投资眼科视觉科学。作者手稿；PMC 2009年12月1日提供。
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PMCID公司：下午2610264
NIHMSID公司：NIHMS81611标准
犬尿氨酸对晶状体上皮细胞周期的阻滞作用
,1 ,2 ,2 ,2 ,三 ,三和1中，2
曼尼什·梅兰科特
1俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系
道恩·史密斯
2俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学视觉科学研究中心
斯科特·豪厄尔
2俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学视觉科学研究中心
王本莲（Benlian Wang）
2俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学视觉科学研究中心
詹姆斯·雅各布伯格
三俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学综合癌症中心
塔米·斯特凡
三俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学综合癌症中心
拉姆·纳加拉吉
1俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系
2俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学视觉科学研究中心
1俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学眼科和视觉科学系
2俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学视觉科学研究中心
三俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学综合癌症中心
通讯作者：Ram H.Nagaraj，眼科和视觉科学系，病理大楼，凯斯西储大学311室，2085 Adelbert Road，Cleveland，OH 44106；ude.esac@jaragan.mar. 摘要
目的
吲哚胺2，3-二加氧酶（IDO）介导的色氨酸氧化产生犬尿氨酸（KYNs），这可能在白内障的形成中发挥作用。KYN引起细胞变化的分子机制尚不清楚。研究了KYNs通过过度表达人IDO对小鼠晶状体上皮细胞的影响。
方法
使用来自人类IDO过度表达半合子转基因（hemTg）和野生型（Wt）小鼠的晶状体上皮细胞（mLECs）。IDO活性通过HPLC定量犬尿氨酸（KYN）进行测定。免疫细胞化学检测KYN介导的蛋白修饰，ELISA检测。用商用试剂盒测量细胞增殖和凋亡。用流式细胞仪分析细胞周期各期之间的细胞分布。免疫沉淀和LC/MS用于鉴定犬尿蛋白修饰蛋白。
结果
来自hemTg动物的mLECs显示出相当大的IDO免疫反应性和酶活性，而在Wt-mLECs中几乎检测不到。在hemTg中检测到KYN和KYN介导的蛋白修饰，但在Wt-mLECs中未检测到；修饰蛋白为肌球蛋白II和α/γ-肌动蛋白。HemTg-mLECs的活性和增殖降低。对hemTg-mLEC培养物的细胞周期分析显示，G2/M或两相，相对于Wt mLEC。用1-甲基阻断IDO活性-d日,我-hemTg mLECs中的色氨酸阻止KYN形成、KYN介导的蛋白质修饰和G2/M被捕。
结论
mLECs中过量的IDO活性导致KYN产生、KYN介导的肌球蛋白II修饰和α/γ-肌动蛋白和细胞周期扰动。肌球蛋白II和γ-KYN的肌动蛋白可能干扰胞质分裂，导致上皮细胞分裂缺陷，从而减少纤维细胞数量。
吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）催化色氨酸氧化为N个-甲酰尿氨酸（NFK）是尿氨酸途径的第一步。通过一系列反应，包括中间产物，如氰尿酸（KYN）和3-羟基氰尿苷（3OHKYN，N个-甲酰尿氨酸最终形成NAD。1,23OHKYN被葡萄糖基化形成3OHKY-葡萄糖苷，它是人类晶状体中的一种主要的犬尿氨酸。三IDO的产生在感染或炎症期间显著增加，并由包括干扰素（IFN）在内的促炎细胞因子诱导-γ.4
