糖尿病。2009年1月；58(1): 30–38.
极度肥胖女性骨骼肌中肌抑制素的分泌和表达增加
,1 ,2 ,1 ,2和2
达斯汀·希特尔
1加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市卡尔加里大学罗杰·杰克逊健康与健康中心运动学院人体性能实验室
杰森·伯格伦
2北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学人类绩效实验室和运动科学系
简·希勒
1加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市卡尔加里大学罗杰·杰克逊健康与健康中心运动学院人体性能实验室
克里斯汀·博伊尔
2北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学人类绩效实验室和运动科学系
约瑟夫·胡马尔（Joseph A.Houmard）
2北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学人类绩效实验室和运动科学系
1加拿大阿尔伯塔省卡尔加里市卡尔加里大学罗杰·杰克逊健康与健康中心运动学院人体性能实验室
2北卡罗来纳州格林维尔市东卡罗来纳大学人类绩效实验室和运动科学系
收稿日期：2008年7月14日；2008年9月19日接受。
摘要
目标-肥胖与内分泌异常有关，内分泌异常可预测胰岛素抵抗发展为2型糖尿病。由于骨骼肌已被证明能分泌可作为生物标记物的蛋白质，因此我们对极度肥胖（BMI 48.8±14.8 kg/m）的肌肉细胞的分泌蛋白质谱进行了表征2; 相对于瘦健康受试者（BMI 25.7±3.2 kg/m）的稳态模型评估[HOMA]3.6±1.02; HOMA 0.8±0.2）。
研究设计和方法-我们假设骨骼肌会分泌预测肥胖严重程度的蛋白质。为了验证这一假设，我们采用了一种“自下而上”的实验设计，通过培养基中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）和液相色谱/质谱/质谱（LC-MS/MS）来识别和量化来自极度肥胖和健康非肥胖女性的培养肌管分泌的蛋白质。
结果-使用SILAC，我们发现极度肥胖的人类肌管分泌的肌抑制素增加了2.9倍。免疫印迹法验证了肌抑制素分泌增加和生物活性增加（3.16±0.18，P（P）<0.01）和使用条件生长培养基的成肌细胞增殖试验。肌肉生长抑制素随后在骨骼肌中增加（23%，P（P）<0.05）和血浆（35%，P（P）<0.05）并相互关联(第页2= 0.6,P（P）<0.05）。
结论-肌肉生长抑制素是一种有效的肌肉质量抗失血调节剂，也可能在能量代谢中发挥作用。这些发现表明，肥胖和胰岛素抵抗患者骨骼肌中肌生成抑制素表达增加导致循环肌生成抑素升高。这可能导致骨骼肌系统代谢恶化，导致胰岛素抵抗发展为2型糖尿病。
肥胖和2型糖尿病与内分泌异常有关，这些内分泌异常是由外周胰岛素抵抗引起的或是在外周胰岛素耐药发生之前引起的(1). 其中包括循环蛋白和肽的变化，这些变化会导致内皮功能障碍、低度炎症和血栓前状态，所有这些都会增加心血管风险(2–4). 分泌蛋白或“分泌体”是一类重要的生物活性分子，释放到循环中，促进器官系统之间的相互交流。由于分泌蛋白也参与心血管疾病和癌症的进展，因此挖掘分泌体寻找新的生物标记物具有重要意义(5). 尽管内分泌器官专门将蛋白质分泌到循环中，但越来越多的证据表明，脂肪组织和骨骼肌组成性或间歇性地分泌生物活性蛋白质(6,7). 在这项研究中，我们假设极度肥胖和胰岛素抵抗女性的骨骼肌会分泌蛋白质进入循环，这些蛋白质作为肥胖相关并发症的预后或诊断生物标志物。然而，从上到下鉴定血液中蛋白质生物标志物的方法受到血清蛋白丰富背景的阻碍，其中感兴趣的分泌蛋白可能被稀释几个数量级(5,8). 为了克服这些局限性，我们采用了一种自下而上的方法，利用原始人类肌肉细胞和培养氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）来表征骨骼肌分泌体，这允许识别肌肉特异性蛋白质和量化样品之间的蛋白质(5,8).
