Nat Rev Mol细胞生物学。作者手稿；PMC 2009年3月1日提供。
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泛素蛋白酶体系统中信号多样性的退化
†和*,*
汤姆·拉维德
†以色列耶路撒冷希伯来大学生物化学系，邮编：91904
马克·霍克斯特拉瑟
*美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学分子生物物理与生物化学系，邮编：06520
†以色列耶路撒冷希伯来大学生物化学系，邮编：91904
*美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学分子生物物理与生物化学系，邮编：06520
前言
泛素蛋白酶体系统降解大量蛋白质，这些蛋白质被特定降解信号（degron）靶向。除了调节蛋白的降解外，几乎每个蛋白质都会发生偶发的生物合成错误或错误折叠，细胞可以识别这些异常蛋白质并快速降解它们。少数简并子的结构和功能数据允许对其作用机制进行一些概括。我们重点研究泛素系统识别脱基的不同策略，并将受信号依赖性修饰的调节性脱基与蛋白质折叠或组装控制的调控性脱基进行对比，这在蛋白质质量控制中经常发生。
介绍
细胞内蛋白质降解已经研究了半个多世纪，很早就清楚这种降解具有高度选择性，个别蛋白质半衰期从几分钟到几年不等（有关早期文献的综述，请参阅参考文献。1-2). 此外，尽管肽键断裂具有动力源性质，但这种降解大多依赖于能量。这种能量依赖性源于高底物特异性和底物蛋白去折叠的双重要求，以使多肽骨架完全可用于蛋白水解裂解。在真核生物中，绝大多数受调节的蛋白质降解是由泛素-蛋白酶体系统执行的三-5特定酶对底物的多泛素标记是系统选择性的主要来源(方框1)而26S蛋白酶体复合体执行将标记蛋白质加工切割成短肽所需的蛋白质去折叠(方框2). 此外，泛素连接可以通过将某些蛋白质（通常是膜蛋白）导向溶酶体/液泡进行蛋白水解，从而独立于蛋白酶体发挥作用。相反，蛋白酶体可以降解一些蛋白质，而无需事先被泛素修饰。
方框1。泛素结合机制
目的是消除的底物蛋白最初附着在高度保守的泛素（Ub）蛋白的聚合物上（参见). 这种对底物的共价修饰将结合蛋白靶向多催化蛋白酶复合物，即26S蛋白酶体5底物蛋白中的泛素附着位点通常是赖氨酸（K）侧链。一系列定义明确的酶协调多泛素与蛋白质的连接。泛素首先通过E1泛素激活酶在消耗ATP的反应中被激活，泛素通过高能硫酯键与酶相连。随后，激活的泛素被转移到第二种蛋白质的活性位点半胱氨酸（C），即E2泛素结合酶。在第三种酶E3或泛素蛋白连接酶的帮助下，E2催化（聚）泛素转移到预定降解的蛋白质上。
E3是决定底物泛素化特异性的最重要因素。有两大类机械上不同的E3，以环（或类环）和HECT域为特征。两种类型的E3在建立选择性底物结合的能力上相似。环指使用半胱氨酸和组氨酸残基来协调一对锌离子的特征排列。一组较小的E3具有一个称为U盒的域，它是RING-finger的简并版本，在不协调任何金属离子的情况下实现与RING-Finder相同的一般折叠143环和类环E3s结合E2和底物，催化泛素直接从E2转移。与RING和U盒E3不同，HECT E3在底物泛素化中具有更直接的催化作用。泛素E2硫酯的活化泛素被转移到E3的HECT结构域中的保守半胱氨酸残基，然后最终转移到底物。
泛素化被去泛素化酶（DUBs）逆转，去泛素酶从蛋白质中去除泛素并分解多泛素链。DUB在蛋白质降解之前提供额外的调节控制，它们也是维持细胞内足够的游离泛素分子库的基础。
方框2。26S蛋白酶体的底物靶向
一旦被至少四个泛素（Ub）组成的多泛素链修饰，底物蛋白就能够直接与26S蛋白酶体19S调节复合体中的固有Ub受体结合（参见)或连接到同时具有多泛素结合域和蛋白酶体结合域的衔接蛋白（参见)144为什么某些多泛素修饰的底物必须通过衔接蛋白穿梭到蛋白酶体，而其他底物可以直接与蛋白酶体调节复合体中的多泛素结合亚单位结合，这一点还不完全清楚。底物蛋白质与蛋白酶体结合后，半打ATP酶围绕蛋白酶体催化核心孔展开蛋白质，蛋白酶体相关联的氘化酶（DUB）去除多泛素链，并将未折叠的蛋白质转移到中央蛋白水解酶室，在那里它被切割成短肽（参见).
