生物化学杂志。2009年1月9日；284(2): 1279–1290.
SPARC通过增强β-连环蛋白抑制脂肪生成信号*S⃞
弗吉尼亚梅森贝纳罗亚研究所希望之心项目，华盛顿州西雅图98101
1由美国博士后奖学金资助太平洋山区协会心脏协会。
- 补充资料
【补充数据】
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摘要
SPARC（富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白）调节相互作用在细胞和细胞外基质之间，富含白色脂肪组织。我们报告说，SPARC阴性小鼠的累积量显著增加与野生型小鼠相比，肥胖小鼠的血清瘦素水平保持相对较高。我们现在发现SPARC抑制脂肪生成在体外具体来说，重组SPARC被抑制(一)脂肪细胞分化从小鼠白色脂肪组织和(b条)脂肪生成转录因子的表达和脂肪细胞特异性基因。SPARC诱导的积累和核β-catenin的易位及随后增强的相互作用β-连环蛋白和T细胞/淋巴增强因子1。的活动SPARC对β-catenin的作用需要整合素连接激酶以及细胞外基质重塑。在脂肪生成过程中，梭形前脂肪细胞转变为球形脂肪细胞，并将从富含纤维连接蛋白的基质到富含层粘连蛋白的基底层的细胞外基质叶片。SPARC延缓前脂肪细胞的形态学变化在分化过程中。在SPARC在场的情况下纤维连接蛋白增强，层粘连蛋白抑制；同时α5整合素的表达增强，α6整合素表达增强被抑制。氯化锂，可增强β-catenin也抑制α6整合素的表达研究结果表明SPARC在脂肪细胞形态发生和导致末端分化的信号传递过程。
肥胖是美国的一个主要公共卫生问题，因为它的高发病率以及与许多医疗并发症的因果关系，包括糖尿病、高血压、高胆固醇、心脏疾病、癌症、胆囊疾病、肝病、关节炎、肺并发症、睡眠障碍和过早死亡。肥胖是其特征通过过度积累白色脂肪组织（瓦特，三脂肪）。这个WAT的细胞成分主要包括脂肪细胞和前脂肪细胞以及内皮细胞和巨噬细胞。肥胖是这两者的结果脂肪细胞过度增殖（数量）和过度生长（大小）。脂细胞不仅是能源的储存库，也是各种能源的来源细胞因子和激素。这些所谓的脂肪因子，例如肿瘤坏死因子-α、瘦素、脂联素和抵抗素靶向中枢神经系统和外周组织（脂肪、肝脏和肌肉）进行调节能量代谢(1,2).
SPARC（富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白）属于该家族基质细胞蛋白，通常不参与结构但调节其与细胞的相互作用。SPARC公司通常是防粘剂在体外并调节血管生成和胶原蛋白生成/纤维生成体内它也是一门专业参与伤口愈合、肿瘤进展和炎症(三). 最近的研究发现SPARC及其在脂肪组织中的拟议作用引起了新的兴趣形成。与野生型（WT）小鼠(4);与这一观察结果一致，SPARC缺失的骨髓细胞显示分化为脂肪细胞而非成骨细胞的趋势增加(5). SPARC在脂肪中的表达在包括饮食诱导的各种小鼠肥胖模型中增强肥胖、硫代葡萄糖金治疗和对象/对象拉紧(6). 在一项临床研究中SPARC血浆浓度与体重指数呈正相关(7). 这些数据表明SPARC参与脂肪细胞分化和脂肪的调节组织周转。
脂肪细胞来源于间充质干细胞分化为前脂肪细胞，随后分化为脂肪细胞，这是一个过程称为脂肪生成。广泛的研究探讨了其机制转录因子和外源激素对体外培养脂肪生成的调节作用3T3-L1/F442电池。CAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是关键脂肪生成所需的因子，以及由胰岛素/胰岛素样生长因子-1和核受体(1,2). Wnt/β-catenin研究表明，该途径可抑制脂肪生成并促进成骨细胞生成(1,8,9). 激活该途径足以抑制前脂肪细胞的分化和凋亡通过抑制C/EBPα和PPARγ(9,10). Wnt蛋白与卷曲（Fz）受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白协同受体激活多种信号通路。重要的是通过Wnt抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）导致β-catenin在细胞质中的稳定性与its蛋白酶体降解。转位到细胞核后，β-catenin结合并共同激活包括T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）家族。此外，组成性激活的Fz1增加β-catenin的稳定性，抑制细胞凋亡，抑制脂肪生成，诱导成骨细胞生成(11).
