跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
神经科学杂志。2008年6月4日；28(23): 5991–5999.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.1690-08.2008
预防性维修识别码：项目经理2597653
NIHMSID公司：NIHMS69281
PMID：18524904

Fgf20型发育中的耳蜗需要感官上皮规范

Toshinori Hayashi先生,1,2 凯瑟琳·雷伊,2和奥利维娅·伯明翰-McDonogh通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

组织特异性缺失Fgfr1级导致毛细胞和支持细胞发育严重缺陷(Pirvola等人，2002年). 尽管Fgfr1级在耳蜗发育的早期阶段，在这个阶段需要FGF信号的时间尚不清楚。因此，我们使用FGF受体抑制剂研究了耳蜗发育早期对FGF信号的需求。我们发现，从胚胎第14天（E14）到第16天，FGF信号的抑制对感觉上皮的发育有显著影响，导致毛细胞和支持细胞的严重减少，类似于关于Fgfr1级删除。FGF信号抑制对感觉规范的影响不能用细胞死亡增加或增殖变化来解释，而是导致豌豆3和Erm（错误）和损失数学1表达式。我们还发现，在耳蜗发育的感觉规范阶段，一种特定的FGF，FGF20，可能是FGFR1的配体；Fgf20型在适当的时间和地点表达，以调节感觉细胞规格，并用特定抗体阻断FGF20以类似于FGF受体抑制剂的方式抑制毛细胞和支持细胞发育。因此，我们的结果确定了FGF依赖性感觉细胞规范的时期以及在耳蜗发育中调节这一步骤的配体。

关键词：毛细胞、支持细胞、内耳、感觉发育、听觉、听觉

介绍

在哺乳动物中调节听觉功能的Corti器官是从耳板发育而来的。耳蜗最初形成于小鼠胚胎第12天（E12）腹内侧耳囊的外突(Morsli等人，1998年). Corti器官的毛细胞和相关支持细胞出生于E12和E16之间，从顶点到底部，大多数毛细胞出生于E24(鲁本，1967年). 几天后，毛细胞和支持细胞分化的时间梯度开始于耳蜗的中基底部，并沿整个上皮长度进行。通过E17–E18在小鼠体内实现毛细胞的成熟补充，即一排内毛细胞和三排外毛细胞(鲁本，1967年;Sher，1971年;Lim和Anniko，1985年).

成纤维细胞生长因子（FGFs）对Corti器官的发育至关重要。FGF形成了一个蛋白质大家族，在许多关键的发育过程中充当信号分子(Ford-Perriss等人，2001年;伊藤，2001;Ornitz和Itoh，2001年;伊藤和奥尔尼茨，2004年). 现在有超过23个不同的已知基因编码Fgfs公司在小鼠和人类以及四种FGF受体中(第1至4层) (Zhang等人，2006年). 在小鼠中，FGF3、FGF10和FGF8与耳囊泡的早期诱导事件有关(Mansour等人，1993年;Alvarez等人，2003年;Wright和Mansour，2003年;Ladher等人，2005年;Martin and Groves，2006年;Ohyama等人，2007年). 两种都缺乏的小鼠Fgf3型和Fgf10型不能形成耳泡。在耳囊发育的早期阶段，靶向性缺失特定亚型的小鼠也存在类似缺陷第二层（FGFR2 IIIB）(Pirvola等人，2000年)已提出FGF10和FGF3在耳板形成和图案化中作为FGFR2的配体(Pauley等人，2003年;Wright等人，2003年).