关于细胞内蛋白质水解的一个基本问题是，特定蛋白质是如何被蛋白质水解机制识别的，从而导致蛋白质仅在特定条件下以高度特征性的降解速率被降解。早期的研究表明，整体结构特征决定了单个蛋白质的代谢稳定性。例如，突变蛋白或在合成过程中引入氨基酸类似物的蛋白被发现半衰期较短体内比野生型的同类6,7此外，蛋白质降解率似乎与总蛋白质的物理化学性质有关，如分子量或等电点8,9然而，后来的分析表明，与总蛋白属性的相关性通常不成立，尽管异常蛋白通常是短命的，但这不需要反映其结构的全球变化。
正如下文将要详细讨论的那样，大多数短命蛋白质通过定位结构决定簇（“信号”）来区分，这些结构决定簇将它们定位于泛素连接酶机制或蛋白酶体（在某些情况下是溶酶体）。降级信号或“degron”10通常被定义为蛋白质中足以被蛋白水解装置识别和降解的最小元素。反电子的一个重要性质是它们是可转移的。也就是说，这种序列的基因工程连接会给其他长寿蛋白带来代谢不稳定性（半衰期短）三度可以定义为不同的蛋白水解酶途径，但我们将把这篇综述局限于描述以蛋白质为目标的泛素蛋白酶体途径的脱基子。在这一点上，由于系统底物的多样性，该领域的推广在一定程度上受到了限制。例如，许多调节蛋白以时间和空间特定的方式降解。这些蛋白质通常受到其他依赖于细胞吞噬事件的翻译后修饰的严格控制。另一方面，新合成蛋白质的质量控制和错误折叠蛋白质的去除受到了完全不同的约束。这种异常蛋白质的识别和破坏预计取决于它们的折叠或组装状态。如果折叠或组装出错，蛋白质会暴露出许多不同蛋白质中存在的正常隐秘的降解子。
在这篇综述中，我们将重点关注特定蛋白质降解的不同生理需求如何决定不同降解子的设计。不同的决定因素组成了一个degron，它们在降解途径中具有不同的作用。具体地说，我们认为初级识别决定簇是指直接与E3-E2泛素连接酶复合物或其辅助因子结合的degron内的序列或结构。泛素依赖性降解子的另一个决定因素是存在适当的受体位点，用于连接多泛素链，例如赖氨酸残基。（多泛素修饰的）底物还必须能够与将其传递到蛋白酶体的蛋白酶体或穿梭因子相互作用。最后，degron必须位于底物中，这样蛋白酶体才能启动其去折叠并将其转移到蛋白酶体核心。我们在这里的重点是初级承认决定因素。
并不是所有蛋白质泛素化的调节都是通过底物的变化来激活脱基的。虽然我们没有足够的空间来涵盖这一领域，但E3和E2酶本身可以通过翻译后修饰进行调节，例如后发复合体E3的磷酸化11或与小分子结合。例如，二肽结合可以变构调节N-识别素E3（参见下一节）12生长调节植物吲哚生长素与特定的E3连接酶结合，形成扩大的蛋白结合界面的一部分，允许与特定蛋白底物进行高亲和力相互作用13.
N-degron和N-end规则途径
共价泛素结合使蛋白质降解的概念导致泛素介导的蛋白水解的发现者提出底物选择主要发生在泛素连接阶段14,15通过向兔网织红细胞裂解液中添加多种蛋白质，Hershko及其同事发现蛋白质中存在游离α-氨基与其泛素依赖性降解之间存在明显的相关性16随后，他们分离出一种具有E3泛素连接酶活性的180kD蛋白质，该蛋白质与游离α-氨基的蛋白质的亲和力似乎高于N末端被阻断的蛋白质15.
这种特殊的E3不仅通过游离的N-末端α-氨基来区分蛋白质，还通过N-末端残基的侧链来区分蛋白质。Varshavsky及其同事系统地改变了N末端残基在另一个相同系列的大肠杆菌β-半乳糖苷酶测试底物并在酵母中表达，在酵母中显示出显著的降解率范围17半衰期从几分钟到超过20小时不等。因此，E3能够以非常高的选择性结合蛋白质底物，在这种情况下，能够通过识别蛋白质N末端的特定残基来区分底物18这种降解途径称为“N末端规则途径”，它表明蛋白质的半衰期由其N末端残基的性质决定。底物N末端区域内足以进行泛素依赖性周转的肽序列构成了“N度”().
