干细胞。作者手稿；PMC 2008年12月19日提供。
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特异性MicroRNAs调节胚胎干细胞衍生神经发生
,一 ,b条 ,b条和c（c）
安娜·克里切夫斯基
一美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院百翰女子医院神经病学系
Kai-C.桑塔格
b条美国马萨诸塞州贝尔蒙特哈佛医学院麦克林医院神经再生研究中心
艾萨克森
b条美国马萨诸塞州贝尔蒙特哈佛医学院麦克林医院神经再生研究中心
肯尼思·科西克
c（c）美国加利福尼亚州圣巴巴拉加州大学桑塔·巴巴拉分校神经科学研究所
一美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院百翰女子医院神经病学系
b条美国马萨诸塞州贝尔蒙特哈佛医学院麦克林医院神经再生研究中心
c（c）美国加利福尼亚州圣巴巴拉加州大学桑塔·巴巴拉分校神经科学研究所
摘要
MicroRNAs（miRNAs）是最近发现的小的非编码转录物，具有广泛的功能，主要在无脊椎动物中描述。作为基因表达的转录后调节器，miRNAs触发靶mRNA降解或翻译抑制。虽然已经从多种哺乳动物组织和细胞中克隆了数百个miRNA，并预测了多个mRNA靶点，但对其功能知之甚少。迄今为止，miRNA仅在造血、脂肪细胞和肌肉分化中发挥作用；胰岛素分泌调节；以及潜在的癌症生长调控。在这里，我们描述了小鼠胚胎干细胞（ES）体外神经发生中miRNA的表达谱，并表明在神经祖细胞向神经元和星形胶质细胞分化的过程中，许多miRNA同时被诱导。体外胚胎干细胞源性神经发生和体内胚胎神经发生中的miRNA表达谱之间存在明显的相关性。使用功能获得和功能丧失方法，我们证明脑特异性miR-124a和miR-9分子影响ES细胞衍生培养物中的神经谱系分化。此外，我们提供的证据表明，信号转导子和转录激活子（STAT）3是STAT家族通路的成员，参与这些miRNAs的功能。我们得出的结论是，不同的miRNA在ES细胞分化中的神经命运决定中发挥着功能性作用。
关键词：胚胎干细胞，微RNA阵列，微RNA，神经发生
介绍
最近发现的microRNAs（miRNAs）为动植物发育过程中的基因表达引入了一种新型调控[1,2]. miRNAs是18-25核苷酸（nt）的非编码转录物，由最初的长初级转录物衍生而来，由RNase III Drosha在细胞核中处理成~70-nt前体miRNAs[三]. 这些前体具有发夹结构，可被Dicer酶分解[4,5]释放成熟的miRNA。成熟的细胞质miRNA随后并入RNA-induced silencing complex（RISC），RISC是一种RNA-protein complex，可介导靶mRNA的切割或调节其翻译[2,6]. 在无脊椎动物中，还没有发现基因组序列与已知的miRNAs具有完美的互补性。一些部分互补的mRNA靶点已经被证实并显示可以控制广泛的细胞过程，包括发育时间、细胞增殖、细胞死亡和神经系统模式[1]. 似乎miRNAs可以形成广泛的调控网络，其复杂性与转录因子相当[7]. 在哺乳动物中，已经描述了大约250个miRNAs，但对其mRNA靶点和功能知之甚少。miRNAs的一个新兴功能是控制造血中的血统测定[8,9]. 这些研究表明，在早期造血和造血谱系承诺期间，一些miRNAs是动态调节的。其中一个miRNAs优先在B淋巴细胞中表达，其在造血干细胞中的异位表达导致B细胞比例的增加[8]. 这些结果以及大量miRNA的表达是细胞和组织特异性的观察结果[10-12]强烈提示miRNAs可能调节不同来源细胞的谱系分化。
miRNAs已被证明可以指定蠕虫神经系统中的细胞命运[13,14]鱼类的脑形态发生[15]它们在哺乳动物大脑发育过程中的不同表达模式也表明了它们在哺乳动物神经分化中的作用[1,16,17]. 然而，miRNAs在哺乳动物神经发生中的功能作用尚未被描述。利用设计用于检测miRNA表达的寡核苷酸阵列，我们证明了特定的miRNA在哺乳动物大脑发育过程中受到精确调控[16]. 为了扩展这些研究，我们现在分析了小鼠胚胎干细胞（ES）体外神经发生过程中miRNA的表达，并研究了miRNA在ES细胞神经分化中的可能功能。
材料和方法
ES细胞分化
小鼠囊胚衍生ES细胞系D3如前所述进行繁殖和维持[18]. ES细胞在体外分化为神经祖细胞、神经元和星形胶质细胞，遵循已发表的方案[19-22]修改了雀巢的收获方式+在第3阶段第6天（3:6）用miRNAs进行转染分析的前体。
miRNA表达分析
如前所述，从培养细胞中提取RNA并对miRNA进行Northern blot分析[16].
