]-葡萄糖，暴露于（a，c）PBS或（b，d）100μM AOA。48小时后，清洗活细胞，用10%三氯乙酸（TCA）提取，冻干并溶解在100%重水中。在标准化采集条件下，在14.1 T下记录光谱，循环时间为5秒。13通过间接检测2D-NMR全相关光谱（TOCSY）中的质子来定量C同位素。代表13C-标记的谷氨酸/谷胱甘肽（Glu/GSH）、丙氨酸（Ala）和（a，b）乳酸盐以及（C，d）尿苷碱用红色方块突出显示。细胞在存在或不存在100μM AOA的条件下培养24小时，然后（e）用氧气计测量耗氧量，（f）用光度计测定ATP浓度。同时运行ATP标准曲线。数据绘制为平均值±标准偏差。

综上所述，这些数据表明，MDA-MB-231细胞暴露于AOA，如氧肟酸盐，会抑制三羧酸循环。我们对AOA所观察到的丙氨酸减少感到惊讶（图​（图3b）第3页)并且只能推测，增加的细胞质NADH可能促进LDH将丙酮酸转化为乳酸，从而减少丙氨酸的可用底物（即丙酮酸）。与氧肟酸盐接触相似，AOA抑制了氧消耗，24小时后降低了ATP的稳态浓度（图​（图3e第三版和​和3f）3英尺)降低MDA-MB-231的NAD+/NADH比率（未经处理，NAD+/NADH=1.29；+100μM AOA，NAD+/NADH=1.01）。

Oxamate和AOA抑制MDA-MB-231乳腺腺癌的生长

我们检测了几种浓度的草酸盐或AOA对MDA-MB-231人乳腺癌细胞相对于正常HMEC增殖的影响。数字​图4a4a类和​和4b4b个证明与HMEC相比，暴露于草酸盐或AOA可选择性抑制MDA-MB-231转化的乳腺上皮细胞的生长。乳腺上皮细胞的肿瘤转化赋予凤尾鱼非依赖性生长的能力。我们在软琼脂中培养MDA-MB-231细胞集落，并加入几种浓度的草酸盐或AOA。我们发现，暴露于草酸盐或AOA会抑制软琼脂集落的形成，其浓度与凤尾鱼依赖性增殖的抑制密切相关（图​（图4c4c类和​和4d）。第4天). 接下来，我们研究了腹腔内给予草酸盐或AOA对无胸腺小鼠中已建立的MDA-MB-231乳腺肿瘤生长的影响。将MDA-MB-231细胞皮下注射到BALB/c无胸腺雌性小鼠组的侧翼，在肿瘤生长到约120 mg后，将小鼠随机接受PBS、15 mg草酸盐或0.2 mg AOA每日PBS对照注射，持续14天。我们发现，在开始治疗的48小时内，草酸盐和AOA都抑制了MDA-MB-231肿瘤的生长（图​（图4e第四版和​和4f）。第4页). 综上所述，这些数据表明转化的乳腺上皮细胞可能对AAT抑制选择性敏感。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为bcr2154-4.jpg

草酸盐和氨基氧乙酸盐（AOA）对MDA-MB-231转化的人类乳腺上皮细胞（HMEC）具有选择性毒性，并抑制已建立的乳腺癌异种移植物的生长体内生长抑制研究按所述进行。MDA-MB-231细胞或HMEC在相同的培养基中培养48小时，不存在或存在指定浓度的（a）草酸盐或（b）AOA。细胞暴露于台盼蓝中，并使用光学显微镜进行计数（虚线表示电镀时的百分比控制）。2.5×10浓度的MDA-MB-231细胞4在含有0.6%琼脂的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）的6 cm培养皿上，在不存在或存在（c）草酸盐或（d）AOA指示浓度的情况下进行培养。每隔三到五天，在含有草酸盐的培养基中用0.2%琼脂培养细胞。28天后，计数软琼脂菌落，并以对照的百分比表示。如前所述启动MDA-MB-231异种移植物。每天使用钝端游标卡尺测量肿瘤，将已确诊肿瘤（130至190 mg）的小鼠随机分为PBS对照组（●）或治疗组（○）。给实验小鼠称重，并每天腹腔注射PBS或（e）15 mg草酸盐或（f）0.2 mg AOA。数据绘制为平均值±标准偏差。