N-末端规则途径底物的激活机制一|N端规则途径的1型（碱性）和2型（疏水性）失稳残基显示在一个单字母代码中。b条|内肽酶的裂解可以导致在截短蛋白的N末端定位一个不稳定残基（X）。c|蛋氨酸氨肽酶在蛋氨酸和胱氨酸之间的裂解（如闪电所示）可导致蛋白质失稳，随后添加Arg，即1型失稳残留物（见面板d）。d日|特定脱酰胺酶将Asn修饰为Asp（或Gln修饰为Glu）可导致精氨酸转移酶添加Arg（上图）。N-末端Cys残余物的氧化（标记为星号)可类似地导致蛋白质精氨化和降解（下图）。
原核N-末端规则途径
有趣的是，尽管原核生物缺乏泛素结合系统，但原核生物也有一个N端规则途径（参见参考19). 26S蛋白酶体是真核生物中N端规则底物的蛋白酶，而依赖ATP的Clp蛋白酶复合体（ClpAP）是降解细菌中此类底物的主要蛋白酶。一些研究结果表明，这两个蛋白水解酶系统对至少一部分“不稳定”具有共同的识别原理N-末端残基。在真核生物中，一种环类泛素连接酶，现在称为E3α或N识别素，介导泛素从E2转移到N末端规则底物内的特定赖氨酸，允许底物传递到26S蛋白酶体。在细菌中，不是识别N末端残基的E3连接酶，而是一种称为ClpS的衔接蛋白与底物的N末端区域以及ClpAP蛋白酶的ClpA-ATP酶亚基的特定结构域结合。传递到ClpA六聚体环导致底物去折叠和移位到ClpP丝氨酸蛋白酶核心（在参考19). 在真核生物N-识别素的一个底物结合位点（“2型”位点）和ClpS表面的一个保守序列之间发现了有限的同源性20该同源区域富含酸性和疏水性残基，为与N-脱基相互作用提供了潜在的互补表面。Erbse和同事发现底物肽中的净正电荷有利于强结合，这是对假定的ClpS结合基序的补充21值得注意的是，N-识别素同源物的真核生物2型底物结合位点中也存在保守位置的酸性残基。ClpS在细菌N-末端规则降解中的功能及其与真核生物N-识别蛋白的（有限）同源性表明，尽管下游蛋白水解酶系统存在明显差异，但细菌和真核生物对N-末端规则底物的识别具有某些特征。
真核生物N端规则途径
在酿酒酵母在首次描述N末端规则的地方，该途径的生理意义起初很难识别，因为缺乏N识别素（Ubr1）的突变体在大多数情况下都无法与野生型细胞区分表型。第一个鉴定出的具有重要生理学意义的N-脱基的酵母底物是Scc1的蛋白水解片段，Scc1是凝集素复合体的一个亚单位，有助于在有丝分裂和减数分裂期间维持姐妹染色单体的凝聚力22在中期到后期的转变中，Scc1被一种称为分离酶的内蛋白酶切割，从而使子染色体分离。Scc1的C末端片段在其N末端含有精氨酸。该蛋白片段被Ubr1识别并靶向蛋白酶体降解。未能降解C末端Scc1片段会导致染色体丢失率增加，而稳定片段的过度表达是致命的。因此，蛋白质的内部裂解可以通过N端规则途径为蛋白质降解提供起始事件().
内切蛋白水解酶裂解只是众多N端修饰中的一种，这些修饰可以将蛋白质导入N端规则途径。例如，新合成的蛋白质含有N-末端蛋氨酸，这是一种稳定的残基。因此，N末端规则途径的N末端脱基只能通过共翻译去除蛋氨酸从前N脱基产生(). 此外，以酸性残基或（在哺乳动物细胞中）半胱氨酸为起始点的成熟蛋白质首先通过精氨酸-tRNA-蛋白转移酶（Ate1）用精氨酸修饰，然后才能与N-识别素结合并泛素化()23,24具有N-末端半胱氨酸的短寿命蛋白质的调节是特别复杂的。在这种情况下，半胱氨酸必须首先通过分子氧和一氧化氮（NO）的作用被氧化成亚硫酸或磺酸形式，然后才能被酶精氨化25-27一些G蛋白信号调节蛋白（RGS）的降解依赖于这种NO-依赖机制。最近，研究表明Ate1能够使许多蛋白质精氨化，但这并不一定会产生N-降解28这意味着多个行列式对于创造一个N次方是必要的，而不仅仅是一个不稳定的N末端（见下文）。
在哺乳动物中，通过小鼠敲除分析和人类疾病基因定位（在参考29). 除了E3α外，哺乳动物基因组还编码了至少五种以上的UBR盒蛋白，具有E3泛素连接酶特有的特异性特征30一些推测的E3，以及已知可修饰N末端残基以通过N末端规则途径进行潜在靶向的酶，已被证明有助于心血管发育、精子生成和病毒防御等作用31-33.
SCF识别磷化氢抄送4
F-Box蛋白（FBPs）是E3连接酶多亚单位SKP1-CUL1-F-Box（SCF）家族的底物特异性亚单位(方框3). 遗传和结构方法为SCF底物的降解子组成及其识别提供了许多见解34-40大多数SCF底物的降解需要对特定的丝氨酸或苏氨酸残基进行磷酸化，然后短磷酸化肽基序可以与特定的FBP结合().