如前所述，执行并分析miRNA表达的寡核苷酸阵列[16]，但带有135个miRNAs的特异性探针。简言之，在Gene-Screen Plus膜上发现了三聚体DNA寡核苷酸探针（microRNA的反义）（PerkinElmer Life Sciences，Boston，http://las.perkinelmer.com)并永久固定。对于杂交，从总RNA中获得富含60 nt以下分子的RNA的低分子量部分，并用T4多核苷酸激酶进行末端标记。如前所述进行杂交和洗涤[16]. 实验包括每个分化阶段至少三个独立的RNA样本。为了确保杂交的准确性，每个RNA样本与三个膜杂交。测量了阵列每个点的杂交信号和15个空白点的背景值。原始数据在Microsoft Excel中进行了进一步的自动处理。未超过平均背景值三个以上标准偏差的杂交信号被排除在分析之外。归一化后，剩余数据在三份重复阵列中求平均值，得到的三个数据集（每个数据集对应一个RNA样本）被视为双尾双样本的独立测量t吨在比较不同发展阶段时进行测试。此外，三个数据集在三个RNA样本中取平均值，以生成给定发育阶段的表达水平集。每个miRNA在特定发育阶段之间的表达比率是以相应表达水平之间的比率计算的。
miRNA双链和2′-O（运行）-甲基寡核苷酸：制备和递送
对应于miR-9/9*、miR-124a、miR-22和miR-125b的RNA双链由Dharmacon（Lafayette，CO，网址：http://www.dharmacon.com)并按照建议进行退火[23,24]. 2′-O（运行）-Dharmacon化学合成的补充miR-9、miR-124a和miR-125b的甲基寡核苷酸完全由2′组成-O（运行）-甲基碱。
使用NeuroPorter试剂（GTS；基因治疗系统，加利福尼亚州圣地亚哥，http://genetherathysystems.com)根据制造商的说明，安装在24孔板中。简单地说，1.5μg稀释miRNA（2个双工体×0.75μg或4个双工器×0.375μg） 每口井的配方为3.75μl NeuroPorter试剂置于N2无血清培养基中。转染复合物直接添加到细胞中，24小时后用新鲜培养基替换。通过荧光素RNA双链转染评估，该方法导致90%以上的NP摄取miRNA。两个μ第g页，共2页-O（运行）-每孔甲基寡核苷酸的输送方式类似。转染后4至16天分析miRNAs对细胞发育的影响。
流式细胞术
流式细胞术（FCM）的程序改编自先前公布的方案[25]稍作修改。简言之，对处于体外分化不同阶段的细胞进行轻度胰蛋白酶化（0.05%胰蛋白酶/EDTA；Invitrogen）并在Ca中收获+-游离镁+-游离磷酸盐缓冲盐水（PBS）、2%胎牛血清、0.1%叠氮化钠。洗涤后，10μ添加g/ml碘化丙啶（瑞士布赫斯Fluka BioChemika），在将细胞固定在2%多聚甲醛溶液中20分钟之前再次清洗细胞。在第二步中，细胞在添加了0.5%皂苷（Invitrogen）的PBS中的湿冰上培养20分钟。在PBS/0.1%皂苷中使用一级和二级抗体（见上文）进行以下染色步骤。对于FCM，细胞通过尼龙网过滤，并在BD-FACS-Area细胞分选机中进行分析（Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ，网址：http://www.bd.com).