一些证据表明，IDO通过消耗必需氨基酸抑制细胞增殖我-色氨酸。IDO与抑制病毒传播有关5和原生动物寄生虫6并且还与抑制肿瘤细胞中T细胞介导的免疫应答有关。7,8在胎盘中，IDO表达抑制母体T细胞介导的异基因胎儿排斥反应。9表达IDO的树突状细胞在体外抑制异基因T细胞增殖。10
在晶状体中，IDO在前上皮中表达。11镜头对紫外线A的吸收部分归因于KYN。KYN很容易通过细胞膜，并可能通过皮层扩散到晶状体核。在生理pH值下，KYN经过侧链脱氨基生成α, β-不饱和酮烯，12与晶状体蛋白中的亲核氨基酸以及谷胱甘肽的半胱氨酸残基反应三,13-16通过Michael加成，形成共价加合物。这种加合物存在于50岁以上人群晶状体核区，17但在年龄匹配患者的白内障晶状体中，它们的浓度降低，18可能是由于进一步退化。最近的研究表明，这种修饰对晶状体蛋白的有害影响，包括α-晶体蛋白。例如，脱氨基KYN对His83的修饰α晶体蛋白降低其伴侣功能。19KYN与活性氧物种（ROS）介导的结晶蛋白修饰有关，因为它们可以在存在微量金属离子的情况下自发产生ROS。这种反应与晶体蛋白的交联有关，20这表明KYNs在一定程度上负责老化和白内障晶状体中蛋白质的化学修饰和交联。
KYN也具有细胞毒性作用。包括神经细胞在内的几项研究表明，KYN具有促凋亡作用。21,22这种效应可能是过度表达IDO的肾小管上皮细胞凋亡增强的原因。23尽管有这些发现，但KYN影响细胞的分子机制尚不清楚。为了回答这个问题，在最近的一项研究中（Mailankot等人，提交了手稿），我们开发了一种在晶状体中表达人类IDO（hIDO）的转基因（Tg）小鼠模型。纯合子（homTg）动物的晶状体具有高IDO活性，并且具有野生型动物晶状体中不存在的以下特征：晶状体（1）在出生后3个月内表现出致密核白内障，直径明显较小，（2）具有高KYN和KYN修饰蛋白含量，以及（3）严重降低了纤维细胞的分化，晶状体核未分化纤维细胞含有KYN修饰的蛋白，并出现凋亡。半合子（hemTg）动物的晶状体与野生型小鼠的晶状体相似，尽管它们具有IDO活性；然而，这种活性大约是homTg动物的四倍。通过对homTg动物的观察，我们得出结论，IDO的过度表达通过在晶状体中形成KYN而导致细胞毒性效应。为了测试这种可能性，在本研究中，我们研究了IDO过度表达对培养的小鼠晶状体上皮细胞（mLECs）的影响。
材料和方法
动物与细胞培养
mLECs是从C57BL/6动物中分离出来的。HomTg小鼠是通过将hIDO插入转基因构建物生态具有由小鸡组成的嵌合启动子的minigene的RI位点δ1-晶体蛋白增强剂和αA-结晶蛋白启动子（Mailnakot等人，提交的手稿）。HemTg动物是通过用C57BL/6 Wt繁殖homTg小鼠而产生的。如前所述，从2至3个月龄Wt和Tg小鼠的囊上皮外植体中分离和培养mLEC。24细胞在Eagle的最低必需培养基（MEM；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）中的35 mm平板上生长，该培养基含有50μg/mL庆大霉素和20%胎牛血清。第4代至第6代的细胞用于整个研究。这些研究符合ARVO《关于在眼科和视力研究中使用动物的声明》，并得到凯斯西储大学机构动物护理和使用委员会的批准。
mLECs的治疗
对于KYN治疗，将Wt-mLECs断奶至含有50μM KYN和培养3天。在一些实验中，细胞在20μM 1-甲基-数字图书馆-色氨酸（MT）3天以阻断IDO活性。仅在无血清培养基中生长的细胞作为对照培养物。
IDO活性和KYN含量的测量
细胞被胰蛋白酶化，于200年在冰上均质μL PBS（pH 7.4），离心（14000克，4°C，15分钟）。将含有可溶性蛋白质的上清液添加到含有50 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）、20 mM抗坏血酸钠盐（Sigma-Aldrich）、200μg/mL牛胰腺过氧化氢酶（Sigma-Aldrich），10μM亚甲基蓝和400μM（M）我-色氨酸（Sigma-Aldrich）。反应在37°C下进行1小时，并通过添加40μL 30%（wt/vol）三氯乙酸。样品在65°C下培养15分钟，以将NFK转化为KYN，然后离心（14000克，4°C，15分钟）。对照培养物的制备方法相同，只是蛋白质提取物与20μ使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和标准品（0.2-5.0纳米d日,我-KYN[Sigma-Aldrich]）和醋酸铵（10 mM）作为溶剂A，10%甲醇在醋酸铵中作为溶剂B。溶剂B在梯度中的百分比为0%（10分钟）、0%至100%（10 min）和100%至0%（15分钟）。流速为0.8 mL/min。监测柱洗脱液在360 nm处的吸光度。酶活性表示为每分钟每毫克蛋白质形成的纳米KYN。蛋白质通过以BSA为标准的分析试剂盒进行定量（Bio-Rad，Hercules，CA）。