我们最近报告说，SPARC调节肺成纤维细胞中的整合素连接激酶（ILK）(12). 另一组也是证明ILK活性介导SPARC在胶质瘤中的致瘤作用单元格(13). ILK还规定β-catenin途径通过GSK3β、β-catenin稳定的抑制作用(14,15). 进一步积累细胞质中的游离β-连环蛋白是ILK生产E-cadherin(14,16). SPARC抑制E-cadherin的表达和促进黑色素瘤细胞的肿瘤发生(17). 因此，我们假设SPARC可以通过ILK-β-catenin介导的信号传导。
在此，我们确定SPARC抑制脂肪生成并增强成骨细胞生成。SPARC不仅延缓了但也抑制了大多数脂肪细胞的表达转录因子和其他脂肪细胞特异性基因。值得注意的是，SPARC抑制β-catenin的降解并增强其核易位。SPARC对β-catenin的影响需要ILK积累。与对其他组织的影响一致(18-20),SPARC还调节ECM蛋白和整合素的生成依赖ILK的方式。这些数据确定了SPARC的新途径抑制脂肪生成。
实验程序
老鼠-描述了WT和SPARC阴性小鼠群体(21). C57BL/6重量和SPARC阴性小鼠保存在特定的无病设施中。全部动物实验符合NIH指南，并获得了机构动物护理和使用委员会。这些WT和SPARC-null鼠标具有具有四到十个混合遗传背景（129SV×C57BL/6）回传到C57BL/6背景中。
试剂和抗体-产生重组人SPARC并由我们的实验室进行纯化(22). 准备用于这些研究的SPARC含有0.001-0.005 ng内毒素/μg蛋白质由鲎属成釉细胞裂解物试验（CapeCod公司，马萨诸塞州E.Falmouth）。SPARC的纯度大于90%活性在细胞增殖试验中得到验证(23). 重组鼠戊型肝炎病毒蛋白质的生产如所述(24). 所有化学品试剂等级（Sigma）。购买山羊抗鼠SPARC抗体来自研发系统公司（明尼苏达州明尼阿波利斯）；兔抗β-肌动蛋白抗体来自Abcam公司（马萨诸塞州剑桥）；抗ILK抗体来自Upstate生物技术公司（纽约州普莱西德湖）；兔抗磷胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2；Thr-202/Tyr-204）和抗ERK1/2抗体来自细胞信号技术（Danvers，MA）；抗组蛋白，兔抗α5整合素和大鼠抗α6整合素抗体来自Chemicon International（加利福尼亚州特梅库拉）；抗鼠层粘连蛋白（LN）-1，单克隆抗细胞纤维连接蛋白（FN）和单克隆抗小病毒素抗体来自Sigma；小鼠抗β-catenin抗体及其阻断抗α6整合素（GoH3）抗体来自BD Bioscience。次要抗体结合物购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，公司（宾夕法尼亚州西格罗夫）。Alexa Fluor 488指骨苷和Hoechst 33258染料从Molecular Probes（俄勒冈州尤金）购买。Aquablock来自东海岸Bio公司（缅因州北伯威克）。细胞培养试剂，包括Dulbecco’s改良Eagle's培养基（DMEM）、DMEM/F-12、胰蛋白酶/EDTA、抗生素和胎牛血清购自Invitrogen。
脂肪中前脂肪细胞的分离与分化组织-来自小鼠脂肪组织的基质血管细胞（SVC）按说明准备(25).3～4周龄雄性小鼠腹股沟皮下脂肪沉积为在无菌条件下解剖，仔细检查淋巴结远离的。SVC是通过胶原酶从切碎的脂肪组织中获得的（Invitrogen）消化（2 mg/ml，37°C，DMEM中60分钟，轨道搅拌）。用吸液管将所得细胞悬浮液均匀化10-ml血清学塑料吸管，通过100-mm尼龙过滤器，以及以400×克10分钟去除成熟脂肪细胞，重新悬浮颗粒。红细胞将细胞置于低张缓冲液中1分钟后取出密度为3×104细胞/厘米2在DMEM/F12中补充10%胎牛血清、青霉素G和链霉素硫酸盐。当细胞汇合时，分化由增加0.1 m米地塞米松，0.25米米3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和17n米DMEM/F-12中的胰岛素含10%胎牛血清。48小时后，分化培养基为替换为仅含10%胎牛血清和胰岛素的DMEM/F-12。
油红色O染色-细胞在10%福尔马林中固定10min。在水中清洗两次后，细胞用0.5%的Oil-Red-O染色异丙醇：H2O（3:2，v:v）1小时后用水冲洗至去除未结合的染料，在徕卡倒置显微镜下拍摄细胞配备了数码相机。
3-磷酸甘油脱氢酶（GPDH）活性化验-细胞在50 m内裂解米三氯化氢（pH 8.0）包含1米米2-巯基乙醇和1 m米EDTA公司。接下来，将细胞裂解液进行超声波处理并离心以清除碎片。上清液用0.12米培养米β-NADH和0.2 m米100 m内的磷酸二羟丙酮米三乙醇胺/盐酸缓冲液（pH7.5），通过340 nm处的吸光度监测反应。
半定量RT-PCR-来自（前）脂肪细胞的总RNA用RNeasy自旋柱分离第0、2、4、6或7天的脂肪生成（齐阿根）。用上标II逆转录酶合成cDNA（Invitrogen）。PCR使用TaqDNA聚合酶（Invitrogen）进行以下引物：PPARγ2（正向，5′-ggagattctctgttgacccag-3′；反向，5′-ggcactcaatggccatgag-3′）、C/EBPα（正向，5′-cagttccagatcgcgcact-3′；反向，5′-ctagagatccagacga-3′），C/EBPβ（正向，5′-cgactacggttacgtgagcct-3′；反向，5′-cgacagctgctccacctttc-3′），C/EBPδ（正向，5′-cgcagagagagctt-3′；反向，5′-tcctgtgtcgcgcagggt-3′），脂蛋白脂肪酶（正向，5′-gcaagcaacacacaccagc-3′；反向，5′-cctggttagccgcgtt-3′），瘦素（正向，5′-atgtggagacccctgtg-3′；反向，5′-tcagcatggctacac-3′），骨钙素（正向，5′-gcagacacatgacca-3′；反向，5′-tggagctgctgacatcc-3′），runt-related转录因子2（RUNX2，正向5′-cccagccttactaca-3′；反向，5′-tatggagtgctgctggtctg-3′），36B4（正向，5′-ccagaggccattgaattctg-3′；反向，5′-cgaagagaccgaatccatatc-3′），LNα1链（正向，5′-gatgccatggcctagattg-3′；反向，5′-ggatggagagagctga-3′），LNα4链（正向，catgggatctattggcctg-3′；反向，5′-cacatagccgccttctgtgg-3′）、LNγ，5′-acctggaccgtctgattgacc-3′；反向，5′-agctgctcagcataccgtt-3′），α5整合素（正向，5′-gcgactggaatccaaga-3′；反向，5′-gctgcactacgctct-3′）和α6整合素（正向，5′-cttgaggaacaccgtca-3′；反向，5′-caactcaagaagaaacgg-3′）。
免疫印迹法-培养基中培养的细胞在放射性标记免疫沉淀分析缓冲液（50 m米三氯化氢，pH7.5150米米氯化钠、0.25%脱氧胆酸钠、0.1%诺耐特P-40和蛋白酶抑制剂的混合物），通过离心清除，并通过SDS-PAGE，然后用特定抗体检测，详见地物图例。
免疫染色-对于免疫组织化学，WAT用将甲基卡诺伊溶液放置24小时，然后将其嵌入石蜡中。将5μm厚的切片脱蜡并与对照山羊孵育IgG或山羊抗小鼠SPARC IgG。检测到结合的一级抗体辣根过氧化物酶结合驴抗羊IgG和组织化学用3，3′-二氨基联苯胺（载体加利福尼亚州伯灵盖姆实验室）作为基底。部分被复染苏木精。
为了进行免疫细胞化学，将前脂肪细胞贴在盖玻片上。在在某些分化阶段，细胞用10%福尔马林固定10然后用20%Aquablock和0.1%Triton X-100渗透。如图所示，使用特定的一级抗体和荧光素异硫氰酸盐或罗丹明结合的二级抗体。章节和用徕卡DMR显微镜检查细胞，并拍摄图像使用RT-Spot摄像机（诊断仪器，斯特林高地，MI）。
碱性磷酸酶染色-用磷酸盐缓冲盐水，细胞在甲醇/丙酮（1:1）中固定10-20°C时最小值。随后用水洗涤细胞两次5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四氮唑染色碱性磷酸酶底物缓冲液（Sigma）在37°C下放置45分钟。细胞在装有数码相机的徕卡倒置显微镜下拍摄摄像头。
ILK活性测定-200-250μg细胞裂解液与5μg兔多克隆抗ILK抗体（细胞信号转导技术）或IgG同型控制，以及蛋白质A-Sepharose珠（Amersham生物科学）。用高盐溶解缓冲液和激酶清洗络合物用5μg碱性髓磷脂进行反应缓冲液和激酶分析蛋白质作为底物。激酶活性用免疫印迹法测定磷酸化髓磷脂碱性蛋白的特异性抗体（Upstate生物技术）。
亚细胞分离-细胞被分离成细胞溶质和核组分（NUCLEI EZ Prep NUCLEI Isolation kit，Sigma）。将细胞刮入Nuclei EZ裂解缓冲液中，并通过用冰镇无血清DMEM洗涤两次后离心。细胞颗粒用Nuclei EZ裂解缓冲液再次清洗。核随后被在4°C下离心造粒。核馏分被溶解带有冷Nuclei EZ存储缓冲区。包含不同在还原条件下用SDS-PAGE分析馏分，随后，通过免疫印迹法。
小干扰RNA（siRNAs）的转染-等摩尔靶向小鼠ILK或SPARC的非特异性siRNA或siRNA的数量（Qiagen）根据制造商说明。将寡糖混合物添加到前脂肪细胞中细胞贴壁后培养18h。30小时后，媒体替换为如上所述的标准分化培养基。
萤光素酶报告基因测定—5 × 105用3μg Super 8×TOPflash转染细胞（来自Dr。Randall T.Moon，华盛顿大学，西雅图，华盛顿州）和20 ngpRenilla-TK（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）通过电穿孔。超级8×TOPflash包含八个TCF/LEF转录因子结合位点荧光素酶基因。48小时后，细胞被被动溶解缓冲器（Promega）。荧光素酶/肾素分析使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega）。荧光素酶的平均比率计算Renilla活性（相对光单位）。实验重复三次以上，共三次。
ECM蛋白质沉积-对于ECM蛋白质的定量，将细胞接种到6孔组织培养板中，并诱导其如上所述进行区分。每个孔中的细胞通过用冷镁反复洗涤2+/钙2+-免费磷酸盐缓冲盐水。对分离的细胞进行计数，然后进行裂解带裂解缓冲液（1%Nonide P-40，0.1%SDS，10 m米三氯化氢，pH7.5米和5米米EDTA）含有完整蛋白酶抑制剂混合物（罗氏应用科学）。沉积在平板上的蛋白质是通过与警察擦擦收集到放射性免疫沉淀中分析缓冲液。蛋白质浓度由双钦尼克酸测定（BCA）分析（Pierce）。蛋白质通过SDS-PAGE进行分解用抗LN-1或细胞FN抗体进行免疫印迹。
结果
SPARC抑制脂肪生成并增强成骨细胞生成-SPARC在WAT和大多数脂肪细胞()如前所述(6,7). 鉴于WAT中的SPARC以及将SPARC与肥胖联系起来的数据(4,6,7)，我们询问SPARC是否控制一个（或多个）促进脂肪生成的过程。我们从小鼠WAT中分离SVC并建立在体外描述的脂肪生成模型(25). SVC主要由通过免疫染色验证的前脂肪细胞（数据未显示）；巨噬细胞或内皮细胞的污染小于5%，根据CD31和F4/80染色。至少50%的细胞诱导脂肪生成后第7天分化为脂肪细胞，虽然细胞的实际分化能力在约10%。超过90%的WT SVCs表达SPARC。SPARC公司蛋白质在维持生长的细胞中呈弥散分布中等（GM），而SPARC的位置似乎更集中在第2天细胞核周围的内质网/高尔基样室脂肪生成(和补充图1）。在前脂肪细胞分化过程中SPARC蛋白在两个不同阶段增加：第一阶段，在624小时，第二天，在脂肪生成的第3-4天(). 这个脂肪生成第1天条件培养基中SPARC的浓度为～200 ng/ml。分化过程中β-肌动蛋白水平降低由于这一过程所需的主要细胞骨架重塑(26). ERK1/2被磷酸化只有在有丝分裂克隆的早期分化时才激活膨胀发生(和补充图2）(27).