FCM分析与免疫染色和荧光末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）实验平行进行，它反映了这些技术在分化过程中检测到的趋势，例如巢蛋白减少+，Tuj1增加+，随后GFAP增加+以及五个分化阶段凋亡细胞的相对数量。
通过用DeadEnd荧光TUNEL系统（Promega，Madison，WI，网址：http://www.promega.com)根据制造商的说明，使用CaspACE分析系统（Promega）测量caspase活性。
统计分析
对于所有统计分析，包括来自Western blot实验的值，Octave软件（版本2.1.71；GNU，麦迪逊，威斯康星州，网址：http://www.octave.org)用于执行方差分析。A类第页0.05以下的值被认为具有统计学意义。
结果
ES细胞源性神经发生中miRNA的表达谱
我们使用了一种阶段控制的ES细胞分化方案，该方案包括胚胎体（EB）的形成、NP的选择和扩展以及神经分化（ND）为神经元和胶质细胞类型，这些细胞类型与体内的神经发生和胶质发生极为相似() [19-22]. 基于先前描述的miRNA阵列技术，用于研究发育中大脑中miRNA的表达[16]，我们首先确定了ES细胞分化为神经细胞群体的进展阶段中miRNA的表达谱。分析了以下阶段：ES（阶段1）、EB（阶段2）、NP（阶段3）和ND（阶段5）(). 还分析了初级皮层神经元，以确定神经元的模式特征。在本研究中，扩大了膜上探针的数量，以显示135种脊椎动物miRNAs的表达谱().
体外ES细胞源性神经发生过程中miRNA的表达。(A类)：本研究中使用的五阶段ES细胞分化方案示意图[19-22]. 不同阶段如下所示：ES；EB；前体，巢蛋白的选择+细胞；扩建，雀巢扩建+细胞；分化，神经分化为成熟表型。指出了miRNAs转染的次数及其对细胞发育的影响分析。(B)：免疫细胞化学显示ES细胞分化方案中主要成分的发育：神经元（Tuj1，绿色）和星形胶质细胞（GFAP，红色）。插图显示合成图像。在第5阶段第12天对细胞进行染色。(C)：对应于ES细胞分化的第5阶段的寡核苷酸阵列的代表性视图。(D类)：分化过程中诱导的miRNAs簇。分析了三个独立的RNA样本，分别对应于分化的每个阶段和PNs。归一化后，对三个数据集进行平均，以产生一组特定分化阶段的表达水平。从浅蓝色到深蓝色的颜色表示从分化的第1阶段到第5阶段上调的miRNAs的相对强度（浅蓝色对应低强度，深蓝色对应高强度）。(E类)：通过Northern印迹法验证从3期（NP）到5期（ND）诱导的miRNAs。一些miRNAs（miRNA-9*、-22和-125b）在分化方案的整个第5阶段（ND）保持其表达水平，而其他的（miR-9和-124a）仅短暂升高。MiR-19和MiR-292–3′表现出选择性表达模式。转移前用溴化乙锭染色法检测5S rRNA，以验证总RNA的载量相等。缩写：EB，类胚体；ES，胚胎干细胞；胶质纤维酸性蛋白；ND，神经分化；NP，神经前体；PN，初级神经元。
对miRNA阵列的分析表明，一半以上的miRNA在任何两个阶段之间至少发生了两倍的变化。其中，上调的集群()检测到下调的miRNA，以及具有更复杂表达模式的miRNA。上调的miRNA多于下调的miRNA，可能是因为阵列由从分化组织和细胞（包括大脑和初级神经元）克隆的miRNA组成[10,11]，而不是ES细胞表达的miRNAs[26]在制备阵列时还没有克隆。
由于miRNA的小尺寸和不同的G/C含量，miRNA靶杂交体的寡核苷酸探针的熔化温度差异很大，因此在技术上不可能以阵列形式实现每个miRNA的绝对特异性杂交[16,17]. 特别是，该阵列不区分仅相差一个或两个核苷酸的近家族成员。因此，我们通过Northern blot实验验证了miRNA阵列，并证实了阵列杂交所观察到的大多数表达谱变化(). 一个特别有趣的过渡是从NP阶段到早期ND阶段，这是一个miRNA表达有许多经验证变化的间隔期(). 在此过渡期间，内斯汀+神经前体扩张并获得神经元和神经胶质细胞表型[19-22]. 在这一转变过程中诱导的许多miRNAs与E13-E21间期神经元分化显著时大脑发育中上调的miRNA相同[16,17]在P19细胞的神经元分化过程中[12]. 在这组miRNAs中，一些保持了高表达水平，而另一些则随着细胞在培养中的进一步分化而下调().