为了估计KYN的形成量，我们对细胞进行计数，然后将其均匀化为100个μL 100%乙醇。将匀浆在-20°C下保存1小时，然后离心（14000克，4°C，15分钟）。去除上清液并将其保持在-20°C，同时用80%乙醇（100μ五十） ●●●●。将匀浆在-20°C下保存1小时，然后像以前一样离心，将上清液合并并在浓缩器中干燥（Speed-Vac；Savant-Thermo Scientific；Waltham，MA）。样品和标准（0.2-0.5纳米d日,我-KYN）进行RP-HPLC分析。使用乙酸钠（20 mM）/乙酸缓冲液（pH 4.5）作为溶剂A，20%甲醇作为溶剂B。梯度中溶剂B的百分比为0%（30分钟）、0%至50%（2分钟）、50%至100%（8分钟）和100%至0%（6分钟）。流速为0.6 mL/min。结果表示为每百万个细胞的纳米数。使用真实的NFK和3OHKYN标准在相同的运行中分析NFK和3OHKYN。
为了估计培养基中的KYN含量，用乙醇提取冻干培养基（100 mg），浓缩（Speed-Vac；Savant Thermo Scientific），并按上述方法处理。为了估计培养基中的色氨酸，24μ培养基升到200μ如KYN估算所述，使用RP-HPLC分析样品和标准品。结果表示为每毫升介质中的纳米数。
ELISA法测定蛋白质中KYN修饰
按照前面所述进行估算。16简言之，在0.05M碳酸盐缓冲液（pH 9.7）中以1μg，用5%脱脂奶粉（NFDM）封闭。然后用小鼠抗KYN单克隆抗体（PBS中稀释1:1000）孵育这些微孔，然后用辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG孵育（PBST中1:15000；威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。酶活性通过添加100μL 3,3′，5,5′-四甲基联苯胺，50μL 2小时2SO公司4在450 nm处读取样品。
免疫细胞化学
实验前1天，将细胞培养在分室玻片中。在用PBS清洗两次细胞后，用4%多聚甲醛在-20°C的PBS中固定15分钟，然后用PBS洗涤两次，并用0.1%Triton X-100在-20°C的PBS里渗透5分钟。然后用PBS清洗玻片五次以去除洗涤剂后，在室温下用3%NFDM/1%BSA在PBS中封闭30分钟，用PBS洗涤两次5分钟。在室温下将玻片与0.1%BSA/PBS中的一级抗体孵育1小时，用PBS--αA类/αB-crystallin单抗（1:100稀释；Stressgen）、小鼠抗IDO单抗（1:40强度；Chemicon）和小鼠抗KYN-mAb（1:50稀释）用作主要抗体。将载玻片与二级抗体（抗鼠IgG）与德克萨斯红（1:200稀释；Invitrogen-Mollecular Probes，Eugene，OR）结合培养。二级抗体在0.1%的BSA/PBS中稀释，并在RT下应用于载玻片上1小时。用PBS洗涤两次5分钟后，将载玻片与卵磷脂（Invitrogen-Mollecular Probes）孵育30分钟，用PBS冲洗两次，然后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Invitrogin-Molleculer Probes]孵育持续1分钟。用永久安装的PBS冲洗载玻片两次，持续5分钟，并用荧光显微镜（BX60型；奥林巴斯，成功湖，纽约州）观察，然后用附带的数码相机（Spot RT Slider；Diagnostic Instruments，Inc.，使用Spot RT滑块软件3.5.5版连接到Macintosh计算机）获取图像。二级抗体对免疫反应的贡献通过不含一级抗体的染色来验证。
蛋白质表达评估
为了评估mLECs、水溶性蛋白质（10μg） 在15%的凝胶上进行SDS-PAGE，然后进行染色（生物安全染色溶液；Bio-Rad），并在水中脱色。
