用于神经形态分析的基因导向、细胞类型特异性稀疏标记

细胞类型特异性IRES-核心表达

为了表征细胞类型的特异性IRES-核心表达式，将每个目标行交叉到Z/AP公司记者行[22].在没有Cre介导的重组的情况下Z/AP公司该位点广泛表达β-半乳糖苷酶-一氧化氮融合蛋白（beta-geo）。Cre介导的重组激活β-地理编码序列，同时激活人胎盘碱性磷酸酶（AP）的表达，AP是一种热稳定的酶，通过GPI锚定定位于质膜[23],[24]以前的工作表明Z/AP公司神经元中的报告细胞导致AP在单个轴突和树突上的有效积累，这可以通过组织化学染色来观察[14].

四只老鼠IRES-核心；Z/AP公司在出生后的前两周内，用单剂量4-羟基三苯氧胺（4HT）处理细胞株，>1个月后采集组织，组织化学染色显示AP的分布。The specificities of theNFL-IRES-核心和ChAT IRES圆领汗衫在成人视网膜的平板上分析了线。如中所示图2A，中的AP-labelingNFL-IRES-CoreR；Z/AP公司小鼠局限于视网膜神经节细胞，每个神经节细胞向视盘投射轴突，而较少向水平细胞投射轴突（图中未显示图2A)视网膜中表达神经丝的两种主要细胞类型[25]如中所示图2C和D，中的AP标签ChAT-IRES-Corer公司；Z/AP公司小鼠局限于胆碱能（星爆）无长突细胞，可通过其特有的钉轮形态识别；这些是视网膜中唯一表达胆碱乙酰转移酶的细胞[26]在大脑和视网膜中，AP标记VAMP2-IRES-CreER；Z/AP公司在多种神经元和胶质细胞中观察到小鼠(图2B和数据未显示）。到目前为止，我们还没有观察到TH-IRES-芯调解的Z/AP公司视网膜中的重组，我们将其归因于多巴胺能无长突细胞的缺乏[（每只小鼠视网膜450个细胞；27]然而，如下文所述，在大脑中标记此线与儿茶酚胺能神经元的表达一致。

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图2

不同品系小鼠Cre重组酶活性的细胞型特异性IRES-核心敲门。

通过与Z/AP公司报告子和用4HT诱导稀疏重组。A、 在视网膜中NFL-IRES-核心该线在视网膜神经节细胞和水平细胞中显示出Cre介导的重组，每个神经节细胞都有一个投射到视盘的轴突；这里显示的图像仅显示视网膜神经节细胞。B、 在大脑中VAMP2-循环冷却器该线在神经元和胶质细胞中均表现出Cre介导的重组。C和D，在视网膜中ChAT-IRES-Corer公司该系表现出Cre介导的重组，仅在胆碱能（星爆）无长突细胞中进行。C框中的区域在D中以较高的放大倍数显示。比例尺：A和B中为0.5 mm；1毫米C。

稀疏遗传标记用于神经元形态可视化

图3A显示了一个200 um厚的振动切片中皮质锥体神经元（或其部分）的稀疏AP-标记示例NFL-IRES-CoreR；Z/AP公司大脑。单个焦平面上的亮场图像如所示图3B–D并证明AP组织化学显示精细过程的清晰度。标记神经元的稀缺性从未标记皮层的大区域可以明显看出。

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图3

稀疏重组允许可视化非重叠神经元过程。

A、 200微米的振动切片NFL-IRES-CoreR；Z/AP公司小鼠在P0处注射0.2 mg 4HT。在这一部分中，三个大神经元（或部分神经元）被标记在大脑皮层的一个半球。B–D，三个神经元在一个Z平面上的放大亮场图像。比例尺：0.5 mm。

一项视网膜神经元的调查表明，使用NIH-Image或等效软件可以完全重建AP标记的神经元的三维结构[15]在本研究中，我们将重建限制为每个厚截面平面上的二维投影，这是一个图像，我们将在下文中将其称为“跟踪”而不是“重建”，以区别于全三维重建。这种更有限的分析具有技术简单的优点，同时仍能说明（尽管是投影）所分析神经元的主要形态学特征。神经元轨迹的示例以及从中获得它们的相应Z堆栈图像的样本如所示图4.图4C显示了200μm切片中皮质锥体神经元的轨迹，如图3B。中的其余面板图4-显示了多极皮层神经元(图4A)、小脑苔藓纤维(图4B)，具有平行纤维的小脑颗粒细胞(图4D)和一个小的皮层锥体神经元(图4E)-来自300 um厚的截面。使用以1或2 um间隔采样的Z堆叠图像来准备跟踪。如中所示图3和​和4，4AP强度随神经元突起的类型和位置而有系统地变化，在体近端树突和锥体神经元顶端突起等区域最重，在神经生物素填充实验中观察到这些区域标记更强烈[28].