AAT是乳腺癌细胞增殖所必需的

为了直接解决AAT抑制是奥沙马特细胞抑制作用所必需的假设，我们在MDA-MB-231细胞中稳定表达AAT，并检测这些细胞对奥沙马汀的细胞抑制敏感性。我们通过Western blot分析证实AAT表达增加（图​（图5a5a级和​和5b）5亿)并发现AAT的过度表达使其对oxamate的细胞抑制作用产生了抵抗力（图​（图5c；5厘米; 集成电路50值=MDA-MB-231细胞，39±6.0 mM；MDA-MB-231/+AAT细胞，68±5.6 mM；MDA-MB-231/矢量控制，41±6.2 mM）。为了直接检测AAT对MDA-MB-231细胞增殖的需求，我们用三种单独的AAT特异性siRNA物种（AAT1-3）转染细胞，并证实AAT1和AAT3选择性地抑制AAT蛋白相对于β-肌动蛋白的表达（图​（图5d5天和​和5e）。第五版). 转染48小时后测定，选择性AAT抑制导致细胞增殖显著降低（图​（图5f）。第5页). 总之，这些数据支持了AAT作为氧肟酸盐的重要代谢靶点和作为抗肿瘤药物开发的潜在靶点的作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为bcr2154-5.jpg

MDA-MB-231乳腺癌细胞中天冬氨酸氨基转移酶（AAT）的过度表达导致对草酸盐的耐药性，AAT特异性siRNA抑制MDA-MB-231细胞增殖（a）用AAT或空载体稳定转染MDA-MB-231细胞，并通过Western blot分析检测AAT的表达。（b） AAT过度表达后Western blot的密度测定。（c） 细胞与指定浓度的草酸盐孵育，48小时后计数活细胞。对含有空载体的对照细胞进行了类似的检查*p<0.01表示对照组和经草酸盐处理的样品之间的统计差异。（d） MDA-MB-231细胞未经处理（对照），单独用寡聚体胺（oligo）进行sham转染，或转染AAT-特异性siRNA分子（AAT1-3）或层特异性对照siRNA（lamin），并通过Western blot分析检测AAT的表达。（e） siRNA转染后Western blot的密度测定。（f） siRNA转染48小时后计数活细胞。数据绘制为平均值±标准偏差。

讨论

我们已经证明，草酸盐和AOA选择性地抑制转化的乳腺癌细胞的增殖在体外并抑制已建立的乳腺癌异种移植物在无胸腺小鼠中的生长。虽然我们证实了草酸盐抑制重组LDH-A，但我们也发现草酸盐降低了AAT的活性，AAT是苹果酸-天冬氨酸NADH穿梭所需的关键酶，也是AOA的酶靶。我们发现，草酸盐降低了葡萄糖衍生碳转化为几种线粒体三羧酸循环产物的通量，减少了耗氧量，但对糖酵解转化为乳酸的通量几乎没有影响。重要的是，我们通过发现AAT在MDA-MB-231细胞中的异位表达对oxamate的抗增殖作用产生抵抗，并且AAT特异性siRNA分子减少MDA-MB231的生长，从而确定了AAT对乳腺癌细胞增殖的需求在体外总之，这些数据表明AAT可能是开发抗乳腺癌药物的新靶点。

为了在多种含能酶和合成代谢酶上实现非醚化通量，NADH的生成必须与NADH氧化为NAD+相平衡。虽然线粒体NADH可以在电子传递链中直接氧化，但细胞质NADH不能直接穿过线粒体膜。三个NADH穿梭系统将电子从细胞质NADH转移到线粒体NAD+：α-甘油磷酸穿梭、脂肪酸穿梭和苹果酸-天冬氨酸穿梭[17-19,33,34]. 细胞质AAT和线粒体AAT与苹果酸脱氢酶协同作用，循环苹果酸-天冬氨酸穿梭。具体来说，细胞质苹果酸可以通过苹果酸-α-酮戊二酸反转运蛋白进入线粒体，并通过苹果酸脱氢酶转化为草酰乙酸，导致线粒体NAD+还原为NADH。草酰乙酸不能穿过线粒体膜，但被线粒体AAT转化为天门冬氨酸，天门冬胺酸随后通过谷氨酸-天冬氨酸反转运蛋白进入细胞质，并被细胞质AAT转化成草酰乙酸。这种新生成的细胞质草酰乙酸通过苹果酸脱氢酶转化为苹果酸，导致细胞质NADH氧化并完成穿梭循环。