原代人类肌肉细胞被认为是研究肥胖和2型糖尿病代谢紊乱的有效模型，因为体内明显的扰动，如抑制脂质氧化和异常基因表达，保留在培养的肌管中，这表明其固有特征(9–12). 在此，我们描述了我们的初步发现，肌生长抑制素的表达和分泌在极度肥胖的人类受试者的细胞培养和骨骼肌中均增加。
研究设计和方法
为了实现本研究的目标，我们开发了一种自下而上的工作流程，用于识别肥胖和胰岛素抵抗的人类骨骼肌分泌的蛋白质生物标记物。在第一组实验中，我们使用SILAC从原始人类肌肉细胞的纯培养物中鉴定了肌抑制素的差异分泌。使用这种方法的优点是，它可以在条件细胞培养基中浓缩和鉴定低丰度的肌肉源性蛋白质，并对样品之间的蛋白质丰度进行量化。在第二组实验中，我们证实了极度肥胖人类肌管条件培养基中肌抑制素的分泌和生物活性增加，以及极度肥胖人类受试者骨骼肌和血浆中肌抑素的丰度增加。这个实验流程使我们能够在器官和系统水平上成功验证我们的细胞发现。
所研究的四个受试人群（瘦肉、肥胖和极度肥胖）的临床特征如下所示研究参与者根据BMI和美国国立卫生研究院规定的超重和肥胖分类进行分类。正常体重和极度肥胖受试者的BMI标准≤24.9且≥40 kg/m2分别是。所有受试者都是久坐不动且不定期锻炼。如前所述，隔夜禁食12小时后从股外侧肌获取骨骼肌样本(13,14). 除了糖尿病患者外，没有受试者服用任何已知会影响碳水化合物或脂质代谢的药物。实验方案得到了东卡罗来纳大学人类研究政策和审查委员会的批准，并获得了所有受试者的书面知情同意。使用葡萄糖分析仪（YSI 2300 STAT Plus；YSI，黄泉，俄亥俄州）通过氧化反应测量血糖，并通过免疫分析（Access immunoassay System；Beckman Coulter，Fullerton，CA）测量血浆胰岛素。根据空腹血糖和胰岛素浓度计算胰岛素抵抗和β细胞功能的稳态模型评估（HOMA）(15). 使用HOMA评估胰岛素抵抗已被充分记录为基础胰岛素抵抗的可靠评估，并与评估胰岛素敏感性的正常血糖-高胰岛素钳夹密切相关(15).
表1
| 精益 | 肥胖的 | 极度肥胖 |
|---|
| n个 | 6 | 5 | 9 |
| 年龄（岁） | 41.2 ± 5.0 | 46.8 ± 4.2 | 45.8 ± 3.9 |
| 体重指数（kg/m2) | 25.7 ± 1.3 | 32.3 ± 1.1* | 48.9 ± 4.9* |
| 葡萄糖（mg/dl） | 97.0 ± 6.0 | 91.1 ± 2.9 | 97.7 ± 4.4 |
| 胰岛素（μU/ml） | 3.3 ± 0.9 | 7.2 ± 2.7 | 14.6±2.7* |
| HOMA公司 | 0.8±0.2 | 1.3 ± 0.6 | 3.6 ± 1.0* |
稳定同位素标记和分泌蛋白的收集。
在稳定同位素标记培养基中培养细胞的优点是，所有肌管衍生的蛋白质都被均匀地标记为13C类6-三次传代后标记Lys，以便区分分泌蛋白和血清污染物(5). 来自三名瘦肉和极度肥胖（基于BMI）受试者的原始人类肌肉细胞在含有（肥胖样本）或不含（瘦肉样本）的培养基中生长13收集C-Lys，然后对分泌蛋白进行分析。如前所述，从骨骼肌活检材料中采集和培养卫星细胞(10,12). 为了进行定量蛋白质组分析的代谢标记，细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中培养，DMEM是不含赖氨酸的定制培养基（Invitrogen，Carlsbad，CA）。标签介质补充了13C类6-Lys（Invitrogen）用于来自极度肥胖捐赠者的细胞，而未标记的培养基补充了常规培养基我-用赖氨酸（Lys）检测瘦肉细胞、10%透析胎牛血清（FBS）和50μg/ml庆大霉素/两性霉素B。细胞在I型胶原涂层的75-cm中传代培养2通道3的烧瓶，之前已经证明可以产生完全标记的细胞(8). 使用含有2%马血清的标记和未标记分化培养基，每2天更换一次培养基，共9天，在90%的汇合处开始分化为肌管(16). 各组间肌管分化程度无明显差异。为了收集分泌蛋白，用PBS缓冲液清洗细胞五次，以去除多余的马血清蛋白，然后在无血清标记和无标记培养基中培养18小时(8). 收集分泌的蛋白质18小时，以减少细胞溶解的可能性，细胞溶解的蛋白质会释放到无血清培养基中(5,17). 将每个标记和未标记培养物的条件培养基汇集在50 ml试管中（BD Biosciences Falcon，San Jose，CA），在300℃离心克然后在1000克在最终旋转100000圈之前，通过0.22微米尼龙过滤器（密立波，贝德福德，马萨诸塞州）进行过滤克去除任何细胞碎片。条件培养基在液氮中快速冷冻，在真空下浓缩100次，并使用P6 Bio-Spin柱（Bio-Rad，Hercules，CA）对10 mmol/l Tris-HCl（pH 7）进行脱盐；按照制造商的说明，使用Bio-Read蛋白质分析试剂测定蛋白质含量。然后将分泌的蛋白质组分合并并用SDS-PAGE分离，用考马斯染色，切成六块，对应于不同的分子量范围()，然后用胰蛋白酶消化（普罗米加，麦迪逊，威斯康星州），如前所述(13).