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图4

从成人大脑的厚冠状面追踪不同AP表达神经元的形态IRES-核心；Z/AP公司老鼠。

A、 大脑皮层下部的多极神经元。B、 小脑中的苔藓纤维。C、 皮质锥体细胞如图所示图3B.D，小脑颗粒细胞。E、 致密的皮质锥体细胞。A–D来自NFL IRES队员；Z/AP公司大脑，E来自ChAT-IRES-Corer公司；Z/AP公司脑；E中细胞的轨迹以低倍显示图5JA、B、D和E是从300 um厚的截面上追踪的，显示了相应Z系列亮场图像的样本。C是从一个200 um厚的截面上描出的；Z系列图像的示例如所示图3B.比例尺：0.2 mm。

对于视网膜神经节细胞CreER；Z/AP公司该方法将树突、轴突和轴突乔木（后者位于大脑的视网膜接受区）标记为与经典标记方法（如diI和神经生物素填充）获得的模式紧密匹配的模式(图2B; 参考文献15；以及T.R.、T.Badea和J.N.，未发表的观察结果）。如下所述，在具有延伸数毫米的复杂轴索的神经元中，我们观察到轴索内的染色强度没有明显变化。这些数据表明，4HT注射和牺牲之间超过1个月的延迟会使AP在轴突或树突树干的整个范围内大致均匀分布。

的一般属性CreER；Z/AP公司方法

为了使基因导向的细胞标记有助于分析神经元形态，4HT暴露后的Cre介导的重组应仅标记为～1/10⁴–10⁸神经元，取决于中枢神经系统的位置。在这里描述的系统中，这种低效率由四个因素的组合引起：（1）由IRES公司要素[34]; （2） 偶然发生的重组效率低下Z/AP公司与一对loxP位点指导切除数千个碱基的插入片段的其他结构相比，使其重组少约1000倍的位点[例如，在卷曲的5轨迹[35]和在溴3a和溴3b基因座（T.Badea和J.Nathans，未出版）；（3） 4HT的剂量和给药途径；以及（4）在出生后的后期使用4HT时，Cre介导的重组逐渐减少。

稀疏标记还需要以有丝分裂后细胞为靶点，以避免产生克隆相关的神经元簇。对于出生前发生神经元增殖的中枢神经系统区域（例如大脑皮层），在任何出生后年龄都可以通过注射4HT轻松实现；对于出生后神经元持续增殖的区域（如视网膜和小脑），4HT注射可以推迟到～P8–P10。此外，由于中国税务局,美国橄榄球联盟、和真实航向在增殖的祖细胞中，基因含量低或检测不到，而在相应的细胞中，Cre介导的重组IRES-核心无论注射4HT的时间长短，增殖祖细胞的敲除系也应较低。相比之下，在VAMP2-IRES-CreER；Z/AP公司在P2处注射4HT的小鼠小脑中产生数百个颗粒细胞的克隆（数据未显示），这意味着CreER公司来自VAMP2型增殖颗粒细胞祖细胞的位点。

AP组织化学的两个特性对于大神经元的形态学分析特别有用：（1）低分子量组织化学底物向固定组织的有效扩散；（2）AP反应产物的稳定性，其在组织清除剂苯甲酸苄酯∶苄醇（BBBA）中存活。底物和产品的这些属性允许处理和成像少量相对较厚的部分（200–400 um厚），从而最大限度地减少各部分之间具有技术挑战性的神经元过程对齐。我们还注意到，NBT/BCIP沉淀物在可见光照射下不会漂白或褪色，如果组织储存在乙醇中，沉淀物可以保存多年，不会出现明显的损失或扩散。这些属性有助于在许多成像会话中收集数据。虽然本研究中未使用AP活性，但通过产生磷酸铅沉淀物，也可以通过透射电子显微镜观察AP活性，从而促进光镜和超微结构分析之间的相关性[27].