SPARC在WAT中的表达。 A类，WAT中的SPARC蛋白来自WT（+/+）和SPARC null的附睾WAT的免疫组织化学显示成年小鼠（-/-）。组织切片用正常山羊IgG或山羊染色抗鼠SPARC(统计过程控制)抗体。比例尺，50微米。B类，WT前脂肪细胞在GM或成脂培养基中培养(D2类)持续2天。随后固定细胞，使其具有渗透性，并暴露于抗SPARC IgG和异硫氰酸荧光素结合物二级抗体。比例尺，20微米。C，的表达式通过免疫印迹评估脂肪生成过程中的SPARC。WT小鼠的前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞。细胞在0分钟、10分钟时被裂解诱导后第1、2、3、4和6天区别。总蛋白浓度通过BCA分析测定，用SDS-PAGE溶解等量的细胞裂解物并探测SPARC，β-肌动蛋白，磷酸化ERK1/2(pERK1/2型)、和总计ERK1/2。
分化第7天，将培养的SPARC阴性细胞固定并用Oil-Red-O染色或提取用于GPDH活性测定。已净化将SPARC蛋白同时添加到分化培养物中培养基，每2天补充一次。SPARC蛋白没有改变细胞凋亡指数，根据吖啶橙试验（数据不如图所示）。如所示，2μg/ml SPARC显著抑制脂肪生成在这些原始文化中。hevin（SPARC同源物）和SPARC蛋白都是从昆虫细胞中提纯。赫文和牛血清白蛋白（BSA）因此用作对照，它们都没有显示出对脂肪生成的影响，部分变性后的SPARC蛋白显著减少活动().SPARC的抑制作用与浓度有关(). 这个内源性SPARC水平（200 ng/ml）应发挥一定的抑制作用脂肪生成；因此，抗SPARC IgG可以挽救存在SPARC并阻止了80%的SPARC活动().
SPARC抑制小鼠前脂肪细胞的分化。从SPARC阴性雄性小鼠分离WAT前脂肪细胞。A类,前脂肪细胞在GM或脂肪生成培养基中培养英国标准协会(D/BSA公司，20μg/ml）或SPARC(D/SPC/2号机组，2μg/ml；D/SPC/20日20μg/ml）。SPARC每2天补充一次。第7天，细胞被油红O染色并拍照。B类，前脂肪细胞在GM或有BSA存在的成脂培养基中培养(D/BSA公司，20μg/ml），hevin(D/赫文，2μg/ml），部分变性SPARC(煮沸/20，20μg/ml）或SPARC（D/SPC,2:2微克/毫升；20，20μg/ml）。在第7天测量GPDH活性。误差线代表样本总体平均值中的一个S.D属于n个= 3.**,第页<0.005，学生的t吨测试，SPARC处理细胞与BSA处理细胞的比较。#，第页<0.005，学生t吨测试，用于部分处理的细胞变性SPARC与活性SPARC处理细胞的比较（20μg/ml）。C，SPARC的浓度依赖性抑制作用。SPARC是以不同浓度（0、10 ng/ml、100 ng/ml和500纳克/毫升、1μg/ml或2μg/ml）。在第7天测量GPDH活性。这个WT前脂肪细胞中内源性SPARC的水平由虚线行。D类，抗SPARC IgG部分阻断SPARC的抑制作用。兔抗SPARC IgG(抗体)一起加入成脂培养基与BSA(D/BSA公司)或SPARC(数据/统计过程控制)摩尔比为5:1（Ab:SPARC）。在第7天测量GPDH活性。误差线代表平均值中的一个S.D。检测分为两次，共三次。*,第页<0.05，学生的t吨测试。
前脂肪细胞和间充质干细胞分化为成骨细胞在长期文化下。SPARC显著增强成骨细胞形成21诱导分化后第天（补充图3）。这些数据支持先前关于SPARC抑制脂肪生成并增强成骨细胞生成(4,5,28).
为了证实SPARC对脂肪细胞分化的影响，我们比较了差异化在体外WT和SPARC-null的前脂肪细胞老鼠。从每个基因型的附睾WAT中分离出前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞。7天后，脂肪细胞增多在SPARC阴性的培养物中观察到更多的脂肪积累前脂肪细胞与野生型前脂肪细胞的比较(). 我们还测试了这些前脂肪细胞分化为成骨细胞。第28天，细胞染色成骨细胞标志物碱性磷酸酶。污渍较少SPARC阴性前脂肪细胞中的细胞(). 这些数据进一步证明SPARC调节间充质干细胞谱系承诺。
SPARC-null中脂肪生成增强和骨生成减少前脂肪细胞。来自年龄匹配WT（+/+）和SPARC-null的前脂肪细胞（-/-）小鼠在成脂培养基中诱导分化。之后第7天拍摄诱导细胞(A类和B类)、和GPDH测量了放射性(C).D类和E类，个单元格碱性磷酸酶染色（成骨细胞标记物(紫色))28天诱导后。*,第页<0.05，学生的t吨测试。
SPARC抑制脂肪细胞基因表达并增强成骨细胞基因表达式-脂肪生成需要序列表达脂肪生成转录因子和脂肪细胞基因。我们接下来检查了SPARC存在或不存在时特定mRNA的水平。通过RT-PCR()，的转录因子C/EBPα、C/EBPβ和PPARγ2均为SPARC显著降低，而C/EBPδ不变。瘦素和脂蛋白脂肪酶等脂肪细胞基因也大量存在由SPARC减少。相反，成骨细胞分化所需的基因SPARC增强了(). RUNX2是成骨细胞形成(29).SPARC增强RUNX2和成骨细胞特异性基因的表达SPARC也刺激骨钙素。这些数据支持以下说法：SPARC阻断与脂肪细胞相关的某些基因的表达两个成骨细胞特异性基因的分化和增强。