LC-MS/MS鉴定和量化13C类6-赖氨酸和未标记的分泌蛋白来自瘦肉和极度肥胖的人类原代肌管。A类：来自18小时条件化无血清培养基的蛋白质，来自未标记（瘦肉）和13C类6-Lys（极度肥胖）肌管按1:1合并，并通过4–16%SDS-PAGE分离。B类基本峰色谱显示从凝胶切片中提取的所有肽的总峰强度和保留时间在37和15kDa之间。C类：肽在31.8分钟洗脱为双肽米/z706.4和709.4，对应于未标记的和13C类6-来自人类GAPDH的Lys肽。通过MS/MS分析获得光谱顶部显示的肽序列。标记的和未标记的肽以1:1的比例分开3 Da，并且与1一致13C类6-双电荷肽中的赖氨酸残基。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943以获得此图形的高质量数字表示。）
LC-MS/MS、蛋白质鉴定和定量。
在加拿大卡尔加里大学（Calgary，AB，Canada）阿尔伯塔省南部质谱中心，通过LC-MS/MS对产生的肽溶液进行分析。多肽的色谱分离采用C18分析柱，使用安捷伦1100纳米LC系统（安捷伦科技，加州圣克拉拉）。将肽加载到浓缩液中，并用0.2%甲酸和10%水在乙腈中洗脱50分钟。将分析柱在线连接到配备纳米喷雾离子源的Qstar XL混合四极飞行时间（TOF）质谱仪（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。TOF MS实验在正离子模式下在米/z范围为400–1500。使用标准数据相关配置进行自动串联质谱分析，其中MS扫描中的三种最强肽（2+或3+电荷状态）被自动选择用于测序。利用马斯科特搜索算法，使用马斯科特蒸馏器（Matrix Science，London）对人类NCBInr和SwissProt数据库进行蛋白质搜索。前体肽离子的质量容限设置为200 ppm，MS/MS片段离子的质量容限设置为0.5 Da。根据制造商的说明手动进行定量（Invitrogen）。简而言之，我们使用每次LC-MS/MS运行生成的吉祥物肽汇总表和Analyst QS 1.1 Software（Applied Biosystems）分析LC-MS/MS分析生成的原始WIFF文件中的选定离子色谱数据。每个肽的保留时间和蛋白质鉴定由年每个MS/MS的离子和所选肽对的相对丰度(和)如前所述计算(8). 搜索参数允许可变修饰，包括半胱氨酸的酰胺甲基化、蛋氨酸的氧化和13C类6-里斯本。分泌蛋白必须至少有一个13C类6-Lys肽具有较高的可信度，必须通过手动检查进行验证，以获得连续系列的年离子(8).