对于Western blot分析，对应于40μg蛋白在15%Tris-HCl凝胶上进行SDS-PAGE，电泳转移到硝化纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，并用IDO mAb（1:500稀释；Chemicon，Temecula，CA）和抗GAPDH抗体（1:300稀释；Millipore，Billerica，MA[b]）孵育。随后用山羊抗鼠HRP结合抗体（1:5000稀释；普罗米加，威斯康星州麦迪逊[b]）孵育膜，并用试剂盒（SuperSignal West Pico化学发光试剂盒；皮尔斯，伊利诺伊州罗克福德）进行开发。
细胞增殖评估
按照制造商的说明，通过直接向微孔中添加试剂（CellTiter 96水溶液；Promega）来进行细胞增殖。简言之，在试验前48小时，将mLECs（400个细胞/孔）分为三份分配到96个平板中并进行培养。试剂（20μL） 将其加入每个孔中，并在37°C的湿润5%CO中孵育4小时2大气。在490 nm处，用分光光度法测定细胞将四氮唑化合物[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基-甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四氮唑内盐；MTS]生物还原为有色甲氧嗪化合物。每个孔的活细胞数是根据用0到1000 Wt mLECs/孔获得的标准曲线计算的。
细胞凋亡的测定
按照制造商的说明，对12孔板中生长的细胞进行凋亡分析（原位细胞死亡检测试剂盒；印第安纳波利斯罗氏诊断公司）。用DAPI对细胞进行复染以鉴定细胞核。作为阴性对照，培养的细胞没有末端转移酶。
流式细胞术
通过胰蛋白酶化收集200万个细胞，并用PBS洗涤两次。在-20°C下，用2mL 90%甲醇在PBS中固定1小时后，将细胞洗涤两次，并在250℃下重新悬浮μL PBS.然后，5μ添加L RNase储备液（RNase-2 mg/mL、EDTA-10 mM和叠氮化钠-0.1%），并在37°C下培养30分钟。将细胞在4°C下冷却10分钟，并用250μ碘化丙酸（PI）储备溶液（PI，100μg/mL；Triton®声波风廓线仪X-100，0.1%；叠氮化钠，0.1%）在4°C下放置60分钟。然后通过流式细胞仪（EPICS-XL；加利福尼亚州富勒顿市贝克曼·库尔特）对其进行分析。每个样本至少评估了20000个事件。用流式细胞仪软件（EXPO32；Beckman Coulter）分析所有直方图，以确定G细胞中的细胞百分比1、S和G2/细胞周期的M个阶段。
KYN修饰蛋白质的鉴定
来自mLEC裂解物的蛋白质（200μg） 与小鼠抗KYN单克隆抗体孵育16(2μg） 在室温下培养1小时，然后添加蛋白质g-Sepharose（GE Healthcare，Piscataway，NJ），并在室温下摇晃培养1小时。为了检查是否发生非特异性结合，将蛋白质与不含抗体的蛋白G-Sepharose孵育。将样品混合物离心，用PBS将颗粒洗涤五次，每次洗涤5分钟。将凝胶颗粒溶解在SDS-PAGE样品缓冲液中，并在15%的凝胶上对蛋白质进行电泳。蛋白质被染色（Bio-Safe；Bio-Rad）并在水中去除。将蛋白质带从凝胶中切下，切碎，并用胰蛋白酶进行凝胶内消化。在线性离子阱质谱仪（LTQ；Thermo Fisher Scientific，结合Ettan MDLC系统；GE Healthcare）上分析所得肽。光谱由数据相关方法获得：在30%归一化碰撞能量下，对五种最丰富的前体离子进行一次全扫描（m/z为300-2000），然后进行MS/MS；重复时间，45秒；排除持续时间为180秒。通过搜索Swiss-Prot（sprot 50.3）小鼠数据库，将获得的数据提交给蛋白质搜索引擎（Mascot；Matrix Science，马萨诸塞州波士顿）(网址：http://www.expasy.org; 由瑞士日内瓦瑞士生物信息学研究所公开提供）。
统计
使用单向方差分析（ANOVA）对结果进行分析，然后进行Fisher保护最小显著差异检验（Statview 5.0软件；SAS Institute，Inc.，Cary，NC）。重要性级别设置为P（P）<0.05。
结果
mLECs的分离与表征
最初，我们试图从家畜中分离和培养mLECs。但是，尽管反复努力，分离的细胞未能增殖，并在分离后7至10天内死亡，这可能是因为高KYN的细胞毒性作用。然后我们成功地从hemTg动物中分离出mLECs。Wt和hemTg细胞对αA类/αB-结晶蛋白，确认它们是mLEC(). 只含有二级抗体的培养细胞没有显示出免疫反应性，证实了这种染色对α-晶体蛋白。