SPARC抑制脂肪细胞基因表达(A类)并增强成骨细胞基因表达(B类).RNA的半定量RT-PCR在GM或成脂培养基中培养的小鼠前脂肪细胞2μg/ml BSA或2μg/ml SPARC(统计过程控制).A类，C/EBPβ和C/EBPδmRNAs在第2天从前脂肪细胞中获得区别；PPARγ2、C/EBPα、瘦素、脂蛋白脂肪酶(低密度脂蛋白)，和36B4信使核糖核酸来源于第7天的前脂肪细胞区别。每个波段下方是比较带密度，将其归一化为36B4，以便进行量化。B类,在前脂肪细胞第2天、第4天和第6天通过RT-PCR测定mRNA水平区别。带密度标准化为36B4，以允许量化。数字表示这两个条件（+/-SPARC）。
分化混合物由胰岛素、地塞米松和IBMX，每个都激活复杂的下游信号。要识别受SPARC影响的信号通路，我们首先探讨了SPARC在分化培养基缺乏上述一种或多种因素。如所示补充图4，SPARC似乎主要抑制IBMX诱导的区别。这种化合物是最大限度分化前脂肪细胞。相反，SPARC对胰岛素单独或与胰岛素联合诱导分化地塞米松。因此，SPARC仅表现出显著的抑制作用在IBMX在场的情况下。
SPARC延缓（前）脂肪细胞在脂肪生成-成纤维细胞样前脂肪细胞在形态分化为球形脂肪细胞。在此期间过程中，细胞粘附减弱，肌动蛋白应力纤维减少至允许脂肪在胞浆中积聚。给定SPARC在细胞与ECM相互作用的调节，我们接下来检查SPARC是否影响脂肪生成过程中的细胞骨架重塑和细胞粘附。我们弄脏了焦点粘附蛋白vinculin和F-actin的细胞(). 第2天脂肪生成，分化混合物（D/BSA）触发前脂肪细胞丢失大部分局灶性粘连；肌动蛋白应激纤维减少细胞边缘形成皱褶。然而，在SPARC在场的情况下（D/SPC，2μg/ml），含vinculin的局灶性粘连的构型肌动蛋白应力纤维与两种生长介质中观察到的纤维不同（总经理；顶部面板)分化培养基（D/BSA；中间的面板). 尽管如此，细胞仍保留了一些含有小病毒素的局灶性粘连它们的数量、大小和密度都显著下降(). 此外，应力纤维中F-actin的重排(顶部面板)，主要是变成皮质结构(中间面板)，被部分抑制由SPARC提供(底部面板) ()如前所述(12). 因此，SPARC干扰脂肪生成所必需的细胞形态变化。
SPARC影响前脂肪细胞在区别。 A类，前脂肪细胞在GM或2μg/ml BSA存在下的成脂培养基(D/BSA公司)或SPARC(数据/统计过程控制)持续2天。细胞随后被固定、渲染可渗透，并暴露于抗长春花蛋白IgG和荧光素异硫氰酸盐结合二级抗体(文丘林)或Alexa氟488卵磷脂(肌动蛋白).比例尺，20微米。B类根据vinculin染色定量局灶性粘连。使用ImageJ分析软件手动追踪病灶粘连。焦点的以像素为单位测量粘附平均尺寸。对于每个治疗每个细胞的焦点粘附数和焦点粘附平均大小（±S.E.）测定至少八个随机选择的细胞。所示数据代表三个独立实验。
SPARC在早期促进ILK活动脂肪生成-SPARC调节两个肺成纤维细胞的ILK活性和胶质瘤细胞(12,13). SPARC是否监管ILK脂肪生成期间的活动？我们首先测试ILK的表达水平。脂肪细胞中ILK蛋白水平无明显变化分化或存在SPARC蛋白(). 然而，在诱导分化10分钟后，ILK活性通过SPARC公司(). 我们还测试了ILK的两个下游靶点，即GSK-3β和AKT。这个在早期阶段，SPARC没有改变AKT的磷酸化脂肪生成（数据未显示）。ILK可以在Ser-9处磷酸化GSK3β使激酶失活并抑制其对β-连环蛋白(14).SPARC持续增强GSK3β6 h后的Ser磷酸化分化的诱导().
SPARC在脂肪细胞早期调节ILK活性区别。 A类ILK蛋白和GAPDH通过脂肪生成诱导后0、6和24小时的免疫印迹是否存在SPARC（2μg/ml）。B类10分钟和6小时后通过以下方法测量前脂肪细胞中ILK活性的诱导分化抗磷酸髓鞘碱性蛋白免疫印迹的激酶测定(多氯联苯)抗体。每个波段下面是比较波段密度。C，磷酸化GSK3β(第GSK3页β、 Ser-9），总计在0、30分钟和6小时通过免疫印迹法测定GSK3β和GAPDH在存在或不存在SPARC的情况下诱导脂肪生成后（2μg/ml）。将带密度归一化为GAPDH的带密度，以允许量化。数字表示这两个条件（+/-SPARC）。
SPARC诱因β-连环蛋白积累与核换位-Wnt/β-catenin途径的增强抑制脂肪生成并增加成骨细胞生成(8). 的级别β-catenin在前8小时增加，随后在脂肪生成(14,30); β-catenin也是ILK确定的下游目标之一(14). 因此，我们要求SPARC是否通过包括ILK和β-连环蛋白。如所示，SPARC增强β-catenin在总细胞在分化的前8-24小时内溶解。此外，在SPARC的存在，核部分中β-连环蛋白的水平分化8小时时较高(). 分化24小时后，β-catenin与生长中的细胞相比，胞浆中的信号减弱介质(,D类与通用汽车). 相反，在SPARC存在的情况下，β-catenin是在细胞核和紧邻细胞核的细胞质中观察到(,数据/统计过程控制). 一直以来，β-连环蛋白水平在8小时后SPARC阴性前脂肪细胞与WT前脂肪细胞的比较分化的诱导().