分泌型肌抑制素蛋白的LC-MS/MS鉴定和定量。A类：顶部光谱显示在米/z571.8和574.8对应于未标记和13C类6-人肌抑制素Lys肽。标记的和未标记的肽以3:1的比例分开3 Da，并且与1一致13C类6-双电荷肽中的赖氨酸残基。光谱顶部显示的肽序列是通过对片段肽的MS/MS分析获得的。B类：以粗体和下划线显示的是在人类肌生成抑制素一级序列中识别的其他肌生成抑素肽的相对位置。
条件培养基、骨骼肌和血浆的Western blot分析。
使用Western免疫印迹验证条件培养基、肌肉细胞、整个骨骼肌和血浆中的肌肉抑制素蛋白水平。为了收集分泌蛋白以量化肌抑制素水平，用PBS清洗细胞（9天的肌管）五次，并如前所述，用无血清Optimem（Invitrogen）再培养24小时(18,19). Optimem培养基含有生长因子，可通过延长培养时间促进细胞存活，并专门设计用于表征分泌蛋白。将条件培养基倒入50 ml试管（BD Biosciences Falcon）中，在300℃下离心克然后在1000克在最终旋转10万圈之前，通过0.22微米尼龙过滤器（密理博）过滤克去除任何剩余的细胞碎片。然后将经过处理的培养基在液氮中快速冷冻并在真空下冻干，然后用10%三氯乙酸沉淀，然后用−20°C丙酮多次洗涤，如前所述(18). 总的来说，每个样品收集50μg蛋白质，用SDS-PAGE分离，并转移到Immobilon-P PVDF膜（Millipore）。
为了对肌肉中肌抑制素水平进行Western blot分析，使用洋地黄缓冲液（10 mmol/l PIPES、0.015%洋地黄、300 mmol/l蔗糖、100 mmol/lNaCl、3 mmol/lMgCl）提取氮粉末化的骨骼肌或肌管2，5 mmol/l EDTA和1 mmol/l蛋白酶抑制剂[苯甲基磺酰氟]，pH 6.8），在4°C温和转化40分钟(20). 然后在8000下离心克持续20分钟以清除不溶性细胞碎片。按照制造商的说明，使用Bio-Rad蛋白质分析染料试剂测定蛋白质浓度（加州Hercules市Bio-Rad）。20微克细胞蛋白(19,21)然后通过SDS-PAGE分离并转移到Immobilon-P PVDF膜（Millipore）。用Ponceau S对膜进行染色，以确认负载和传输效率相等。
为了分析用于Western blot分析的血浆蛋白，将2μl血浆在PBS中按1:10稀释，并将100μg蛋白质加载到预制的4–12%梯度SDS-PAGE凝胶（Invitrogen）上，并转移到Immobilon-P PVDF膜（Millipore）上。本研究中使用的主要抗体是针对大肠杆菌山羊体内来源的重组全鼠肌抑制素。我们之所以选择这种特异性抗体，是因为它能够可靠地检测人类肌抑制素，并在生物检测中中和肌抑制酶活性。用于检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的主要抗体是一种小鼠单克隆抗体（马萨诸塞州剑桥Abcam）。将膜在一级抗体中以1/1000的比例在含吐温的Tris缓冲盐水中在4°C下孵育20 h。清洗后，使用辣根过氧化物酶结合的抗羊二级抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）以1/5000的稀释度和SuperSignal West Pico化学发光底物（伊利诺伊州罗克福德皮尔斯）检测一级抗体。使用ChemiGenius生物成像系统（Syngene，Frederick，MD）采集图像并进行量化。
成肌细胞增殖试验。
为了评估条件培养基中分泌的肌生成抑制素蛋白的生物活性，我们使用了先前描述的成肌细胞增殖试验，该试验基于肌生成抑素抑制成肌细胞生长的能力1-至细胞周期的S期(18,22). 简单地说，将细胞以1000个细胞/孔的速度接种在96周的培养板（纽约州罗切斯特市纳格纳）中，培养基为混合的48小时条件生长培养基（DMEM加10%FBS），培养基来自三名瘦削和极度肥胖的受试者的人类肌肉细胞。48小时已被证明是足够的时间在条件培养基中积累分泌的肌抑制素(18,22). 作为对照，细胞也在预培养20μg/ml抗肌生长抑制素抗体的条件培养基中或在无条件生长培养基中增殖。制造商（研发系统）已经证明，这种浓度的抗肌生成抑制素抗体可以中和高达30 ng/ml的活性肌生成抑素蛋白。在4天的时间内，每天对增殖的成肌细胞进行胰蛋白酶消化，并使用血细胞仪（宾夕法尼亚州霍瑟姆豪瑟科学公司）测定细胞密度（四组）。
统计分析。
为了比较肌肉和血浆中肌抑制素的丰度，我们使用了一个独立的t吨显著性水平设置为的双尾分布检验P（P）< 0.05. 为了比较条件培养基、细胞和成肌细胞增殖试验中的肌抑制素蛋白丰度，我们使用Kruskal-Wallis单向方差分析法，使用SigmaStat（Systat，San Jose，CA）和Tukey的事后检验，对P（P）<0.05或0.01表示显著性。使用最小二乘法（SigmaPlot）进行线性回归分析P（P）<0.05表示得出存在真实关联的结论时出错的概率。
结果
分泌蛋白的分析。
在18小时条件化无血清培养基中从原代培养的人类肌管中鉴定出的42种蛋白质列于其中，28个先前已经被证明是分泌的。其余14种是代谢酶、细胞骨架或收缩蛋白。在许多蛋白质分泌的调查中，都描述了条件培养基中细胞内蛋白质的存在(8,17,23). 先前在小鼠肌管分化的研究中已经描述了人类初级肌管分泌的几种蛋白质(17)和人体脂肪(23)和视网膜色素上皮细胞(8). 事实上，这三种蛋白质中的两种，I型胶原蛋白和骨结合蛋白，都是由这三种蛋白分泌的()这表明它们是许多细胞类型的重要分泌成分。还值得注意的是，28种分泌蛋白中的13种预测用于人类骨骼肌分泌体的电子建模(24).