mLECs的特性。对分离的Wt和hemTg mLECs进行免疫染色αA类/αB-晶体蛋白(红色)在存在（测试）和不存在（控制）小鼠抗αA类/αB-晶体蛋白单克隆抗体。用DAPI对细胞进行复染(蓝色). 这些图像代表了三只老鼠的三种独立文化。
IDO表达式
通过估计mLEC蛋白与1 mM孵育过程中形成的KYN的量来测量mLECs中的IDO活性我-色氨酸。在hemTg动物的细胞中，KYN形成速率估计为0.15±0.02纳米/毫克蛋白质/分钟，而Wt动物的mLECs没有检测到活性。根据测量的KYN，我们估计增加了2.0%d日,我-色氨酸在1小时内转化为KYN。为了证实观察到的KYN形成是由于IDO活性所致，我们将细胞裂解物在65°C下培养15分钟，或与IDO抑制剂培养20分钟μM MT（37°C，60分钟）。两种处理都消除了酶的活性。使用抗IDO单克隆抗体和GAPDH作为负载控制的Western blot在hemTg mLECs中检测到IDO，但在Wt mLECs中未检测到(). 免疫细胞化学研究显示IDO遍布hemTg mLECs的细胞质(). Wt-mLECs无免疫反应。这些发现进一步证实了在hemTg动物的mLECs中IDO的过度表达。
IDO在Wt和hemTg mLECs中的表达。(A类)蛋白质印迹分析。用小鼠抗IDO单克隆抗体在hemTg-mLECs中检测到IDO，但在Wt-mLECs.中未检测到。GAPDH被用作负荷控制。(B类)IDO的免疫细胞化学。用单克隆抗体和德克萨斯红结合二级抗体在hemTg mLECs中检测到IDO。这些细胞也用阴茎倍肽染色以检测F-actin(绿色)并用DAPI复染(蓝色). 数据代表了三个独立实验的结果。
KYN和KYN修饰蛋白质
使用RP-HPLC，我们确定hemTg mLECs中的KYN浓度为0.11±0.01纳摩尔/106细胞。Wt-mLECs中未检测到KYN。正如ELISA检测到的那样，KYN的形成导致了细胞蛋白的修饰（分别为0.34±0.01 OD和0.02±0.01，hemTg和Wt）。当第一抗体与KYN修饰的RNase A预孵育时，不存在免疫反应性，证实ELISA中的免疫反应性是由KYN修饰的蛋白质引起的。
进行免疫细胞化学定位KYN修饰蛋白。KYN修饰蛋白遍布细胞质(). 当抗体与KYN修饰的核糖核酸酶A预孵育时，免疫反应显著降低。总之，这些数据表明hIDO的过度表达导致mLECs中蛋白质的高KYN和KYN修饰。
KYN修饰蛋白的免疫染色。使用单克隆抗体和德克萨斯红结合二级抗体检测KYN修饰蛋白。用指骨肽对细胞进行F-actin染色(绿色)和带DAPI的细胞核(蓝色). KYN修饰蛋白(红色)在KYN处理的mLECs中检测到，但在未处理的细胞中未检测到。数据代表了三个独立实验的结果。
培养基中KYN和色氨酸含量
在hemTg-mLEC培养基中检测到KYN（每毫升0.47±0.07纳米KYN），但在Wt-mLEC的培养基中没有KYN(). 为了确定来自hemTg小鼠的mLECs使用培养基中的色氨酸的比率是否高于来自Wt小鼠的细胞，我们用RP-HPLC测量了培养基中色氨酸。与Wt相比，hemTg-mLECs培养基中的色氨酸含量减少了0.5纳米/毫升（～2%）（分别为29±1.92和28.5±1.9纳米/毫升；Wt和hemTg；)这种差异与hemTg mLE中测得的细胞内外（培养基中）KYN相关。在100%融合时，在10mL培养基中每100-mm板的平均细胞数为2×106.由2×10形成的KYN量6hemTg mLECs为～4.8纳米。因此，即使在细胞生长汇合后，培养基中也含有足够的色氨酸。
KYN和我-培养基中的色氨酸。Wt和hemTg mLECs培养3天，收集无细胞培养基，冷冻干燥并处理以测量IDO活性。KYN和我-色氨酸通过HPLC定量。(A类)培养基中的KYN。在hemTg-mLEC培养基中检测到KYN，但在Wt-mLECs培养基中未检测到KY。(B类)我-培养基中的色氨酸。我-在hemTg-mLECs培养基中，色氨酸含量略有下降，而Wt-mLECs.培养基中色氨酸的含量没有下降。结果显示为三个独立实验的平均值±SD。
外源性KYN的作用
为了研究KYN的作用，将Wt-mLECs与10到1000个细胞进行培养μM KYN 3天。当细胞外KYN浓度较低时，细胞内KYN浓度增加到50μM（M）(). 然而，增加细胞外KYN浓度超过50μM没有进一步增加细胞内KYN。这些数据表明mLECs对KYN的摄取受到调节。与hemTg mLECs的发现类似，如用KYN孵育的Wt-mLECs的免疫染色显示，细胞质中存在KYN修饰，但核周区更多().