miRNAs在神经前体中的过度表达
为了给那些在分化神经元中诱导的miRNAs分配功能，我们选择了五种在大脑和初级神经元中高度表达的ND诱导的miRNA（对应于四种前miR）() [10,16]. 其中，miR-124a和miR-9/9*在大脑中高度富集，而miR-125b和miR-22在各种组织中表达[12]. MiR-124a、-9/9*、-125b和-22在NP选择的第3阶段未被检测到，在第4阶段同时被联合诱导，并在第5阶段（ND）第3天和第6天达到最大水平（5.3和5.6）(). 该miRNA组的表达开始与培养中分化神经元的首次出现相关，范围从第4天（4.1）到第5天（5.1）(显示最早发病）。这些miRNAs的几乎同步诱导表明了其在分化中的共同作用。为了评估这种作用，并假设miRNAs靶向特定的mRNAs，我们在其表达开始之前在NPs中外源性过度表达这些miRNAs()目的是下调靶蛋白的早期表达。我们遵循“合理的siRNA/miRNA设计”规则，设计和合成具有与成熟miRNA序列相同的有义链和几乎互补的反义链的小siRNA样双链体（见材料和方法）。先前的研究表明，转染这种具有相对不稳定的感测链5′端的双工体，可以优先将该链并入RISC，从而确保其稳定性和功能性[23,24]. 对合成的正、反义RNA分子进行退火，生成四个miRNA双工体，并以不同组合转染到NP。该设计策略与高效阳离子脂质转染方法（通过荧光miRNA双链标记转染评估，miRNAs的摄取率高达90%）相结合，对所有检测到的miRNA双螺旋体都是成功的，并显示转染细胞中所有五种miRNA的瞬时高水平().
体外分化过程中miRNAs的过度表达。(A类)：内源性miRNAs miR-9、-22、-124a和-125b的诱导动力学。Northern blot分析显示，在NPs扩增（第4阶段）和早期分化（第5阶段，第1-6天）期间，这些miRNAs被诱导。(B)：NP中两个双工体（miR-9/9*和miR-124a）和四个双工物（miR-8/9*、-22、-124a和-125b）的过度表达（4个的混合）（第4阶段，第2天）。Northern印迹显示转染后48小时特异性miRNA的过度表达。缩写：EB，类胚体；NP，神经前体。
为了确定转染miRNAs对分化NP的影响，我们评估了多个参数，包括细胞增殖、特异性细胞标记物的出现、细胞死亡和分化5期（ND）的事件时间。在使用的方案中，NP的分化需要形成细胞-细胞接触，这是通过高密度培养细胞实现的，并导致形成混合细胞群的多层培养(). 在特定免疫标记后，通过在载玻片上手动计数来定量分析此类培养物中的不同细胞类型在技术上存在问题。因此，我们使用流式细胞术测定转染后不同时间神经元和星形胶质细胞样细胞的比例。针对细胞内标记物Tuj-1和GFAP的特异性抗体分别用于区分神经元和星形胶质细胞(). 此外，考虑到高水平的凋亡伴随着体外分化条件，我们用碘化丙啶（PI）染色培养物，以区分活细胞、凋亡细胞和死亡细胞。这些人群中的每一个都分别进行了分析().