苹果酸-天冬氨酸穿梭物在几种肿瘤的肿瘤细胞中活跃，据信约占总呼吸频率的20%，并允许线粒体氧化大部分不被LDH-A氧化的糖酵解NADH（13至80%，取决于细胞类型[17-19,33,34]). 苹果酸-天冬氨酸梭子的两种必需酶AAT和谷氨酸脱氢酶的活性由于H-ras和致癌物（二乙基亚硝胺）的联合诱导转化而增加体内[33]. 我们推测，所观察到的oxamate降低线粒体代谢以及oxamate对AAT表达的细胞抑制作用的依赖性可能与该穿梭器在快速分裂乳腺癌细胞中至少具有最低活性的基本要求有关。与转化细胞中苹果酸-天冬氨酸穿梭物相比，先前发现LDH活性是NADH氧化活性的主要原因[34]. 虽然我们发现草酸盐抑制重组LDH-A和AAT，但本文所示的NMR-TOCSY光谱表明，通过AAT的流量可能对草酸盐的药理抑制更敏感就地这些数据令人惊讶，因为草酸盐被发现是比AAT更有效的LDH-a抑制剂（图​（图1）。1). 我们只能推测，氧肟酸相对于其酶靶LDH-A和AAT的细胞内分隔，或这两种酶底物和产物之间的细胞内平衡有利于就地抑制AAT而非LDH-A。

在人体组织中，细胞质AAT和线粒体AAT蛋白均由一个由单独基因GOT1和GOT2编码的室特异性同二聚体组成。虽然人类细胞质AAT和线粒体AAT亚型的晶体结构还没有得到解决，但其他几种物种的AAT结构已经确定，包括大肠杆菌[35-38]鸡的细胞溶质和线粒体亚型[35-42]和猪的细胞溶质[43]. 使用最小二乘最小叠加法分析这些晶体结构发现，无论来源如何，这些蛋白质都具有相同的肽折叠和活性位点残基[44]. 鉴于人和猪细胞质AAT的高残基序列同源性，人AAT的三级结构应该很容易通过计算模型推导出来。基于这个同源模型，AAT的小分子抑制剂可以通过使用虚拟筛选来识别，虚拟筛选是一种计算技术，可以根据三维结构对大量小分子结构数据库进行预筛选，以查看这些小分子中的哪一个停靠在选定的底物结合位点。因此，我们预测AAT可能是开发抗乳腺癌药物的“可药用”代谢靶点。

结论

综上所述，这些观察支持对AAT在乳腺上皮细胞的肿瘤代谢、转化和生长中的作用的研究。未来的研究将着眼于产生AAT的cre-lox杂合敲除，并检查慢病毒驱动的AAT小发夹RNA沉默对正常和转化的乳腺上皮细胞的相对影响。重要的是，发现对肿瘤转化至关重要的几种代谢酶的杂合基因组缺失不会导致发育或生长异常[45-48]我们假设某些代谢酶（如AAT）可能是乳腺癌细胞的致命弱点。

缩写

AAT：天冬氨酸转氨酶；AOA：氨基氧乙酸；BSA：牛血清白蛋白；EDTA：乙二胺四乙酸；FCS：胎牛血清；HIF：缺氧诱导因子；HMEC：人乳腺上皮细胞；IRES：内部核糖体进入位点；LDH：乳酸脱氢酶；NAD+：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式；NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式；核磁共振：核磁共振；PBS：磷酸盐缓冲液；PCR：聚合酶链反应；PET：正电子发射断层扫描；siRNA：小干扰RNA；TOCSY：全相关光谱。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

JT进行了大部分实验并起草了手稿。KN协助实验的智能设计，协助小鼠实验，并协助Western blot分析。BFC分析了AOA对AAT的影响。AL和SA进行了核磁共振分析。AS纯化了人重组LDH-A和人重组AAT。ST分析了AOA和oxamate对MDA-MB-231细胞中Alamar Blue氧化的影响。JWE协助指导和批判性解释与耗氧量、NADH和ATP测定相关的结果。JC构思并指导了实验。