表2
| 瑞士保护银行 | 肽类 | 秘密的 | 证据 |
|---|
| 免疫应答/补体 | | | | |
| 补体成分4B | P0C0L5（故障诊断码） | 7 | 是的 | 8,24 |
| 补体因子H相关5 | Q9BXR6型 | 2 | 是的 | 8 |
| 生长因子/趋化因子 | | | | |
| 表皮生长因子 | P01133号 | 2 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 成纤维细胞生长因子17 | O60258号机组 | 2 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 胰岛素样生长因子1 | 问题59GC5 | 1 | 是的 | 24 |
| 干扰素α2/β1 | 问题14608 | 1 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 淋巴凝集素 | 第47992页 | 1 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 单核细胞趋化蛋白4，MCP-4 | Q99616问题 | 2 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 肌肉抑制素 | 第8季度52 | 三 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 细胞粘附/细胞外基质 | | | | |
| 胶原蛋白，III型，α1 | P02461号 | 2 | 是的 | 17 |
| 胶原蛋白，IV型，α2 | P08572号 | 4 | 是的 | 17,24 |
| 胶原蛋白，IV型，α3 | Q01955号 | 2 | 是的 | 17,24 |
| 胶原蛋白，I型，α1 | P02452号 | 5 | 是的 | 8,17,23,24 |
| 细胞外基质蛋白2 | O94769号 | 1 | 是的 | 23,24 |
| 层粘连蛋白，α2 | 第24043页 | 4 | 是的 | 24 |
| 层粘连蛋白，α3 | 问题16787 | 三 | 是的 | 24 |
| Tenascin C公司 | 第24821页 | 5 | 是的 | 24 |
| Tenascin XB公司 | Q5JNX3型 | 2 | 是的 | 24 |
| Aggrecan核心蛋白 | 第16112页 | 2 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| S100钙结合蛋白A6/钙周期素 | P06703号 | 三 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 骨结合蛋白/SPARC | P09486号 | 18 | 是的 | 17,23,24 |
| 波形蛋白 | P08670号 | 18 | 是的 | 17 |
| 半乳糖凝集素-1 | P09382号 | 6 | 是的 | 17 |
| α-结晶蛋白 | P02511号 | 2 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 蛋白酶和蛋白酶抑制剂 | | | | |
| 血浆蛋白酶（C1）抑制剂前体 | P05155号 | 2 | 是的 | 23 |
| 金属蛋白酶抑制剂1前体 | P01033号 | 12 | 是的 | 8,24 |
| 金属蛋白酶抑制剂2前体 | 第16035页 | 12 | 是的 | 24 |
| 骨形态发生蛋白1 | 第13497页 | 2 | 是的 | 瑞士-普罗特 |
| 泛素 | 第62988页 | 4 | 是的 | 17 |
| 细胞内、可收缩和脱落的蛋白质 | | | | |
| 强力霉素 | 问题5TBT2 | 12 | 不 | |
| 胎儿肌球蛋白重链 | Q9Y623号 | 4 | 不 | |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | P04406号 | 三 | 是的 | 25 |
| 整合素，α6 | 第23229页 | 2 | 不 | |
| 肌球蛋白结合蛋白C，快速型 | 问题14324 | 三 | 不 | |