培养第5天第6天采集的细胞的典型FCM分析的典型示例。上一行显示FSC/SSC（左面板）的细胞分布，以及PI/SSC分析中PI-阳性细胞染色分数的测定（中面板和右面板）。下一行显示了Tuj1的分数+（绿线）和总建筑面积+模拟转染培养物中的（蓝线）细胞（左面板）；miR-124a和miR-9/9*共转染培养物（右侧）；在miR-124a、miR-9/9*、miR-22和miR-125b共转染培养物中（中间面板）。本分析仅包括PI-阴性细胞（右上角）。缩写：PI，碘化丙啶；流式细胞术；FSC，正向散射；SSC，侧面散射。
该分析显示，当NP同时转染四个miRNA双工体组合时，神经谱系分化标记发生了重大变化。我们发现GFAP的比例+与未转染、模拟转染或转染到过度表达的无关RNA双链体的细胞相比，细胞数量显著减少(). 总的来说，在三个独立的实验中，我们观察到GFAP的量减少了46%-51%+细胞。这组miRNA的过度表达导致Tuj1的数量略有增加或没有影响+细胞。Tuj1之间的比率+和GFAP+因此，在文化中，明显转向了Tuj1+单元格(). 重要的是，对PI阳性细胞的定量分析以及caspase活性和TUNEL的评估表明，GFAP的数量减少+细胞与培养中该细胞群的选择性死亡无关(和数据未显示）。转染两种脑特异性RNA双链体miR-124a和miR-9/9*足以引起类似的效果（GFAP数量减少47%-55%+单元格）(). 然而，当miR-124a或miR-9/9*分别交付给NP时，我们无法检测到显著影响。
miRNAs过度表达对神经元和星形胶质细胞分化和细胞死亡的影响。(A类)：Tuj1的百分比+（黑色）和GFAP+不同miRNA转染条件下分化神经祖细胞中的（白色）细胞：未转染、模拟转染、混合转染（miR-9/9*、-22、-124a和-125b）、miR-124a+miR-9/9*和miR-125b+miR-22。图中显示了每个组合的三个培养重复的平均值，误差条表示标准偏差（使用方差分析，第页<.03用于GFAP的比较+模拟和混合转染细胞中的细胞，以及模拟和miR-124a+miR-9/9*转染细胞）。在这些实验的独立重复中，GFAP的相对数量也有类似的减少+与模拟转染培养物相比，在过度表达miR-9/9*和miR-124a的培养物中观察到细胞。然而，在单个实验之间，Tuj1的绝对百分比+和GFAP+细胞分化，这归因于ES细胞的异质性。(B)：为了补偿单个实验之间的差异，Tuj1的比率+至GFAP+测定了过表达特异性miRNA的不同组合的培养物中的细胞。在所有实验中，Tuj1显著增加+/GFAP公司+四个miRNA双链体或miR-124a+miR-9/9*联合转染后的比率。(C)：在不同miRNA转染条件下培养5天6期的PI-阳性（黑色）和PI-阴性（白色）细胞百分比：未转染、模拟转染、混合转染（miR-9/9*、-22、-124a和-125b）、miR-124a+miR-9/9*和miR-125b+miR-22。图中显示了每个组合的三个培养重复的平均值，误差条表示标准偏差。用miRNAs处理培养物不会影响PI-阳性或PI-阴性细胞的百分比。缩写：PI，碘化丙啶。
抑制miRNAs
最近，2′-O（运行）-甲基寡核苷酸是miRNA功能和miRNA-定向RISC活性的序列特异性抑制剂[17,27,28]. 这些分子在化学计量学上结合并不可逆地使miRNA失活，为在体内外破坏单个miRNA的功能提供了一个有价值的工具。我们使用2′-O（运行）-与miR-124a、miR-9或miR-125b互补的甲基寡核苷酸，以测试miRNA功能丧失对神经分化标志物的影响。在miRNA表达开始时，这些寡核苷酸在培养扩增过程中被转染到NP中，并在2-4天后通过Northern blots对细胞进行分析。这些分析表明，靶miRNAs显著减少()可能是由于与阻断寡核苷酸形成高度稳定的复合物，即使在用于Northern印迹的强变性条件下也无法检测到miRNA。这种效应具有序列特异性：每个miRNA都被相应的反义寡核苷酸阻断，而不是被扰乱或无关的寡核苷酸阻断。如上所述进行的FCM分析显示Tuj1之间的比率显著下降+和GFAP+用miR-9-blocking 2′处理NP时的细胞-O（运行）-甲基寡核苷酸(). 这一变化主要是由于Tuj1数量减少所致+神经元（减少29%-31%），而GFAP的比例+细胞略有增加。Tuj1的PI染色水平和caspase活性+和GFAP+细胞没有改变，表明观察到的效应与神经元凋亡增加无关。相反，miR-125b和miR-124a敲除均未对分化NP产生显著影响。