致谢

我们感谢Abdullah Yalcin和Otto Grubraw进行了许多有益的讨论。这些研究的部分资金来自国家癌症研究所的拨款（JC:1 R01 CA116428-01）。

工具书类

  • Avril N、Menzel M、Dose J、Schelling M、Weber W、Janicke F、Nathrath W、Schwaiger M。通过18F-FDG PET评估乳腺癌的葡萄糖代谢：组织学和免疫组织化学分析。《Nucl Med.杂志》。2001;42:9–16.[公共医学][谷歌学者]
  • Deming SL，Nass SJ，Dickson RB，Trock BJ。乳腺癌中C-myc扩增：其发生率和预后相关性的荟萃分析。英国癌症杂志。2000;83:1688–1695. doi:10.1054/bjoc.2000.1522。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Lewis BC、Prescott JE、Campbell SE、Shim H、Orlowski RZ、Dang CV.c-Myc靶基因rcl和乳酸脱氢酶A诱导肿瘤。癌症研究。2000;60:6178–6183.[公共医学][谷歌学者]
  • Gallagher SM、Castorino JJ、Wang D、Philp NJ。单羧酸转运蛋白4调节转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中CD147的成熟和向质膜的运输。癌症研究。2007;67:4182–4189. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-3184。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Voet D、Voet J。代谢：糖酵解。生物化学。第二。威利父子公司，美国；1995年，第444-476页。[谷歌学者]
  • Balinsky D、Platz CE、Lewis JW。正常、良性和恶性人类乳腺组织的同工酶模式。癌症研究。1983;43:5895–5901.[公共医学][谷歌学者]
  • Hilf R，Rector WD，奥兰多RA。正常和异常乳腺组织中乳酸脱氢酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶的多种分子形式。癌症。1976;37:1825–1830. doi:10.1002/1097-0142（197604）37:4<1825:：AID-CNCR2820370429>3.0.CO；2伏。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Bos R、van Diest PJ、Groep P van der、Shvarts A、Greijer AE、Wall E van der。低氧诱导因子-1α和细胞周期蛋白在侵袭性乳腺癌中的表达与雌激素受体相关。乳腺癌研究。2004;6：R450–459。doi:10.1186/bcr813。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Semenza GL，Roth PH，Fang HM，Wang GL.低氧诱导因子1对糖酵解酶编码基因的转录调控。生物化学杂志。1994;269:23757–23763.[公共医学][谷歌学者]
  • Nagai MA，Sonohara S，Brentani MM。人类乳腺癌中乳酸脱氢酶同工酶-5的雌激素控制。国际癌症杂志。1988;41:10–16. doi:10.1002/ijc.2910410104。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Nagy I、Hirka G、Kurcz M、Anda E、Baranyai P。雌激素在大鼠垂体前叶乳酸脱氢酶活性及其亚分子组织调节中的作用。内昆虫学。1978;71:1–12.[公共医学][谷歌学者]
  • Markert CL，Shakle JB，Whitt GS.基因进化。LDH同工酶的多个基因为基因结构、功能和调控的进化提供了一个模型。科学。1975;189:102–114. doi:10.1126/science.1138367。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Goldberg EB，Colowick SP。糖酵解在肿瘤细胞生长中的作用。3.乳酸脱氢酶是草酸盐对培养细胞生长的作用位点。生物化学杂志。1965;240:2786–2790.[公共医学][谷歌学者]
  • Goldberg EB，Nitowsky HM，Colowick SP。糖酵解在肿瘤细胞生长中的作用。Iv.草酸处理的培养细胞中葡萄糖毒性的基础。生物化学杂志。1965;240:2791–2796.[公共医学][谷歌学者]
  • Papaconstantinou J，Colowick SP出版摘要。联邦程序。1957;16:230. [谷歌学者]
  • Papaconstantinou J，Colowick SP。糖酵解在肿瘤细胞生长中的作用。二、。在组织培养中，氧肟酸对HeLa细胞生长的影响。生物化学杂志。1961;236:285–288.[公共医学][谷歌学者]
  • Cederbaum AI，Lieber CS，Beattie DS，Rubin E.还原当量转运到线粒体的穿梭机制表征。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。1973;158:763–781. doi:10.1016/0003-9861（73）90571-7。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Greenhouse WV，Lehninger AL.苹果酸-天冬氨酸穿梭物在各种肿瘤类型中的发生。癌症研究。1976;36:1392–1396.[公共医学][谷歌学者]