外源性KYN对mLECs细胞内KYN和KYN修饰的影响。(A类)将来自Wt的mLECs与0至1.0 mM KYN孵育3天。细胞被裂解，蛋白质沉淀，无蛋白上清液中的KYN被HPLC估计。结果是三个独立实验结果的平均值±SD。(B类)Wt mLECs与50μM KYN染色3天，并对KYN修饰的蛋白质进行免疫染色。KYN修饰蛋白(红色)在KYN处理的mLECs中检测到，但在未处理的细胞中未检测到。用指骨肽对细胞进行F-actin染色(绿色)和带DAPI的细胞核(蓝色). 图像是三个独立实验的代表。
1-甲基的影响d日,我-色氨酸（MT）处理
为了进一步证实来自hemTg的mLECs的作用是由于IDO介导的KYN形成，我们用IDO抑制剂MT孵育来自hemT的mLECμM MT完全抑制IDO。因此，未检测到KYN或重大KYN修改（数据未显示）。
细胞增殖、凋亡和细胞周期分析
采用MTS法测定细胞增殖率。培养48小时后，Wt-mLECs中活细胞的数量增加了两倍（从最初的～400个细胞/孔增加到～800个细胞/井），但hemTg-mLECs中的活细胞数量仅增加了1.3倍(P（P）< 0.0001;). 与hemTg-mLECs类似，KYN处理的Wt-mLECs-活细胞也仅增加了约1.3倍。有趣的是，MT治疗增强了hemTg-mLECs中的细胞增殖，活细胞数量增加了约2倍，与Wt-mLECs.类似。
细胞增殖和细胞周期分析。(A类)细胞增殖的MTT分析。存活的hemTg mLECs的数量低于Wt mLECs。用KYN处理Wt-mLECs可减少活细胞数，而MT处理hemTg-mLECs可增加活细胞数*P（P）< 0.0001. 所示结果为三个独立实验的平均值±标准差。(B类)流式细胞术分析。hemTg-mLECs和KYN处理的Wt-mLECsG数量增加2/M和4N G1细胞。通过MT处理，hemTg-mLECs中的细胞周期扰动被归一化。R3、G2/M+4N G公司1; R4，4N标准+G2/M。
为了确定凋亡是否导致活细胞减少，我们对培养细胞进行了3天的TUNEL染色。在hemTg和Wt-mLECs之间，TUNEL阳性细胞的数量没有显著差异（数据未显示）。KYN处理的Wt-mLECs也未发现明显的凋亡。此外，TUNEL阳性细胞的FACS分析（其中我们包括粘附细胞和漂浮细胞）表明，未经处理或KYN处理的细胞没有差异（数据未显示）。这些结果表明，hemTg mLECs中活细胞数量的减少并不是由于凋亡增强所致。
用流式细胞仪进行细胞周期分析。HemTg mLECs显示R3分数显著增加，提示G2/M、 或两个阶段(). G中hemTg mLECs的百分比2/M期较Wt-mLECs大约1.7倍。在这两种情况下，子G中的细胞数量1阶段并不显著，支持了细胞死亡增加不会导致细胞增殖减少的观点。与未经处理的Wt细胞相比，KYN处理的R3组Wt细胞的数量增加了两倍，但在亚G组中没有增加1阶段。这些结果表明，外源性KYN引起Wt-mLECs的变化，类似于hemTg-mLECs-的变化，并暗示细胞内KYN导致延迟进入G2/M、 或两个阶段。MT-处理的hemTg mLECs在G2/与未经此类处理的细胞相比。虽然延迟进入G区2和或M期是这些结果的最简单描述，也可能存在其他细胞周期效应（例如g1延迟）。我们注意到KYN处理的G细胞大小显著增加1单元格()表明该阶段的增长时间延长。综上所述，这些数据有力地支持了这样一种观点，即IDO介导的hemTg mLECs中KYN的形成会导致显著的细胞周期延迟，从而导致细胞增殖减少。
mLECs中的KYN修饰蛋白质。(A类)mLECs裂解物的SDS-PAGE。hemTg mLECs的细胞裂解产物显示Wt mLECs中不存在的高分子量蛋白质。(B类)免疫沉淀KYN修饰蛋白的SDS-PAGE。两种主要的KYN修饰蛋白(箭头)在hemTg mLECs裂解液中检测到。车道M：分子量标记；车道1：重量mLEC；车道2：hemTg mLEC。HC、IgG重链；LC，IgG轻链。
KYN修饰蛋白质
因为我们的证据没有指出色氨酸缺乏，我们假设观察到的细胞周期延迟可能是由于关键蛋白的KYN修饰。hemTg和Wt-mLECs细胞裂解物的SDS-PAGE如所示hemTg mLEC裂解产物中有一些在Wt中不存在的高分子量蛋白质，这些可能是KYN介导的交联蛋白质。这些细胞裂解物蛋白的免疫沉淀显示，hemTg样品中有两条不同的蛋白带，而Wt裂解物中没有这两条带(). 不含一级抗体的hemTg裂解物孵育或不含裂解物的孵育均未显示细胞蛋白的条带，但抗体重链和轻链对应的条带除外。用胰蛋白酶消化hemTg中的两种蛋白质，并用LC/MS进行分析。质谱数据如所示。这两种蛋白质被鉴定为肌球蛋白II和α/γ-肌动蛋白。
表1