SPARC诱导β-连环蛋白积累与核易位。 A类和B类之后的第0、8、24和48小时在缺乏（-）或存在（+）SPARC的情况下诱导脂肪生成，SPARC阴性细胞被裂解或分离为核细胞和细胞溶质分数。A类，β-连环蛋白和GAPDH的水平通过总细胞裂解物的免疫印迹。B类β-catenin水平，GAPDH和组蛋白1通过细胞溶质和核蛋白提取物。C来自WT的前脂肪细胞（+/+）和在相同条件下诱导SPARC-null（-/-）小鼠分化如上所述。β-catenin、内源性SPARC水平(mSPARC公司),在诱导后8 h和24 h通过免疫印迹法测定GAPDH差异化。D类，在GM中培养SPARC阴性前脂肪细胞或不含脂肪培养基(D类)或存在2μg/mlSPARC公司(数据/统计过程控制)24小时后，细胞被固定，呈现可渗透，暴露于抗β-连环蛋白IgG和荧光素异硫氰酸盐结合二级抗体和Hoechst 33258染料(蓝色，右侧面板).比例尺，20微米。
β-连环蛋白转位到细胞核，与TCF/LEF转录因子家族及其转录激活活动。在SPARC存在的情况下，TCF4蛋白显著增加抗β-catenin抗体共免疫沉淀(). 此外，SPARC增强了Super中TCF绑定元素的事务激活8×TOP-flash结构。尽管2μg/ml SPARC对TOP-flash活性不如20m活性强米氯化锂，SPARC引发TOPflash活性的持续增加，在统计学上重要的().综合来看，这些数据表明SPARC增强了β-catenin介导的信号传导。
SPARC增强了β-catenin和TCF4以及TCF反应元件的反式激活。 A类,共免疫沉淀(IP（IP）)TCF4与任一正常兔IgG(Rb IgG)或兔抗β-连环蛋白IgG（β-连环蛋白)诱导分化后8h前脂肪细胞裂解物中有（+）或无（-）SPARC（2μg/ml）。IB公司，免疫印迹。B类3μg Super 8×TOPflash和20 ng pRenilla-TK转染成5×105前脂肪细胞。血清后饥饿12 h，用2μg/ml BSA、2μg/mlSPARC、，或20米米LiCl转染16小时48小时后，检测细胞荧光素酶活性。*,第页<0.05，学生的t吨SPARC或LiCl处理细胞与BSA处理细胞的比较试验细胞。
SPARC的抑制作用需要ILK活性脂肪生成-Rho和Rho激酶通过细胞形状的调节(31).然而，Rac（NSC23766）、Rho激酶（Y27632）和磷脂酰肌醇3-激酶（LY294002）没有阻断SPARC（未显示数据）。ILK特异性抑制剂KP747(32)，单独没有提高脂肪生成；然而，它部分阻断了SPARC的抑制作用脂肪细胞分化。如所示，0.5微克/毫升(0.012 μ米)SPARC抑制脂肪生成60%。在场的情况下10μ米KP747，SPARC抑制脂肪生成20%。增加的KP747的浓度进一步阻断了SPARC的抑制作用，尽管ILK抑制剂没有产生完全的抑制作用().
SPARC的抑制作用需要ILK活性脂肪生成。 A类，诱导前脂肪细胞分化为是否存在SPARC（0.5μg/ml，0.012μ米)和不同浓度的ILK抑制剂（KP747、10、20和40μ米)或Rho激酶抑制剂（Y27632、10、25和50μ米). 等量的抑制剂溶剂（DMSO或Hanks平衡盐溶液(哈佛商学院))作为对照添加到区域性中。SPARC公司每24小时补充一次蛋白质和抑制剂。测量GPDH活性第7天。B类ILK的RNA干扰抑制SPARC诱导的β-catenin积聚。用等摩尔转染前脂肪细胞非靶向对照的siRNA数量(CK-siRNA，1号车道和2)或ILK(ILK-siRNA，车道3和4)30小时前分化的诱导。β-catenin、ILK和GAPDH水平诱导分化后8h用免疫印迹法检测当面(车道2和4)或缺席(车道1和三)SPARC（2μg/ml）。C，的频带密度β-连环蛋白B类已归一化为GAPDH，以允许量化。数据表示三个独立变量的平均值±S.E实验。
测试SPARC是否通过ILK，我们使用了靶向ILK的特异性siRNA。非特异性siRNA或siRNA-靶向ILK在诱导区别。ILK表达水平在8小时内下降了60%以上诱导后(). siRNA靶向ILK，而非非特异性siRNA，阻断SPARC对β-catenin积累的影响(). 这些数据表明，SPARC需要ILK诱导脂肪细胞早期β-catenin的积累区别。
SPARC规范ECM的表达、存放和组织蛋白质-ECM蛋白与细胞表面受体相互作用，尤其是整合素，并转导外源信号调节细胞功能。在脂肪生成过程中，广泛的ECM重塑调节前脂肪细胞的形态学变化。扁平成纤维细胞样前脂肪细胞聚集成球形脂肪细胞，局部粘连消失，压力增加光纤丢失。ECM从富含FN的基质转化为富含LN基底膜。鉴于FN抑制脂肪生成和LN/Matrigel促进脂肪生成(26,33)，我们询问SPARC是否在此过程中调节FN和LN的生成。
基底膜的组装始于LN的自聚合(34,35). LN的主要类型脂肪组织中表达的是LN-8（α4β1γ1）(36)，已检测到在基膜中，但不会自聚合(34). 在大多数组织中，LN-1（α1β1γ1）是启动基底膜。因此，我们检测了LNα1和脂肪细胞分化过程中的α4链。在（前）脂肪细胞中LNα1链的水平低于LNα4链(). 在在原代培养中，成熟细胞表面检测到LNα1链脂肪细胞作为网状网络（数据未显示），以及脂肪生成过程中α1链增加()，数据表明α1链可能引发基底的组装膜。SPARC显著抑制LNα1的表达链条(),与我们的数据一致，SPARC抑制完整组织的形成，晶状体中的功能性基底膜(37,38). 相反，表示SPARC使α4链略有增强，γ1链增强脂肪生成第6天链增强().