抑制miRNA对神经谱系分化的影响。(A类)：Northern blot实验显示，转染后48小时（第4阶段，第2天），用序列特异性2′-O-甲基寡核苷酸选择性抑制NP中内源性诱导的miRNAs miR-9、miR-124a或miR-125b。(B)：通过FCM分析miRNA抑制对神经分化的影响，如和Tuj1的比率+至GFAP+细胞测定。Tuj1显著减少+/GFAP公司+当miR-9单独被抑制（2′-OMe-9）或与miR-124a一起被抑制时的细胞比率（使用方差分析，第页< .05). 所示为每种条件下三次培养复制的平均值，误差条表示标准偏差。缩写：miRNA，microRNA；流式细胞术。
miR-124a和miR-9对STAT3磷酸化的影响
几个信号通路可能与ES细胞的神经元和胶质细胞分化有关[29,30]; 例如，信号转导子和转录激活子3（STAT3）通路的激活在神经元发育中起着重要作用，特别是在抑制神经元末端分化方面[31,32]并选择性地促进神经前体细胞沿胶质细胞谱系的分化[33,34]. 此外，多项研究表明，Tyr705的STAT3磷酸化导致其活化和核移位，随后与靶mRNA结合[35,36]. 因此，我们分析了STAT3 Tyr705磷酸化水平，发现其反义2′对miR-9的特异性抑制-O（运行）-甲基寡核苷酸导致磷酸化STAT3水平显著增加，而STAT3蛋白总水平稳定(). 另一方面，在过度表达miR-124a和miR-9的细胞中，STAT3磷酸化水平降低。这表明miR-9抑制剂对神经元分化减少的影响()可能通过STAT3激活介导，而过度表达miR-124a和miR-9的细胞中STAT3信号的减少可能导致我们实验中观察到的星形细胞谱系分化减少().
miRNA过度表达和抑制对STAT3 Tyr705磷酸化的影响。用抗STAT3和抗磷酸化-STAT3抗体进行的Western blot分析显示，转染miR-124a和miR-9/9*后磷酸化STAT3减少。相反，与模拟转染对照组相比，特异性2′-O-甲基寡核苷酸（2′-OMe）对miR-9的抑制导致磷酸化STAT3水平显著增加(第页< .05). 下部面板显示了针对总STAT3标准化的phopho-STAT3的相对水平。
讨论
miRNAs已被证明可以指定蠕虫神经系统中的细胞命运[13,14]斑马鱼的脑形态发生[15]，这些因素，以及它们在哺乳动物大脑发育过程中的不同表达模式，表明它们在哺乳动物的神经分化中发挥作用[1,16,17]. 然而，miRNAs在哺乳动物神经发生中的功能作用尚未被描述。在这里，我们证明，在体外ES细胞衍生的神经前体细胞中短暂过度表达或抑制脑特异性miRNAs可显著减少沿胶质细胞或神经元细胞系的分化，并可能改变神经发生和胶质发生之间的平衡。
对于体外神经发生，我们使用了先前发布的五步小鼠ES细胞分化方案，该方案类似于胚胎发生的几个步骤，例如EB形成和NP分化为神经元和星形胶质细胞[19-22]. 为了确定ES细胞分化过程中miRNA的表达谱，我们进行了miRNA阵列分析，并观察了在细胞发育的特定阶段各组miRNA的时间表达。由于多个miRNAs在NP向ND的转化过程中共同诱导，它们可能具有多靶点和胸膜营养性组合效应。此外，多个miRNAs可以协同靶向相同的mRNA，以组合方式调节编码蛋白的表达。这些情况意味着由共同表达的miRNAs网络产生的无限数量的不同调控组合可能导致高度复杂的细胞反应。