| 蛋白质ID | 蛋白质名称 | 序列质量 | 覆盖率% | 吉祥物得分 | 独特肽 |
|---|
| 波段1 |
| MYH9_母公司({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q8VDD5”，“term_id”：“205371802”}}Q8VDD5型) | 肌球蛋白-9（肌球蛋白重链，非肌肉IIa） | 226,086 | 63 | 11,549 | 150 |
| MYH10_家({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q61879”，“term_id”：“71152969”}}Q61879问题) | 肌球蛋白-10（肌球蛋白重链，非肌肉IIb） | 228,855 | 33 | 2,025 | 59 |
| FLNA_MOUSE公司({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“Q8BTM8”，“term_id”：“341941149”}}问题8BTM8) | 丝素-A(α-丝氨酸） | 280887个 | 28 | 1,916 | 61 |
| FLNB_MOUSE公司(｛“type”：“entrez protein”，“attrs”：｛“text”：“Q80X90”，“term_id”：“341941096”｝Q80X90型) | 纤维蛋白-B(β-丝氨酸） | 277,579 | 5 | 192 | 11 |
| 波段2 |
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| 动作鼠标({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P68033”，“术语id”：“54036698”}}第68033页) | 肌动蛋白，α心脏的 | 41,992 | 64 | 7,593 | 22 |
| HSP47_模块({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P19324”，“term_id”：“341942124”}}第19324页) | 47-kDa热休克蛋白前体 | 46,560 | 41 | 608 | 15 |
| VIME_MOUSE（车辆）({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P20152”，“term_id”：“138536”}}第20152页) | 波形蛋白 | 53,524 | 34 | 341 | 19 |
讨论
尽管研究表明IDO具有抗增殖作用，5,6,9,10所涉及的过程没有得到很好的定义。在人类晶状体中，IDO的下游产品（即KYN）可以用作紫外线过滤器。然而，最近关于晶状体蛋白KYN修饰的研究指出IDO在白内障发生中的作用。15,16,25我们之前对晶状体中过度表达hIDO的转基因小鼠进行的研究（提交的手稿）表明，KYN的存在和KYN蛋白的修饰会损害晶状体：IDO过度表达中KYN形成的增强会导致纤维细胞凋亡、纤维细胞分化不良和白内障的发生。然而，由于该研究中的实验设计限制，我们只能证明KYNs对纤维细胞的有害影响，而对上皮细胞没有影响。因此，本研究旨在探讨KYN对上皮细胞的影响。本研究的主要发现是：（1）mLECs中IDO的过度表达导致细胞内KYN和KYN修饰蛋白的积累2/（3）通过使用选择性抑制剂抑制IDO，可以防止IDO过度表达对细胞周期的影响，以及（4）肌球蛋白II和α/γ-肌动蛋白以KYN修饰蛋白的形式存在于hemTg mLECs中。
IDO过度表达细胞中KYN的形成并不意外。因此，KYN可能直接影响细胞周期。我们排除了KYN途径的其他下游代谢物NFK和3OKKYN的影响，因为这些在hemTg mLECs中未检测到。细胞溶质和核成分中的KYN形成和KYN修饰证实了KYN直接影响细胞周期的可能性。有趣的是，细胞周期延迟与凋亡无关，IDO的表达可以减少T细胞的增殖而不引起凋亡。26与纤维细胞不同，KYN可能不会诱导上皮细胞凋亡。事实证明，在KYN显著高于hemTg的homTg动物的晶状体中，上皮细胞凋亡并不明显（Mailankot等人，提交的手稿）。这些观察结果表明，上皮细胞可能具有强大的防御机制来处理过量的KYN。
除了抵抗内部形成的KYN外，mLECs还可能抵抗外源性KYN。我们观察到，向培养基中添加高达1 mM KYN不会导致细胞死亡。作为对外部KYN的反应，细胞内KYN被调节，KYN浓度从50μM至1mM没有产生细胞内KYN的相应增加。KYN浓度达到约0.12纳米/10后保持不变6细胞。这表明KYN进入细胞受到调控。因此，晶状体上皮细胞可能受到外部和内部KYN的保护，尽管这是以细胞周期扰动为代价的，而细胞周期扰动会导致增殖减少，最终导致纤维细胞分化不当。