SPARC调节脂肪生成过程中的ECM生成。 A类，mRNA通过以下方法测定LNα1、LNα4、LNγ1和36B4的水平产脂培养前脂肪细胞总RNA的RT-PCR第2天、第4天和第6天，SPARC存在（+）或不存在（-）时为中等浓度。波段将密度标准化为36B4的密度以允许定量。数字表示两种条件下的带密度比较比率（+/-SPARC）。B类诱导分化前脂肪细胞后24小时在5μ米磷酸盐缓冲盐水中的EDTA。发动机控制模块培养板上的蛋白质(发动机控制模块)和细胞内的裂解物(细胞)在含有0.5%的SDS-PAGE缓冲液中溶解β-巯基乙醇，SDS-PAGE分析。LN（LN-β/γ）免疫印迹法检测细胞FN。数字代表两种条件下的带密度比较比（+/-SPARC）。C诱导脂肪生成后7天，2μg/ml牛血清白蛋白（BSA，一和c（c）)或2μg/ml SPARC（SPARC，b条和d日)，细胞暴露于抗鼠LNα1β1γ1后接Cy3-结合二级抗体(红色)和Hoechst 33258染料(蓝色).一和b条，成熟脂肪细胞；c（c）和d日，未分化细胞。比例尺，20微米。
沉淀在培养皿上的总LN蛋白也减少了SPARC公司(). 在相反，SPARC增强了FN的沉积()，尽管FN的mRNA水平未受影响（数据未显示）。SPARC也影响细胞周围LN网络的形成。如所示，的脂肪细胞表面LN网状网络的形成和更多未分化细胞中广泛的细胞间LN基质减少在SPARC在场的情况下。这些结果支持了SPARC抑制脂肪生成部分通过调节ECM蛋白表达和沉积。
SPARC调节整合素的表达-α5-和含有α6的整合素是FN和LN的主要受体，分别是。接下来我们研究了SPARC对表达和脂肪细胞中α5和α6整合素亚基的活性区别。脂肪细胞分化过程中α5降低(),与报道一致，α5整合素的过度表达亚单位显著抑制脂肪生成(39). SPARC增强了α5整合素在脂肪生成第1-2天和第6天的表达(). 与α5整合素相反，α6的水平整合素在脂肪细胞分化过程中普遍增强(39)()、和α6整合素的表达在脂肪生成后期的SPARC(). 因此，SPARC对α整合素亚基的选择性表达与its一致对相应ECM配体的影响，并有助于其抑制脂肪生成活性。
SPARC调节脂肪生成过程中整合素的表达。
A类α5和α6整合素mRNA的水平通过产脂培养前脂肪细胞总RNA的RT-PCR培养基中每天有（+）或无（-）SPARC（2μg/ml）(D类)2、4和6。带密度标准化为36B4至允许量化。数字代表波段的比较比率两种条件下的密度（+/-SPARC）。B类，前脂肪细胞被裂解诱导分化后第1、2、4和6天。细胞裂解物（10μg）在非还原条件下通过SDS-PAGE进行拆分免疫印迹法检测α5和α6整合素。蛋白质负荷相等用Ponceau S染色显示(蓬索S). 频带密度为归一化为相应的Ponceau S染色，以允许量化。数字表示两个条件（+/-SPARC）。
SPARC通过以下途径调节整合素的表达β-连环蛋白介导的信号传导脂肪生成-Wnt/β-catenin抑制脂肪生成；然而，它尚不清楚Wnt/β-catenin是否调节整合素的表达脂肪生成过程中的ECM重塑。接下来我们测量了脂肪细胞分化过程中LiCl处理的细胞中的α6整合素。氯化锂是GSK-3β的ATP非竞争性抑制剂，导致β-catenin的积累(40,41). 在脂肪生成的第2天，20米米LiCl显著抑制α6的表达整合素().此外，LiCl增强了SPARC诱导的脂肪生成第4天的α6整合素().ILK的激活通过以下途径增加β-catenin的积累GSK-3β。测试ILK是否调节相关基因的表达整合素，我们使用特异性siRNA靶向ILK。ILK的RNA干扰阻断SPARC对α6整合素表达的抑制作用(). 这些数据表明β-catenin介导的信号转导影响表达脂肪生成过程中某些整合素的表达。因此，SPARC调节ECM通过ILK/β-catenin介导的信号通路重塑。
β-连环蛋白介导的信号调节α6脂肪生成过程中的整合素。α6整合素的表达采用半定量RT-PCR进行分析。A类，前脂肪细胞在有（+）或无（-）SPARC（2）的成脂培养基中培养μg/ml）或氯化锂（20 m米)在天(D类)2和4。B类,ILK的RNA干扰阻断SPARC对α6整合素的表达。等摩尔转染前脂肪细胞非靶向对照的siRNA数量(CK-siRNA)或ILK(ILK-siRNA)分化诱导前30小时。细胞是在第2天处理以分离总RNA。带密度为归一化为36B4以允许量化。数字代表比较带密度。
讨论
SPARC是一种基质细胞蛋白，调节细胞与ECM的相互作用，从而调节细胞形态的变化。SPARC-null小鼠显示增加脂肪堆积。精确的生物和分子机制这种表型在很大程度上仍然未知。在这项研究中，我们发现了一个SPARC在脂肪细胞分化中的新功能。外源性SPARC抑制小鼠原代前脂肪细胞的分化。初级前脂肪细胞来自SPARC阴性小鼠脂肪细胞分化和成骨细胞分化倾向减弱。SPARC禁止关键脂肪生成转录因子的表达，如C/EBPβ，C/EBPα、PPARγ和脂肪细胞特异性基因。SPARC还诱导β-catenin的积累和核转位部分由ILK控制，这是SPARC的已知目标(12). 随后，SPARC增强FN沉积和α5整合素的表达抑制LNα1链和α6整合素的表达，后者成熟脂肪细胞形成基底层所必需的伴侣。先前的研究表明，SPARC刺激FN组装是依赖ILK(12).