基底前脑胆碱能神经元的大尺寸和复杂形态

具有位于基底前脑的细胞体的胆碱能神经元调节整个大脑皮层的细胞活动，具有广泛的生理效应。例如，胆碱能输入改变初级感觉皮层神经元的反应特性，增强对关联区域中行为显著刺激的反应，促进皮层对运动输出的控制，并调节血管张力[36],[37]目前的证据支持一种模型，即胆碱能神经传递调节神经元兴奋性，但不像谷氨酸能和GABA能传递那样携带点对点信息[36].

人们对前脑胆碱能系统的兴趣受到了以下观察的极大刺激：死后阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）患者大脑基底前脑中胆碱能神经元的胞体数量减少，大脑皮层中参与胆碱能传递的酶（如ChAT）平行丢失[38]–[41]唐氏综合征、帕金森氏病和其他多种进行性痴呆患者也有类似的损失[36],[42],[43]这些发现导致了增强胆碱能传递的药物的开发，作为部分改善这些疾病患者疾病症状的策略[44].

稀疏Cre介导的重组ChAT IRES船员；Z/AP公司小鼠可以看到单个前脑胆碱能神经元的完整轴突和树突树突。据我们所知，这是首次在任何物种中发现这些细胞的完整形态。早期的研究中，单个基底前脑胆碱能神经元通过注射神经生物素进行标记，发现它们的树突树干，但只是没有完全填满它们更大的轴突树干[45]本研究的惊人发现是，对于单个胆碱能神经元来说，轴突树干非常大，在>2mm的皮层表面积上有密集的分支²在鼠标中。这些细胞的大尺寸与一个简单的想法是一致的，即它们在各种退行性中枢神经系统疾病中的丢失可能反映出相应的高代谢负担和/或淀粉样沉积或反应性化学物质的高毒性损伤负担。沿着这些思路的想法在运动神经元疾病和周围感觉神经病的背景下获得了广泛的传播，在这些背景下，疾病的易感性增强与极长轴突的存在有关[46].

畜牧业

在目标等位基因的种系传播后PGK公司-新通过与生殖系中表达Flp的小鼠杂交来切除盒。在混合的Sv129×C57BL/6背景上保持株系。VAMP2-循环冷却器纯合子是看不见的，但其他三个IRES-核心品系可以保持为纯合砧木。所有四条管线均存放在杰克逊实验室，可免费使用。按照约翰·霍普金斯大学动物护理和使用协议和IACUC指南处理和饲养小鼠。

基因分型

如所示图1和表1，PCR基因分型TetR公司引物（引物C），是IRES-CoreER/TetR公司插入位点（引物A）和3′UTR反义引物3′IRES圆领汗衫/圆领汗衫插入位点（引物B）为未定位等位基因和敲入等位基因产生不同大小的PCR产物，从而区分纯合WT、杂合和纯合敲入基因型。用Advantage 2聚合酶（Clontech，La Jolla，CA）进行PCR，在94°C下进行35次30秒变性，在60°C下退火30秒，在72°C下伸长率为1分钟。快速测试是否存在Z/AP公司等位基因通过一小块尾巴的X-gal染色进行检测。

4HT注射和组织加工

这些程序基本上按照参考文献14所述执行。简言之，4HT溶于乙醇中，与葵花籽油（西格玛，圣路易斯，密苏里州）混合，在真空下离心以去除乙醇，并以0.05–0.4毫克/只小鼠的剂量在P0和P10之间进行单次腹腔注射。至少一个月后，将小鼠麻醉，并用4%多聚甲醛在PBS中经心灌注。将大脑放置在一块含有3%标准或低熔点琼脂糖的PBS中，并用振动棒切割一系列完整的300μm冠状切片。将PBS中的脑切片和完整视网膜在65°C的水浴中加热75分钟，以使内源性AP失活，对于嵌入低熔点琼脂糖的脑切片，则使组织周围的琼脂糖融化；然后将热灭活组织在NBT/BCIP中在室温下温和搅拌反应过夜。在清洗和固定后，组织用分级乙醇系列脱水，并在2∶1苯甲酸苄酯∶苯甲醇（BBBA）中澄清。为了长期保存，将组织样本放回乙醇中。AP染色的组织可以在乙醇中储存数年，外观不变。

作者感谢奇普·霍金斯（Chip Hawkins）的胚泡注射，感谢图多·巴迪亚（Tudor Badea）的建议，感谢斯蒂芬·伯杰（Stephen Berger）对细胞追踪的帮助，感谢图多·巴迪亚、刘春桥（Chunqiao Liu）和阿米尔·拉特纳（Amir Rattner）对手稿的有益评论。