方框3。SCF综合体
组装在称为cullin的支架亚单位上的多亚单位泛素连接酶是E3的最大亚类（有关综述，请参阅145). 最具特征的cullin-dependent连接酶属于SCF（Skp1-Cul1-F-box蛋白）连接酶家族，其通常以含有特定磷酸化序列元件（称为磷酸化子）的蛋白质为靶标。在SCF连接酶中，Cul1 cullin亚基起着分子支架的作用，同时与S相激酶相关蛋白1（Skp1）和RING-box 1蛋白Rbx1相互作用（见图一). Skp1是Cul1和多种F-box蛋白（FBP）之间的适配器。F盒元件直接与Skp1结合，而FBP的C末端结构域提供了一个底物再识别平台，通常由WD40或富含亮氨酸的重复序列组成36,146,147.标准立方英尺固定基地计划复合物参与细胞周期调控以及其他过程，如转录、细胞信号传递和内质网相关蛋白降解（ERAD）。SCF定向模型βTrCP与E2酶和底物β-catenin的磷酸化子复合（面板b条)36该模型将E2活性位点半胱氨酸～50μl放置在远离β-连环蛋白肽的位置，表明SCF的活性形式βTrCP要么具有独特的构象，要么作为更大的多聚体单元的一部分发挥作用。
与F-box蛋白Fbw7结合的CycE磷酸化子的结构一|Skp1-Fbw7-CycE C端膦化试剂（CycE）的总体架构摄氏度)复合体，标记了Skp1、F-box和连接子域的二级结构元素。b条|CycE（循环经济）摄氏度穿过Fbw7β螺旋桨结构的窄面。显示了两个磷酸化残基Trp380和Ser384。八个Fbw7叶片和一个叶片的绞合线分别用数字和字母标记。
这种磷降解子最具特征的是参与泛素系统有序消除特定细胞周期素和细胞周期依赖性激酶（CDK）抑制剂的磷降解子（有关综述，请参阅参考文献。41,42). 在酵母中，细胞分裂需要G1细胞周期蛋白（Cln1/2/3）的阈值水平，在G1期逐渐积累，导致Cdc28激酶（Cdk1）在G1晚期激活。Cln-Cdc28激酶的主要功能是磷酸化细胞周期蛋白B调节激酶抑制剂Sic1，从而以Sic1为降解靶点并进入S期43磷酸化Sic1被作为SCF一部分的FBP Cdc4特异性识别抄送4泛素连接酶。在哺乳动物细胞周期中，类似的SCF复合物靶向磷酸化形式的细胞周期蛋白E和CDK抑制剂p27基普1 44,45后一种蛋白质的异常持久性导致细胞周期失调和基因组不稳定46,47.
磷酸化驱动底物与SCF结合以及随后泛素结合的机制正在积极研究中。Sic1磷酸化及其与SCF结合的研究抄送4为这种协调控制的复杂性提供了一个很好的例子34,37,40Sic1在九个不同的位点被磷酸化，其中至少六个位点的磷酸化增强了其与Cdc4的WD40-repeat结构域的相互作用。重要的是，9个Sic1磷酸化位点之间或与SCF的其他降解子之间几乎没有相似性抄送4基板34测试合成的磷酸肽与Cdc4的最佳结合亲和力，获得了Cdc4磷酸化简（CPD）的一致结合位点；参考34). 令人惊讶的是，没有一个Sic1 CPD与共识序列完全匹配。对Sic1中多个弱CPD位点的一个合理解释是，它们允许对Cln-Cdc28激酶活性的超敏反应，这两种反应都为Sic1的周转造成时间延迟，并防止其因磷酸化状态的微小波动而过早降解。Sic1的转换和进入S期将需要相对较高水平的活性激酶，而活性激酶又取决于细胞的适当营养信号34,48.
通过对Cdc4与九残基最佳膦化试剂配合物的晶体结构分析，深入了解了Cdc4结合偏好的机理基础37晶体学数据表明，CPD与Cdc4的结合受界面的三个主要特征控制：1）肽磷酸化对结合到Cdc4 WD40结构域是绝对必要的，因为与磷酸基团有良好的静电相互作用和氢键作用。2） Cdc4上的一个深疏水囊选择磷酸化试剂中保守的疏水残基。3） Cdc4上的带电残基和极性残基会选择次优磷降解试剂中存在的碱性残基。后一个特征可以解释为什么Sic1-Cdc4相互作用需要多重磷酸化事件49.
与Sic1中多个单一磷酸化位点与Cdc4的协同结合相反，两个相关SCF复合物（SCF）的晶体结构βTrCP1和SCF飞行重量7与各自的双磷酸化肽底物结合显示出一种结合模式，即肽中的磷酸化残基与FBP WD40结构域上的两个磷酸结合位点结合36,40(). Fbw7中的两个磷酸盐结合位点在Cdc4结构中保守37这表明Cdc4与Fbw7类似，可以与双磷酸化肽结合，亲和力比单磷酸化肽更强。事实上，双磷酸化的Sic1 CPD对Cdc4的亲和力比单磷酸化的高19倍40根据新兴模型，Sic1包含三个独立的CPD，每个CPD都有两个必需的磷酸化位点。每一个degron都足以与Cdc4紧密结合在体外与最佳CPD相似。这些发现对拟议的Cdc4-Sic1相互作用合作模型具有启示意义，因为它不支持简单的阈值机制34.