在这项研究中，我们重点研究了五种在NP细胞向ND细胞过渡过程中同时诱导的高丰度miRNAs。在这些miRNAs中，miR-124a和miR-9几乎只在大脑中表达[12]也显示出对ES细胞衍生神经发生的显著影响。这些miRNAs在神经前体中的早期过度表达降低了GFAP的数量+细胞（星形胶质细胞）在培养中分化。单独或与miR-124a联合抑制miR-9表达导致Tuj1减少+细胞（神经元）。由于miR-124a在胚胎神经元中优先表达，而miR-9在神经元和神经胶质细胞中都表达([37]和我们未发表的数据），我们的结果表明，在NP中早期过度表达miR-124a可以阻止胶质生成，而miR-9的表达有助于神经生成。值得注意的是，这些miRNAs的过度表达或抑制也可能影响分化培养物中的其他细胞或因子。尽管带有Tuj1和GFAP特异抗体的流式细胞术可用于定量研究，以区分神经元和星形胶质细胞[25]、GFAP阳性的早期神经元（颗粒细胞）和来自脑室下区的星形细胞神经前体已被描述[38-40]. 因此，在我们的研究中观察到的miRNAs的作用可能在一定程度上是对一种常见的神经元和胶质前体细胞的影响，而这两种前体细胞都不属于这两种谱系。此外，值得注意的是，另一类小RNA分子dsRNA可以通过在转录水平上发挥作用来确定成年神经干细胞的命运[41]. 因此，神经命运的决定似乎会受到不同类型的小的非编码RNA调节剂的影响，这些调节剂参与转录和转录后调节。
大脑特异性miRNAs miR-9和miR-124a，我们确定为神经发生的介质，在哺乳动物中保存并与大脑中的多聚体相关[10,16]这表明他们至少在翻译层面上采取了部分行动。这两种miRNAs的数百个mRNA靶点已经通过计算预测出来[42-44]. 其中一些似乎与神经发生和/或胶质细胞发生有关；特别是，我们的结果表明miR-9和miR-124a作用于STAT3信号通路，靶向一些STAT3上游因子，而不是STAT3 mRNA本身。尽管STAT3的激活促进了发育中的中枢神经系统中星形胶质细胞的分化[33,34]并抑制神经干细胞的神经发生[32]STAT3信号在ES细胞神经和胶质生成中的作用尚不清楚。多种上游因子，包括Janus激酶、细胞因子（LIF和CNTF）及其受体（GP130、LIFR、CNTFR）和功能伙伴，都可能影响STAT3磷酸化。据我们所知，这些分子中没有一个一直被预测为miR-9和/或miR-124a的有效靶点。因此，需要结合生物信息学方法进行进一步实验，以确定miR-9和miR-124a在ES细胞衍生神经细胞分化中的分子机制。
总结
综上所述，我们证明不同的miRNAs可以在调节ES细胞的神经分化中发挥功能作用。此外，体外ES细胞源性神经发生和体内胚胎神经发生中miRNA表达谱之间存在明显的相关性[16,17]不仅验证了干细胞模型用于研究miRNA在神经发育中的调控，而且还表明miRNA可以作为哺乳动物大脑发育中神经命运决定的介质。我们的结果与先前报道的miRNAs在造血细胞谱系测定中的功能一致[8]和脂肪细胞发育[45]从而表明miRNAs作为参与调节哺乳动物细胞命运的分子的重要作用。我们的数据表明，miRNA具有介导ES细胞神经分化的能力，并提示了导致神经元和胶质细胞成熟的复杂调控机制中的新机制。
致谢
我们感谢Suresh Jasti、Jocelyn Gilmartin、Andrew Ferree和Jan Pruszak提供了出色的技术援助，并感谢Sophia Mc-Kinley在miRNA阵列分析方面提供的帮助。我们还感谢科西克实验室的成员进行了有益的讨论。这项工作得到了国家神经疾病和中风研究所的资助【NS46569授予K.S.K.，N539793授予O.I.】和美国国防部的资助（DAMD-17-01-1-0762授予O.I）。A.M.K.和K.C.S.为这项工作做出了同等贡献。
工具书类
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