  • Lopez-Alarcon L，Eboli ML.苹果酸-天冬氨酸穿梭物对K-562人白血病细胞系中还原的胞浆烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化作用。癌症研究。1986;46:5589–5591.[公共医学][谷歌学者]
  • Ramanathan A，Wang C，Schreiber SL.利用代谢测量对肿瘤发生的细胞系模型进行扰动分析。美国国家科学院程序。2005;102:5992–5997. doi:10.1073/pnas.0502267102。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Czerniak B、Chen R、Tuziak T、Markiewski M、Kram A、Gorczyca W、Deitch D、Herz F、Koss LG。ras癌基因p21蛋白的表达与人类乳腺癌的区域扩散。癌症。1989;63:2008–2013. doi:10.1002/1097-0142（19890515）63:10<2008:：AID-CNCR2820631024>3.0.CO；二维。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Desai KV，Xiao N，Wang W，Gangi L，Greene J，Powell JI，Dickson R，Furth P，Hunter K，Kucherlapati R，Simon R，Liu ET，Green JE。致癌事件的启动决定了人类乳腺癌模型的基因表达模式。美国国家科学院程序。2002;99:6967–6972. doi:10.1073/pnas.102172399。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Miyakis S，Sourvinos G，Spandidos DA。人类乳腺癌中ras家族基因的差异表达和突变。生物化学与生物物理研究委员会。1998;251:609–612. doi:10.1006/bbrc.1998.9527。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Walker RA，Wilkinson N.p21 ras蛋白在良性和恶性人类乳腺中的表达。病理学杂志。1988;156:147–153. doi:10.1002/path.1711560209。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Watson DM、Elton RA、Jack WJ、Dixon JM、Chetty U、Miller WR。人类乳腺癌中H-ras癌基因产物p21与预后。乳腺癌研究治疗。1991;17:161–169. doi:10.1007/BF01806365。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Taetle R、Rosen F、Abramson I、Venditti J、Howell S。将裸鼠异种移植物用作临床前药物筛选：已建立的化疗药物对黑色素瘤和卵巢癌异种移植物的体内活性。癌症治疗代表。1987;71:297–304.[公共医学][谷歌学者]
  • Wilkinson JH，Walter SJ。草酸盐作为乳酸脱氢酶同工酶的差异抑制剂。酶。1972;13:170–176.[公共医学][谷歌学者]
  • Rej R.天冬氨酸转氨酶活性的测量：草酸盐的影响。临床化学。1979;25:555–559.[公共医学][谷歌学者]
  • 库珀AJL，梅斯特A。转氨酶。纽约：约翰·威利父子公司；1985[谷歌学者]
  • Fitzpatrick SM、Cooper AJ、Duffy TE。使用β-亚甲基-D，L-天冬氨酸评估天冬氨酰转氨酶在脑氧化代谢中的作用。神经化学杂志。1983;41:1370–1383. doi:10.1111/j.1471-4159.1983.tb00835.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • McKenna MC、Waagepetersen HS、Schousboe A、Sonnewald U。还原当量胞质-线粒体转移的神经元和星形细胞穿梭机制：当前证据和药理学工具。生物化学药理学。2006;71:399–407. doi:10.1016/j.bcp.2005.10.011。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Yu AC，Schousboe A，Hertz L.14C-标记谷氨酸在原代培养星形胶质细胞中的代谢命运。神经化学杂志。1982;39:954–960. doi:10.1111/j.1471-4159.1982.tb11482.x。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Arai T、Ogawa T、Nakamura M、Hosoya M、Ohnishi Y。用二乙基亚硝胺处理的携带人类原型c-Ha-ras基因的转基因小鼠肝酶活性的变化。兽医医学杂志。2002;64:1065–1067. doi:10.1292/jvms.64.1065。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Chiaretti B，Casciaro A，Minotti G，Eboli ML，Galeotti T。埃利希腹水肿瘤细胞中苹果酸-天冬氨酸穿梭活性的定量评估。癌症研究。1979;39:2195–2199.[公共医学][谷歌学者]