一种氧依赖的脱电子
由信号依赖性翻译后底物修饰调节的蛋白泛素化的另一个有趣的例子发生在缺氧诱导因子-1（HIF-1）中，HIF-1是一种异二聚体转录复合物，介导对氧可用性的转录反应50在缺氧条件下，HIF-1的二聚体激活与细胞适应低氧张力有关的基因的转录，如编码血管内皮生长因子和促红细胞生成素的基因，这些基因对新血管和红细胞的形成很重要。HIF-1复合物在低氧条件下是稳定的，但在常氧条件下，HIF-1α亚基被蛋白酶体快速降解。这种蛋白水解调节依赖于由von Hippel-Lindau蛋白（VHL）、伸长蛋白B和C、cullin-Cul2A和Rbx1组成的独特的cullin-RING泛素连接酶51,52VHL是复合物中的底物识别亚单位，它通过氧依赖性去电子（ODD）与HIF-1α结合53 54在氧合良好的细胞中，HIF-1α特异性脯氨酰羟化酶使用分子氧使一个或两个特异性脯氨酸残基羟基化54,55.
与VHL结合的人HIF-1α羟基化脱基的晶体结构揭示了脯氨酸564上羟基的关键作用35,56ODD主要通过ODD中以羟脯氨酸（Hyp）564为中心的六个残基片段结合VHL。该残基几乎完全埋藏在VHL结合表面的疏水囊中，与周围的VHL残基形成氢和范德瓦尔斯相互作用。Hyp564附近的HIF-1α主干通过与VHL的广泛氢键网络固定到位。VHL对羟基化HIF-1α肽的亲和力是非羟基化形式的约1000倍56在遗传性癌症易感性综合征von Hippel-Lindau病患者中，与Hyp564直接接触的五个VHL残基中的每一个都会发生错义突变57因此，Hyp564与VHL的高亲和力结合通过多种相互作用维持，对于消除HIF-1α依赖性肿瘤发生至关重要。
一般来说，翻译后修饰允许蛋白质泛素化速率与特定刺激相耦合。这种底物改变也将主要的调控点转移到泛素附着之前的步骤。除了上面讨论的N末端残基处理、磷酸化和脯氨酰羟基化的示例外，蛋白质糖基化（见下文），甚至之前被其他泛素类蛋白质如小泛素相关修饰物（SUMO）修饰可以调节特定蛋白质泛素化和降解的概率58.
ER中的度数
到目前为止所讨论的所有简并都可以归类为条件信号，对于这些信号，在特定位置进行翻译后修饰是创建功能性简并所必需的。修饰后的残基以及多肽中的邻近区域构成了用于特定泛素连接酶复合物识别的基本结构元素。然而，并非所有的底物蛋白都是通过先前的共价修饰来识别的。当蛋白质呈现特定的构象或组装状态时所揭示的结构特征可以在广泛的降解子中充当识别元件。未能形成天然三级或四级结构的多肽，统称为蛋白质质量控制（PQC）底物，通常会受到这种底物识别模式的影响（参见参考文献。59,60). 泛素依赖性PQC的一个主要部位是内质网（ER），在内质网中，大多数分泌性和整合性膜蛋白在被运输到其作用部位之前被折叠和组装。无法正确折叠或组装的蛋白质通常永远不会从内质网到达高尔基体，而是通过双层被提取回细胞溶质中，泛素化并被细胞溶质蛋白酶体降解（参见参考文献。61-64). ER-associated degration（ERAD）系统的成分也可以识别经历短暂或诱导结构变化的天然蛋白质，从而调节特定ER-resident蛋白质的水平。
错误折叠或错误组装蛋白质的降解特征是什么？在这方面仍有很多东西需要学习，并且没有用高分辨率结构方法可视化的这类degron（或degron-E3复合物）（但请参阅下一节）。然而，一些线索已经出现，令人惊讶的是，其中包括对某些天然短寿命调节蛋白的研究。
酵母Matα2的疏水变性
在芽殖酵母中，细胞特性由材料交配型基因座。这个基因座可以携带两个不同的DNA序列，MATa公司和材料α、 直接表达不同的转录调控因子。在某些单倍体菌株中，这两种状态之间发生快速转换，相关的表型变化表现在单个细胞分裂中。对于细胞表型的这种快速变化，被丢弃的材料基因座必须迅速退化65.Matα2为材料α编码的转录抑制因子。α2泛素化的一条途径需要两个E2，Ubc6和Ubc7，它们与RING型E3连接酶Doa10一起起作用66,67出乎意料的是，这些E2和E3酶是内质网膜中嵌入的大型复合物的一部分，它们也作用于特定的ERAD底物67-70.