| 磷酸果糖激酶，肌肉 | P08237号 | 5 | 不 | |
| 提坦 | Q8WZ42型 | 32 | 不 | |
| 三磷酸异构酶1 | 第60174页 | 6 | 不 | |
| 文丘林 | 第18206页 | 6 | 不 | |
| 原肌球蛋白β | P07951号 | 15 | 不 | |
| 富含SH3结合谷氨酸的蛋白质 | Q5T122问题 | 2 | 不 | |
| Desmin公司 | 问题549R9 | 三 | 不 | |
| 肌球蛋白轻链1 | 第14649页 | 三 | 不 | |
| β-外壳蛋白 | 第53618页 | 2 | 不 | |
| Stathmin公司 | 第16949页 | 4 | 不 | |
| 三磷酸异构酶 | 第60174页 | 15 | 不 | |
| 泛素 | 第62988页 | 4 | 不 | |
| 磷酸甘油酸变位酶1 | 第18669页 | 4 | 不 | |
| α-结晶蛋白 | P02511号 | 2 | 不 | |
| 内布林 | 面积x11499 | 6 | 不 | |
| 肌红蛋白 | Q8WVH6型 | 三 | 不 | |
在，我们展示了具有代表性的LC-MS色谱仪()以及从人GAPDH中鉴定一个肽双链()对于未标记和标记的肽对米/z分别为706.4和709.4。这些双电荷离子之间的质量差为3 Da，表明肽应包含一个赖氨酸残基。根据单同位素强度的比值，GAPDH以～1:1的比例从瘦肉型和极度肥胖型肌管分泌。GAPDH也被证明分泌到许多细胞系的生长介质中(25). 因此，选择GAPDH作为负荷对照，用于随后的肌肉抑制素分泌的Western免疫印迹验证。在，我们展示了肌抑制素蛋白特有肽的质谱图，未标记和标记肽对的峰位于米/z分别为571.8和574.8。这些双电荷离子之间的质量差为3 Da，表明肽应包含一个赖氨酸残基。肽的序列通过肽的MS/MS分析和年和b如上所述的离子(8). 根据肽强度的比值，从极度肥胖和极度瘦的肌管中计算出肌抑制素的分泌比率为3:1。从肌抑制素中鉴定的其他标记肽()似乎没有未标记的伴侣肽，这表明来自极度肥胖细胞的条件培养基中的丰度显著较高。
肌抑制素分泌的Western blot验证。
因为肌生长抑制素被鉴定为条件培养基中差异分泌最强烈的蛋白质()，它成为验证的主要焦点。如所示26-kDa成熟型肌生长抑制素从极度肥胖者分泌到条件培养液中有显著差异（3.16±0.18，P（P）<0.01）与健康非肥胖受试者的肌管相关。该相对差近似于使用SILAC计算的3:1比率(). 与其他研究不同(18)，我们没有检测到肌抑制素52-kDa前体形式的分泌。这可能是因为我们选择了抗体，或者我们采取了特殊的措施来尽量减少细胞裂解。最后，使用SILAC检测人类GAPDH蛋白，其分泌比例为～1:1()并被选为分泌蛋白的负荷控制。如所示与肌抑制素丰度的差异相比，在条件培养基中，从瘦肉、肥胖和极度肥胖细胞中检测到类似数量的GAPDH。
极度肥胖的原发性人体肌管会增加肌肉抑制素的分泌。用15%的SDS-PAGE溶解24小时条件化无血清培养基中等量的蛋白质。肌肉抑制素(A类)和GAPDH(B类)分别用山羊抗肌生长抑制素多克隆抗体和小鼠抗GAPDH单克隆抗体检测该蛋白。在代表性印迹中显示了成熟形式的肌肉生长抑制素，并显示了检测到的条带的分子质量。每个样本的重复数量都有表示，星号表示显著差异(P（P）< 0.05). 数据归一化为平均瘦表达水平±SE.ExOb，exobese。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943以获得此图形的高质量数字表示。）
肌生长抑制素在培养的肌管、肌肉和血浆中的表达。
因为相对于瘦细胞，极度肥胖者向条件培养基分泌的肌抑制素增加()我们还测定了培养的肌管、骨骼肌和血浆中肌抑制素蛋白的表达。在，我们显示52-kDa肌抑制素前体蛋白的表达显著升高（2.0±0.12，P（P）<0.01）。在极度肥胖的肌管中，40-kDa肌抑制素前肽也同样升高。尽管在极度肥胖的细胞中，成熟的26-kDa肌抑制素肽明显增加，但仅偶尔检测到（八个样本中的三个）。52-kDa肌抑制素前体蛋白的加工产生NH2-末端，40-kDa潜伏相关肽（LAP）和生物活性26-kDa-COOH末端二聚体(19). 这些发现与先前的研究一致：与成熟肌肉相比，肌肉抑制素从培养的肌肉细胞中快速加工和分泌(19,22). 由于肌抑制素的表达和分泌在来自极度肥胖人类供体的细胞中增加，我们也在单独的患者队列中研究了其在骨骼肌和血浆中的表达。