SPARC通过增强Wnt/β-catenin抑制脂肪生成发送信号。β-catenin的积累在外源或内源性SPARC。在脂肪生成的早期阶段，SPARC抑制IBMX诱导的分化（补充图4）。其中一个IBMX的作用是在微分(42).SPARC始终在早期抑制C/EBPβ的表达这一过程。地塞米松存在下C/EBPβ的表达有助于PPARγ的诱导和β-连环蛋白(30). 期间早期脂肪生成，β-连环蛋白丰度的下降与随着PPARγ的积累(30). PPARγ可以抑制Wnt通过磷酸化β-catenin靶向蛋白酶体(30,43,44). 相反，β-catenin不仅抑制PPARγ的表达，而且还抑制它的转录活性通过与其直接相互作用TCF/LEF绑定域(44).此外，Wnt/β-catenin通过抑制C/EBPα和PPARγ的表达(45). SPARC始终如一显著抑制PPARγ和C/EBPα的表达分化的后期阶段。这些数据进一步证明SPARC通过抑制脂肪生成的关键转录级联Wnt/β-catenin途径。
Wnt/β-catenin途径在骨骼发生。间充质干细胞中β-catenin的失活阻止成骨细胞分化(46). 出生后β-catenin也促进分化能力成骨细胞抑制破骨细胞分化(47,48). 始终有条件骨骼祖细胞β-catenin失活或Lrp5失活（Wnt受体）导致低骨量（骨量减少）(46). 这个β-catenin-TCF/LEF复合物调节成骨细胞的表达基因RUNX2、RANK配体、骨保护素和骨钙素(47,49,50). 类似地，SPARC-null随着动物年龄的增长，小鼠骨质减少的情况变得更加严重(28). 与我们的一致数据显示，来自SPARC缺失骨髓的间充质干细胞显示形成脂肪细胞的趋势和形成成骨细胞的趋势降低(5). 因此，SPARC可以通过Wnt/β-catenin途径。
SPARC不仅与ECM组件相互作用，还与整合素和生长因子。SPARC与β1整合素相互作用，随后增强ILK的激活(51). 在前脂肪细胞中，SPARC模拟肽与α5β1整合素结合(52). SPARC也参与其中生长因子信号转导；例如，与血小板衍生生长结合因子和血管内皮生长因子并抑制这些生长因子与其同源受体(53-56).我们的数据表明，SPARC在早期增强了ILK的活动脂肪细胞分化阶段，部分ILK特异性抑制剂阻断SPARC的抑制作用。ILK可以通过β1/β3整合素与胞质尾部的相互作用；或者，胰岛素、血小板衍生生长因子和其他生长因子因子可以通过磷脂酰肌醇3-激酶刺激ILK活性(57,58). 因此，SPARC可能会增强通过β1/β3整合素或某些生长因子的ILK活性和/或其受体。SPARC还诱导磷酸化和活化胶质瘤细胞中黏着斑激酶的表达(13). 在脂肪细胞分化，前脂肪细胞部分脱落，局部粘连复合物丢失，粘着斑激酶活性（磷酸化）降低。SPARC确实能够维持ILK和前脂肪细胞中的黏着斑激酶。因此，ILK活动将保持ECM成分、整合素和肌动蛋白之间的联系细胞骨架，随后保存局部粘附复合物。那个Rho激酶抑制剂没有阻断SPARC对分化表明Rho激酶不参与由SPARC和ILK赋予的下游信令。
脂肪生成的特点是从富含FN的基质转化而来基质至富含LN的基底层；一致的整合素表达开关从α5（FN）到α6（LN）(39). LN和Matrigel增强脂肪生成；FN、I型和III型胶原以及聚-我-赖氨酸分泌脂肪生成的抑制作用(1,33,39). 抑制活性FN需要细胞扩散，细胞松弛素D通过其肌动蛋白的破坏细丝，克服了FN的抑制作用(26). ECM的改造蛋白质诱导细胞骨架的改变。FN与肌动蛋白应激有关纤维，而细胞表面的LN聚合促进形成皮层肌动蛋白网络(59). SPARC调节ECM蛋白质表达和沉积。例如，SPARC调节表达式I型胶原的纤维生成。SPARC阴性小鼠的真皮展示胶原原纤维直径减小，拉伸强度降低(20). 在脂肪生成过程中，我们发现SPARC增强了FN的沉积和其表达受体，α5整合素。在肺成纤维细胞中，SPARC增强了细胞介导的FN分子的部分展开与FN诱导的应力纤维形成通过ILK依赖性收缩信号(12). FN的展开分子是FN原纤维形成的重要步骤。这里我们建议SPARC还可以通过ILK信号增强这一过程，并有助于FN沉积增加。PPARγ抑制肺癌细胞中α5整合素基因的研究(60). 因此，增加在α5整合素表达中，我们观察到下游效应SPARC引起的PPARγ表达减少。
我们还发现SPARC抑制LNα1链的表达其主要受体之一α6整合素以及沉积LN本身。SPARC调节晶状体细胞LN的分泌和沉积(37). 的表达式α6整合素与前脂肪细胞生长相关脂肪生成，它有利于分化而不是增殖前脂肪细胞(39). α6整合素和LN促进脂肪生成和脂质积累。互动LN和α7β1整合素是基底层形成所必需的肌动蛋白在肌肉细胞中的重组(59). 类似地，α6受体促进LN自组装可能需要整合素，基础椎板形成、肌动蛋白重组和其他脂肪生成信号事件。因此，SPARC通过干扰脂肪形成抑制脂肪生成基底层。
Wnt/β-catenin信号是否调节ECM重塑和脂肪生成过程中整合素和ECM成分的表达？尽管如此尚不清楚Wnt/β-catenin是否直接调节整合素或任何ECM成分，我们提供的证据表明β-catenin介导的信号通路参与整合素的调节表达式。LiCl是β-catenin信号传导的强诱导剂抑制α6整合素的表达。ILK活性增强β-catenin的积累，是SPARC抑制α6整合素的表达。SPARC可以通过β-catenin介导的信号传导，可能通过PPARγ(44).
总之，我们已经证明1）SPARC抑制脂肪生成和增强成骨细胞生成，2）SPARC激活ILK，导致β-catenin的积累和核转位，3）SPARC抑制脂肪细胞分化所需的随后ECM重塑，以及4）SPARC通过β-catenin介导的信号调节ECM重塑。总之，我们的发现表明SPARC对因此，脂肪生成可能是肥胖和相关代谢紊乱。
笔记
*这项工作得到了National的全部或部分支持卫生研究院拨款R01-GM40711（至E.H.S.）。出版成本这篇文章的部分费用是由页面费支付的。这个因此，物品必须在此标记“广告”根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。
本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图1-4。
脚注
三使用的缩写是：WAT，白色脂肪组织；ECM，细胞外矩阵；GM，生长介质；野生型；C/EBPα，CAAT/增强子结合蛋白α；PPARγ，过氧化物酶体增殖物激活受体γ; TCF/LEF、T细胞因子/淋巴增强因子；GSK3β，糖原合成酶激酶3β；ILK，整合素连接激酶；LN，层粘连蛋白；纤维连接蛋白；IBMX，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；GPDH，甘油-3-磷酸脱氢酶；ERK1/2，细胞外信号调节激酶1/2；BSA，牛血清白蛋白；RUNX2，runt-related转录因子2；DMEM、Dulbecco’s改良Eagle's培养基；SVC，基质血管细胞；RT，反向转录。
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