α2中的～60残基N末端区域包含一个脱电子，称为1度Doa10综合体的目标；a～19-剩余行列式1度是最关键的元素71这个决定簇似乎形成了一个两亲螺旋，几乎所有的反转录激活突变都聚集在这个螺旋的疏水面上().1度当附加到完整的内质网膜蛋白时也起作用，这表明Doa10途径的膜底物可以利用相关的降解子68在哺乳动物血清和糖皮质激素调节激酶1（Sgk1）的降解物和一组与报告蛋白融合的人工肽序列的降解物中也发现了类似的疏水性元素，酵母中Doa10途径的所有底物72-74总之，这些观察结果表明，表面暴露的疏水（螺旋）结构也可以作为Doa10途径ERAD底物中的识别基序，尽管这仍有待结构研究检验。
ER相关降解程度一|酵母α2区域（残基18-36）的螺旋轮表示1度预计将形成线圈结构的一部分的脱谐。突变被抑制的残留物1度-介导的蛋白水解标记为粗体。b条|内质网（ER）膜中3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）组织的模型。甾醇感应域用橙色标记。c|附着在核糖核酸酶B的Asn34上的Man3GlcNAc2寡糖的3D结构。葡萄糖胺（壳二糖）的β-1,4-连接二聚体，作为SCF的结合位点财务报表1，标记为红色。
酵母中大多数异常ER蛋白的蛋白水解靶向由两种泛素连接酶复合物进行，即上文讨论的Doa10复合物和Hrd1复合物（有关综述，请参阅参考文献。61,64,75). 哺乳动物既有这些E3的直系同源物，也有其他与ER相关的E376Doa10和Hrd1识别不同的内质网膜和管腔基底。Doa10还可以以α2和其他核基质为靶点，因为它能够到达内核膜，这是Hrd1不具备的能力77.内质网中Doa10的大多数PQC底物是具有胞质处置损伤的完整膜蛋白68,78相反，Hrd1似乎主要作用于管腔病变的可溶性内质网基质或膜蛋白78。由于检测的底物数量仍然很低，因此应谨慎对待这些概括。有趣的是，Hrd1靶向特定底物的能力受到底物中N-连接碳水化合物和多肽决定簇的影响（综述于参考79).
HMG-CoA还原酶的分布脱基
除了异常蛋白外，Hrd1途径还靶向天然短寿命底物。研究得最好的是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR），它是内质网的一种97-kDa的膜糖蛋白。HMGR是甲羟戊酸途径中的关键酶，甾醇是由其合成的，作为甾醇合成的细胞控制的一部分，它受到反馈调节（有关综述，请参阅参考号80). HMGR由一个面向细胞质的C端催化结构域和一个锚定内质网酶的非催化N端膜结构域组成81,82。该疏水结构域具有八个膜跨，构成一个顺式-调节酶稳定性所必需和足够的作用元件()83-85在其他几种蛋白质中发现了类似的跨膜序列延伸，每种蛋白质都受到甾醇的影响；因此，该区域被称为固醇感应域86-88.
芽酵母表达HMGR的两种同工酶，Hmg1和Hmg2，其中只有第二种正常受ERAD调节。Hmg1和Hmg2跨膜结构域之间的一系列序列交换表明，降解所需的信息分散在Hmg2跨膜结构域的500多个残基中，表明存在“分布式退电子”89对无细胞提取物中Hmg2折叠的分析进一步表明，某些脂类可诱导Hmg2膜结构域的结构变化，这可以被化学伴侣所抵消在体外和体内 90,91因此，Hmg2可以经历显著的可逆结构变化，刺激其依赖Hrd1的降解，这可能是通过模仿ER中PQC导致的错误折叠蛋白质中的结构。
泛素-蛋白酶体系统是如何识别这种“分布式去电子”的？早期的研究表明，抑制蛋白质翻译可以消除甾醇刺激的哺乳动物HMGR降解，同时显著降低酶的多泛素化92这表明短寿命蛋白质可能在HMGR的调节性周转中起重要作用。最近，一种刺激HMGR周转的短命蛋白质被发现93这种被称为Insig-1的蛋白质与哺乳动物环E3连接酶gp78相互作用，后者与酵母Hrd1有关94在甾醇缺乏细胞中，gp78与Insig-1结合，导致后者蛋白的泛素化和蛋白酶体降解。相反，当细胞内固醇积累时，Insig-1的泛素化被阻断，蛋白质稳定。高固醇水平还促进gp78-Insig-1复合物与HMGR的结合，导致酶的泛素化和蛋白酶体降解95因此，Insig蛋白可以被视为适配器蛋白，它识别紊乱的固醇传感域包含的客户蛋白，并帮助将其引导至适当的泛素连接酶，以实现泛素化和下调。
N-糖基化蛋白的壳聚糖
如前所述，内质网中的许多膜蛋白和可溶性蛋白都是糖基化的，特定的N-连接聚糖提供信号，通过这些信号，内质网上错误折叠的蛋白被识别为最终逆转录到胞浆中（有关综述，请参阅参考96). 在其他情况下，最明显的是，对于未糖基化的蛋白质，多肽本身携带主要识别决定因子，并且有糖和蛋白质部分都参与底物识别的例子97重要的是，这些碳水化合物结构的最初识别是通过作用于内质网膜管腔侧的特殊凝集素进行的98-100.