在极度肥胖的原发性人类肌管中，肌肉抑制素蛋白增加。用15%的SDS-PAGE分离出等量的人原代肌管总蛋白。A类：用山羊多克隆抗肌生长抑制素抗体检测肌生长抑素蛋白。典型印迹显示肌抑制素的前体、成熟和LAP形式。显示了检测到的谱带的分子质量。B类：仅对肌抑制素的52-kDa前体形式进行了量化；然而，LAP似乎遵循类似的表达模式。只有在极度肥胖的肌管中检测到少量26-kDa成熟肌抑制素。每个样本的重复数量都有表示，星号表示显著差异(P（P）< 0.05). 数据被归一化为平均瘦表达水平±SE。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943以获得此图形的高质量数字表示。）
在，我们显示23%(P（P）<0.05）肌抑制素52-kDa前体蛋白增加，26-kDa-二聚体增加35%(P（P）<0.05）。与肌管不同，52kDa前体蛋白已被证明是成熟骨骼肌中最丰富的免疫反应物种(19,21). 肌抑制素蛋白水平与HOMA的线性回归分析()显示出显著的相关性(第页2=0.6时，P（P）=0.03），尽管它似乎与体重有更好的相关性() (第页2=0.737，P（P）<0.01），考虑到这些组之间BMI的极端差异，这并不完全令人惊讶。
极度肥胖者骨骼肌和血浆中的肌抑制素蛋白增加。用15%的SDS-PAGE分离出等量的人骨骼肌和血浆总蛋白。A类：用山羊多克隆抗肌生长抑制素抗体检测肌生长抑素蛋白。典型的印迹显示肌抑制素的前体（52 kDa）和成熟二聚体（26 kDa）形式。B类：肌肉中仅定量了52-kDa前体形式的肌抑制素，血浆中定量了26-kDa成熟形式。每个样本的重复数量都有表示，星号表示显著差异(P（P）< 0.05). 数据被归一化为平均瘦表达水平±SE。（请参见http://dx.doi.org/10.2337/db08-0943以获得此图形的高质量数字表示。）
肌肉中肌酐表达的线性回归分析。使用最小二乘法进行线性回归分析，比较肌肉肌抑制素表达水平与HOMA(A类)和BMI(B类). 平方米2.
肌生成抑制素的成肌细胞增殖生物测定。
肌肉生长抑制素通过抑制成肌细胞的增殖减少体内肌肉质量(18,19,22). 我们培养了小鼠C2C类12瘦肉和极度肥胖培养肌管中48h条件生长培养基存在下的成肌细胞(). 为了区分肌生成抑制素与其他分泌分子的作用，我们预先培养了具有中和浓度的抗肌生成抑素抗体的培养基。在，我们发现在条件培养基中生长的成肌细胞的增殖受到显著抑制，这些成肌细胞来自极度肥胖的肌管。这些观察结果与先前关于肌抑制素对成肌细胞增殖的生长抑制作用的研究一致(18,19,22). 2天后，这些细胞的增殖速度明显变慢（−2.3±0.11倍，P（P）<0.05）。培养3天后，当瘦肉与肥胖条件培养基相比有显著差异（2.06±0.11倍，P（P）<0.01）和在抗肌生长抑制素抗体预处理培养基中生长的细胞之间（−1.5±0.15倍，P（P）< 0.01). 有趣的是，在肥胖培养基中生长的抗体前体细胞生长速度与对照细胞相同，并且在第4天之前比瘦细胞更快，这表明肥胖条件培养基中存在促增殖因子。在贫瘠和肥胖条件培养基中培养的胰蛋白酶化细胞常规用台盼蓝染色，活细胞百分比无显著差异。
C的增殖率2C类12小鼠成肌细胞在人肌管条件培养基中生长。在贫或极度肥胖的人肌管条件生长培养基中生长相同数量的细胞，该培养基与山羊多克隆抗肌肉生长抑制素抗体或不与山羊多克隆抗肌肉生长抑制素抗体预孵育以中和肌肉生长抑制素活性。绘制的值代表三个实验的平均值±SD。星号表示显著差异(P（P）< 0.05). 对照细胞在无条件培养基中生长。
讨论
尽管骨骼肌本身不被认为是一种分泌器官，但越来越多的证据表明，它可能在健康和疾病中组成性或间歇性分泌生物活性分子(17,24,26,27). 这项研究的目的是确定肌肉分泌到循环中的蛋白质，这些蛋白质可以作为肥胖严重程度的生物标志物。在这里，我们报道了与健康的非肥胖受试者相比，极度肥胖受试者的培养肌肉细胞和成熟骨骼肌中的肌生长抑制素表达并积极分泌到循环中。这是已知的第一个定量描述人类组织中肌肉生长抑制素蛋白水平与肥胖和胰岛素抵抗的关系。这些结果证实并扩展了先前的研究，这些研究描述了许多肥胖和减肥实验模型中肌肉生长抑制素mRNA表达的变化(28–30).