色氨酸MT的甲基衍生物是IDO的一种药理竞争性抑制剂，已用于各种研究，以抑制IDO对色氨酸的消耗。9,27-30MT对细胞周期阻滞的抑制证实了在G2hemTg mLECs中的M或两者都是由于IDO活性增强。IDO活性增加导致细胞内KYN形成增强意味着我-色氨酸是一种必需氨基酸，是IDO的底物，不是限制因素。为了补偿细胞内色氨酸的消耗，细胞可能会增加色氨酸摄取。我们的数据表明我-来自hemTg的mLECs培养物中的色氨酸浓度降低支持这种可能性。由于培养基中含有足够的色氨酸，因此不太可能我-IDO活性增加导致色氨酸耗竭，导致G细胞周期延迟或停滞1在其他实验中观察到的hemTg mLECs。
正常的晶状体发育和生长依赖于晶状体上皮细胞增殖和分化的严格时空调控。晶状体上皮细胞的增殖潜能随着年龄的增长而降低。31,32我们观察到mLECs中KYN修饰蛋白的增加。KYN修饰的蛋白质可能通过泛素蛋白酶体途径从细胞中去除。如前所述，如果在年龄相关性白内障形成过程中该系统的功能受损，33KYN修饰的蛋白质可能积聚。如果修饰蛋白直接或间接参与细胞周期调控，这种积累将导致晶状体上皮细胞增殖减少。晶状体上皮细胞增殖能力随年龄的增长而下降的观察34,35支持这个想法。
虽然KYN对G的影响2/M阻滞是明显的，但不太明显的是KYN或KYN修饰如何干扰细胞周期。细胞周期由细胞周期素依赖性激酶调节。36晶状体上皮细胞分化过程中细胞周期素依赖性激酶抑制剂的调节表明，这些蛋白控制着细胞周期的退出。37KYN是通过直接化学修饰还是通过下游信号分子的修饰间接影响这些细胞周期素依赖性激酶及其抑制剂，尚待研究。
我们的发现α/γ-肌动蛋白和肌球蛋白II是hemTg mLEC裂解物中的KYN修饰蛋白，为细胞周期和增殖损伤提供了分子基础。这两种蛋白的修饰可能会对细胞内的胞质分裂产生不利影响，因为这一过程需要肌动蛋白和肌球蛋白（连同其他结构和调节蛋白）在赤道皮层形成收缩环，并诱导犁沟，最终导致细胞分裂为两个子细胞。38,39因此，这些蛋白的KYN修饰可能抑制了胞质分裂，从而抑制了细胞增殖。
对细胞周期和细胞增殖的影响是否有助于人类白内障的形成尚不确定，但间接证据支持这一观点。在TGF中-β-诱导小鼠前囊下白内障，LEC增殖被解除调控。40晶状体和房水中钙水平升高，这被认为是导致晶状体混浊的原因，导致人类LEC增殖减少41; H（H）2O（运行）2，在器官培养的晶状体中引起白内障，也会减少晶状体上皮细胞的增殖。这些观察强烈表明，上皮细胞增殖减少与白内障的形成有关。如果KYN蛋白修饰诱导了类似的机制，则可能会导致人类白内障的形成。
人类晶状体的IDO活性相对较低。一项研究报告称，在26岁至80岁的人类晶状体中，IDO活性相当于每小时每个晶状体形成0.85±0.49纳米KYN。11如果假设成人晶状体的平均湿重为～200 mg，蛋白质含量为60%，则报告的IDO活性将转化为每分钟每毫克蛋白质形成的约0.12至0.2皮摩尔的KYN。我们开发的hemTg动物的IDO活性相当于0.15±0.02纳米/分钟/毫克晶状体中形成的KYN蛋白。因此，hemTg动物晶状体中的IDO活性比人类晶状体高约750至1200倍。即使在老年性白内障患者的晶状体中，IDO的活性也不会如此高。然而，在干扰素-γ是IDO表达的诱导剂，在前眼升高（例如葡萄膜炎42)，IDO活性增加，导致KYN修饰和G2/晶状体上皮细胞M阻滞。有人建议干扰素-γ晶状体上皮细胞的产生可能与白内障的发生有关。43确定干扰素的效果将很有意义-γLEC中的IDO活性。
总之，我们的研究表明，IDO活性增强导致KYN介导的晶状体上皮细胞的细胞周期阻滞。我们相信，这种抗增殖作用可能导致我们之前观察到的IDO过表达纯合转基因动物白内障的形成。因此，在人类晶状体中，KYN的形成和KYN修饰可能在年龄相关性白内障的形成中发挥作用。
致谢
由国家眼科研究所（NEI）拨款R01EY-016219和R01EY-09912、医学博士Carl F.Asseff教授（RHN）、NEI拨款P30EY-11373（CWRU视觉科学研究中心）、预防失明研究、俄亥俄狮眼研究基金会和国家癌症研究所拨款R01CA-073413（JWJ）支持和P30CA-043703（凯斯综合癌症中心核心设施）。
脚注
披露：M.Mailanko先生，无；D.史密斯，无；S.豪厄尔，无；B.王，无；J.W.雅各布伯格，无；T.斯特凡，无；R.H.Nagaraj，无
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