在哺乳动物中，Fbs1利用错误折叠的糖基化蛋白的独特细胞溶质识别模式101.Fbs1是SCF复合物SCF的F-box蛋白财务报表1催化错误折叠的N-糖基化蛋白质的泛素化。内质网管腔中的几个高甘露糖寡糖再识别分子参与质量控制保证，防止不当折叠的糖基化蛋白质离开内质网102,103相反，这些最终进入ERAD途径，并逆转录到胞浆。值得注意的是，SCFFbs1型特异性结合到ER膜细胞溶质表面含高甘露糖N-连接寡糖的蛋白质，并促进其泛素化和降解104结构研究发现Fbs1中有一个糖结合结构域（SBD），由一个10链β-三明治和两个α-螺旋组成38,101.鉴于男子8GlcNAc公司2被认为是未折叠糖蛋白上的主要N-聚糖，在ERAD中转运到胞浆，SBD结构域主要识别二糖GlcNAc2（壳二糖）在这个高甘露糖结构的基础上(). 糖蛋白的蛋白质部分和SBD之间只有有限的接触，这表明糖蛋白的糖成分决定了与E3连接酶的相互作用。然而，在天然糖蛋白中，糖-多肽连接被糖基化位点周围的蛋白质残基所屏蔽，因此糖基的壳二糖不太可能与Fbs1接触。Fbs1及其同工酶Fbs2与变性糖蛋白的相互作用更有效105因此，溶剂暴露于错误折叠的糖蛋白中的糖蛋白连接可能是这些泛素连接酶识别的初始步骤。
监护人的学位识别
衔接蛋白通过其同源E3介导PQC底物识别的概念并非HMGR降解所独有。酵母中的遗传分析表明，迄今为止几乎所有分析过的PQC底物的降解都涉及到特定的分子伴侣（参见参考106). 不同的伴侣在底物识别、泛素化和降解途径中具有不同的功能，但在大多数情况下，它们的确切作用尚未明确。一个例外是PQC相对特征明确的机制，涉及HSC70/HSP70/HSP40细胞溶质伴侣和哺乳动物U盒蛋白CHIP（HSC70相互作用蛋白的羧基末端）107,108除其U盒外，CHIP还具有一个与Hsp70和Hsp90结合的四三肽重复基序（TPR）。这种关联驱动各种伴侣客户端蛋白的泛素依赖性降解107,109-115.体外萤火虫荧光素酶CHIP依赖性泛素化的重建直接证明了CHIP是一种伴侣依赖性E3连接酶，在其未折叠状态下选择性泛素化蛋白质107CHIP本质上使用Hsp70或Hsp90作为底物再认识亚单位，结合客户蛋白的非结构区域，并将其定位为CHIP介导的泛素连接。然而，在没有Hsp70或Hsp90的情况下，CHIP也可以结合非天然蛋白质，这表明E3可以通过多种方式识别底物116.
泛素结扎决定因素
在大多数蛋白质中，多泛素链加成的首选受体位点是赖氨酸侧链。大多数泛素化多肽具有多个赖氨酸，但在某些情况下，只有一个或几个能有效泛素化117-121这意味着对于这些底物，泛素受体位点的位置或其周围的局部结构是去电子功能的决定因素。例如，酵母Sic1细胞周期调节器仅在其20个赖氨酸中的6个最N端上进行多泛素化体内，其中任何一个都足以支持正常的Sic1降解动力学122然而，在体外，该位点亚群中的多泛素链位置显著影响蛋白酶体对Sic1蛋白的水解速率。相反，许多蛋白质可以在不同的赖氨酸上泛素化，降解效率几乎不依赖于选择哪种特定赖氨酸（如果有的话）123-126底物或E3复合物（或两者）的结构灵活性可能允许各种底物赖氨酸残基靠近E2（或E3）活性位点中的泛素硫酯键，从而实现高效的泛素转移。
赖氨酸位置对泛素转移效率很重要的一个特殊情况是在E2s的自泛素化过程中。许多E2的赖氨酸与催化半胱氨酸非常接近，而这种赖氨酸是其自身-泛素化的主要靶点。锚定链的泛素分子从同一E2酶分子的活性位点转移到赖氨酸127-129这种赖氨酸在多种生物中不同E2之间的定位保持表明其对自身调节的功能重要性。泛素分子附着在E2活性位点附近可能会阻碍E2酶的活性，如UBE2T所示，泛素依赖性DNA修复途径中的E2酶在范科尼贫血患者中有缺陷127UBET2自身泛素化可能对该途径的负调控至关重要。
E2受体赖氨酸特异性定位的重要性通过研究酵母E2酶Ubc7的调节周转而得到强调130当Ubc7过度表达时，它在其活性位点Cys89上形成多泛素链，Cys89是Ubc7蛋白中泛素的唯一受体位点，并被蛋白酶体快速降解。与大多数E2不同，Ubc7在其催化核心附近不含赖氨酸残基，序列比对显示组氨酸位于赖氨酸通常占据的位置。用赖氨酸取代这种组氨酸似乎能够使多泛素链从活性位点半胱氨酸转移到赖氨酸侧链，这表明多泛素链组装的机制先于底物修饰。
现在有多种氨基酸（赖氨酸除外）作为泛素受体位点的例子。首先确定的是底物N末端残基（αN）的α-氨基。以这种方式连接多泛素链需要在基础泛素C末端和底物蛋白之间形成标准肽键（参见参考131). 这种翻译后泛素化模式的最有力证据来自于来自特定底物泛素化形式的胰蛋白酶肽的质谱测序。序列肽包括跨越泛素C末端二甘氨酸和底物N末端片段的片段132,133.