  • Jager J、Moser M、Sauder U、Jansonius JN。晶体结构大肠杆菌天冬氨酸转氨酶有两种构象。比较一种无连接的开放形式和两种连接的封闭形式。分子生物学杂志。1994;239:285–305. doi:10.1006/jmbi.1994.1368。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Kamitori S、Okamoto A、Hirotsu K、Higuchi T、Kuramitsu S、Kagamiyama H、Matsuura Y、Katsube Y。大肠杆菌天冬氨酸转氨酶及其突变酶在2.5 A分辨率下的三维结构。生物化学杂志。1990;108:175–184.[公共医学][谷歌学者]
  • Okamoto A、Higuchi T、Hirotsu K、Kuramitsu S、Kagamiyama H大肠杆菌以开放和封闭的形式。生物化学杂志。1994;116:95–107.[公共医学][谷歌学者]
  • Smith DL，Almo SC，Tony MD，Ringe D.2.8天冬氨酸转氨酶活性位点突变的解析晶体结构大肠杆菌.生物化学。1989;28:8161–8167. doi:10.1021/bi00446a030。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Borisov VV、Borisova SN、Kachalova GS、Sosfenov NI、Vainstein BK、Torchinsky YM、Braunstein AE。鸡心胞浆天冬氨酸转氨酶的5A分辨率三维结构。分子生物学杂志。1978;125:275–292. doi:10.1016/0022-2836（78）90403-5。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Borisov VV、Borisova SN、Kachalova GS、Sosfenov NI、Voronova AA.[5 A分辨率下天冬氨酸转氨酶的X射线结构研究]Dokl Akad Nauk SSSR公司。1977;235:212–215.[公共医学][谷歌学者]
  • Braunnstein AE、Arutiunian EG、Malashkevich VN、Kochkina VM、Torchinskii Iu M.【鸡心细胞溶胶天冬氨酸转氨酶：2.8埃分辨率下的三维结构和各种酶形式的特征构象】微生物（莫斯科）1985;19:196–208.[公共医学][谷歌学者]
  • 福特GC、Eichele G、Jansonius JN。磷酸吡哆醇依赖酶线粒体天冬氨酸转氨酶的三维结构。美国国家科学院程序。1980;77:2559–2563. doi:10.1073/pnas.77.5.2559。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Arnone A、Rogers PH、Hyde CC、Makinen MW、Feldhaus R、Metzler CM和Metzler DE。细胞溶质天冬氨酸转氨酶的结晶和化学研究。临床生物研究进展。1984;1440亿:171–193.[公共医学][谷歌学者]
  • Jeffery CJ、Barry T、Doonan S、Petsko GA、Ringe D.酿酒酵母胞浆天冬氨酸转氨酶的晶体结构。蛋白质科学。1998;7:1380–1387. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Chesney J、Telang S、Yalcin A、Clem A、Wallis N、Bucala R。诱导性6-磷酸果糖-2-激酶的靶向破坏导致胚胎致死。生物化学与生物物理研究委员会。2005;331:139–146. doi:10.1016/j.bbrc.2005.02.193。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Mori N，Glunde K，Takagi T，Raman V，Bhujwalla ZM。胆碱激酶下调增加5-氟尿嘧啶在乳腺癌细胞中的作用。癌症研究。2007;67:11284–11290. doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-2728。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Telang S、Yalcin A、Clem AL、Bucala R、Lane AN、Eaton JW、Chesney J.Ras转化需要通过6-磷酸果糖-2-激酶进行代谢控制。癌基因。2006;25:7225–7234. doi:10.1038/sj.onc.1209709。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
  • Wu G，Aoyama C，Young SG，Vance DE。胆碱激酶α（磷脂酰胆碱生物合成中的第一种酶）基因断裂导致的早期胚胎致死。生物化学杂志。2008;283:1456–1462. doi:10.1074/jbc。M708766200。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者]
文章来自乳腺癌研究：BCR由以下人员提供BMC公司