肌生长抑制素（Myostatin）属于转化生长因子-β（TGF-β）家族，是一种有效的肌肉生长和发育的抗胆碱能抑制剂。与其他TGF一样，肌肉生长抑制素被翻译为一种前体蛋白，被裂解产生NH2-来自细胞的末端LAP和COOH末端肽二聚体(18,19). 成熟的肌抑制素二聚体由肌肉分泌，与LAP呈非共价结合，保护其免受降解并保持其活性构象。成熟的肌生成抑制素由细胞外基质相关的骨形态发生蛋白-1/tolloid金属蛋白酶从LAP中释放出来，这被认为可以激活局部作用（旁分泌）和循环（自分泌）形式的肌生成抑制素。然后，游离成熟的肌抑制素肽与激活素II B型受体结合，通过该受体抑制常驻肌成肌细胞从细胞周期的G1期向S期的进展，从而对其发挥显著的抗失血作用(18,22). 这就是为什么循环肌抑制素的缺失或抑制产生高肌表型的原因(31,32).
在观察到肌生成抑制素缺乏的高肌肉小鼠减少了脂肪量，似乎对饮食诱导的胰岛素抵抗具有免疫力后，首次假设肌生成抑素在新陈代谢中发挥作用(33,34). 这是否仅仅是由于瘦肉质量增加或循环肌抑制素减少的其他代谢影响尚待确定(33). 然而，最近的研究表明，肌肉生长抑制素抑制胎盘细胞株的葡萄糖摄取，这表明它可能导致肥胖患者的全身胰岛素抵抗(35). 其他研究表明，肌肉抑制素与胰岛素可能调节的基因网络有关，并伴有极度肥胖(30). 严重的热量限制和饥饿也被证明可以增加骨骼肌中肌抑制素的表达，可能是为了减轻大块肌肉的代谢负担(36). 该模型的进化背景是，在饥饿条件下，增加循环中的肌抑制素是生存的，因为它通过维持血糖来维持大脑功能，从而保持觅食能力(37). 考虑到这些重要的观察结果，我们假设骨骼肌胰岛素抵抗诱导肌抑制素表达，以应对细胞饥饿状态。或者换句话说，肥胖骨骼肌的代谢环境可能与饥饿肌肉的代谢环境相似，因为在胰岛素抵抗状态下，葡萄糖摄取受到严重限制，脂质的氧化分解代谢减少或不完全；然而，这一假设尚未得到验证(10,13,14,38). 也有研究表明，肌肉中肌肉抑制素的表达随着耐力和阻力训练而急剧减少(39). 由于缺乏运动和糖酵解纤维类型分布是肥胖的常见特征，肌肉抑制素水平升高也可能是久坐生活方式的继发因素(40,41). 由于胰岛素抵抗在原代培养的肌肉细胞中不能持续维持，肌抑制素表达增加可能是极度肥胖的固有特征(14). 最后，尽管我们已经显示了肌肉胰岛素抵抗和肌肉中肌抑制素表达之间的相关性，但尚未建立因果或机制关系。
尽管弗兰克2型糖尿病患者的肌肉明显减少(42,43)目前尚不清楚循环肌抑制素增加是否在肥胖和胰岛素抵抗骨骼肌代谢恶化中起直接作用。支持肌抑制素在糖尿病肌肉萎缩中的作用的是对象/对象肌肉质量和纤维横截面积均减少的糖尿病小鼠(33,44,45).
总之，我们已经在细胞、器官和全身水平上显示了极度肥胖患者肌抑制素蛋白的表达增加。据我们所知，这是首次使用定量分泌蛋白分析鉴定非癌症生物标志物(46–48). 未来的研究将验证我们的假设，即肌肉中的肌抑制素表达是由胰岛素抵抗诱导的。
致谢
D.S.H.已经收到卡尔加里大学运动学学院的启动资金。J.S.得到了艾伯塔省传统医学研究基金会、加拿大健康研究院、心脏与中风基金会和加拿大糖尿病协会的支持。J.A.H.已获得国家卫生研究院拨款DK-56112。
这项工作得到了Encana向REACH捐赠的部分支持！活动。没有报告与本文相关的其他潜在利益冲突。
我们感谢Lin Su在肌肉和血浆蛋白质印迹方面的帮助。
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