虽然赖氨酸和αN决定簇都通过伯胺与泛素相连，但泛素也能够与其他亲核蛋白侧链共价偶联。半胱氨酸残基可以与泛素形成硫酯键，当然，这是作为E1、E2和HECT E3类酶的标准酶中间体发生的。如前所述，酵母Ubc7 E2的催化半胱氨酸可以作为多泛素受体位点130，以及在体外数据表明多泛素链组装在哺乳动物酵母Ubc7同源物的活性位点半胱氨酸上134泛素也可以在非泛素结合酶的蛋白质中与半胱氨酸结合。例如，这发生在细胞表面的主要组织相容性复合体（MHC）I类分子的胞浆尾部，导致其内吞和溶酶体降解135最后，最近的证据强烈表明MHC-I尾部的丝氨酸和苏氨酸残基也可以泛素化体内 136因此，蛋白-泛素修饰可能比之前怀疑的更具灵活性。
结束语
从这一有限的调查中可以明显看出，降解子是泛素系统降解蛋白质的基本元素。前面的讨论集中在泛素依赖性简并子中的元素，它们在泛素连接酶结合和泛素-底物结合中起作用。一旦多泛素链连接到蛋白质上，蛋白质仍必须正确地进入蛋白酶体，展开然后降解。这些步骤取决于脱蛋白或蛋白水解底物的其他特征。例如，一些Lys48连接的多泛素链修饰的细胞蛋白也被证明能与蛋白酶体结合而不会伴随降解137-139在这些情况下，蛋白质底物可能缺乏适当的降解起始位点。几项研究表明，除了将底物束缚在蛋白酶体上外，degron还必须有一个结构更松散的肽段，该肽段可以开始展开并插入蛋白酶体中140-142.
本综述中总结的底物识别的一般原则应该是解决许多未解决问题的有用指南。我们对E3/E2复合物与底物蛋白结合的结构仍知之甚少，底物蛋白处于泛素转移的能力状态。蛋白质质量控制降解物的真实范围和种类尚不明确，包括可溶性和膜PQC底物使用相关或不同降解物的问题。多泛素链在底物上的组装机制可能因不同的E3/E2酶而异，目前的链组装模型尚待严格测试。其他令人烦恼的问题包括，不同链接的多泛素链的附着是否会导致蛋白酶体降解效率的差异，为什么不同的底物通过移动适配器蛋白直接靶向蛋白酶体和其他底物，以及当多泛素化底物到达蛋白酶体时，会发生哪些确切的分子事件。回答这些问题将使我们能够更全面地了解泛素-蛋白酶体系统是如何部署在与其相连的无数生理途径中的。
致谢
我们感谢J.Bloom、Y.Reiss和Y.Xie对手稿的有益评论。M.H.实验室的工作得到了美国国立卫生研究院的资助（GM046904、GM053756和GM083050）。T.Ravid由欧盟（拨款IRG-205425）和Lejwa生物化学基金资助。
词汇表
| 四氯化碳重复（TPR）图案 | 简并34-氨基酸序列的串联重复序列，介导蛋白质-蛋白质相互作用 |
| 指环域 | “真正有趣的新基因”基序由半胱氨酸和组氨酸残基的特定模式组成，这些残基与两个锌离子配位。该基序通过E2酶的募集和定位参与泛素连接 |
| HECT域 | （与E6-AP C Terminus结构域同源）。含HECT和RING域的蛋白质是E3泛素连接酶的两大类。与RING连接酶相比，HECT域连接酶在从E2酶转移到底物时与泛素形成一种重要的硫酯中间体 |
| F-BOX域 | 一种约50个残基的蛋白质基序，作为Skp1衔接蛋白的结合位点。F-box蛋白包含额外的蛋白质相互作用基序，如WD40或富含亮氨酸的重复序列，是SCF连接酶的底物识别亚单位 |
| UBR-箱 | E3泛素连接酶中的一个～70残基锌指状基序，用作N末端规则底物的底物识别域 |
| WD40重复 | 40个氨基酸的重复序列，具有一个特征性的Trp-Asp基序，首次发现于异源三聚体G蛋白的β亚基中，并参与蛋白质相互作用。F-box基序蛋白通常也有这些重复序列 |
工具书类
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