在耳蜗发育的下一阶段，在感觉规范阶段，FGF信号再次被认为是必需的。组织特异性缺失Fgfr1级导致毛细胞和支持细胞发育严重缺陷，并且这些发育的感觉细胞呈小簇状(Pirvola等人，2002年). 尽管Fgfr1级在耳蜗发育的这个阶段，这种效应的配体尚未确定。此外，该过程中FGF信令要求的精确时间尚不清楚。因此，我们研究了在耳蜗发育的感觉规范阶段对FGF信号的需求；我们发现，在发育早期使用FGF受体抑制剂抑制FGF信号传导，会导致毛细胞和支持细胞减少，类似于Fgfr1级删除。我们还发现，在耳蜗发育的这个阶段，一种特殊的FGF，FGF20，可能是FGFR1的激活物。因此，我们的结果确定了FGF依赖性感觉细胞规范的时期以及在耳蜗发育中调节这一步骤的配体。

材料和方法

胚胎耳蜗的器官培养。

外植体培养根据Hayashi等人（2007）简而言之，内耳组织是从E12.5–E15.0胚胎中分离出来的。耳蜗在37°C下用0.1%的dispase（Invitrogen）、0.1%的胶原酶（Invitrogen）和0.001%的DNase（Sigma）处理15分钟。使用镊子打开耳蜗囊，露出耳蜗导管。将耳蜗导管和耳蜗周围的间质放置在胶原/基质基质上。打开耳蜗导管，与抗FGF抗体一起孵育，使抗体能够到达上皮表面。

外植体在改良的DMEM/F-12培养基[DMEM/F-112（Invitrogen），0.6%葡萄糖，5 m米HEPES，0.13%NaHCO三，800牛顿米 我-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素（西格玛）、补充N2和20%胎牛血清]、5%一氧化碳2每天更换培养基。为了抑制FGF信号传导，3–30μ米将3-[（3-（2-羧乙基）-4-甲基吡咯-2-基）亚甲基]-2-吲哚啉酮（SU5402；钙生物化学）添加到培养基中。从研发系统中获得抗-FGF8、抗FGF20和重组FGF20。

免疫荧光。

根据Hayashi等人（2007）本研究中使用的主要抗体如下：兔抗Prox1（Millipore生物科学研究试剂），使用1:1000稀释液；以1:2000稀释度使用兔抗Myo6；山羊抗Sox2（Santa Cruz Biotechnology），1:1000稀释使用；以1:2000稀释度使用的兔抗p75（Millipore生物科学研究试剂）。使用的二级抗体为山羊抗鼠Alexa 594、鸡抗兔Alexa 59 4、驴抗羊Alexa 5 94和驴抗兔Alex 488，均来自Invitrogen，使用时间为1:750。图像通过蔡司-帕斯卡共焦或奥林巴斯FluoView系统拍摄，并使用ImageJ和Photoshop进行处理。

之后就地杂交后，用4%多聚甲醛（PFA）固定载玻片1小时，并在PBS中清洗。然后用10%胎牛血清和2%脱脂奶粉在PBS/0.1%Triton X-100（PBST）中孵育30分钟。用一级抗体（兔抗Myo6或鼠抗p27）孵育过夜基普1; BD Transduction Laboratories）在4°C下1:300稀释，用PBST冲洗切片，用荧光结合二级抗体孵育90分钟，再用PBST冲洗，并用Fluoromount G（Southern Biotechnology）盖玻片。使用SPOT CCD摄像头在蔡司Axioplan显微镜上拍摄图像，并使用Adobe Photoshop进行处理。

对于末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化UTP缺口末端标记（TUNEL）染色，耳蜗外植体在4%PBS中固定2h并在PBST中清洗。外植体与3μ/ml末端脱氧核酸转移酶（Promega）和5 m米Alexa 546-共轭dUTP在37°C的PBST中保持2小时。

现场杂交。耳蜗外植体用4%PFA固定2h，并在乙醇/二甲苯系列中脱水。样品在PFA中再水化。对于该部分就地在室温下，将整个封头（E13.5、E15.5和E18.5）固定在改良的卡诺伊溶液中6小时。样品在4°C的100%乙醇中清洗和脱水过夜，并嵌入石蜡中，收集6μm切片。每个时间点至少检查三只动物。鼠标企业风险管理和豌豆3cDNA从Open Biosystems获得，cDNA编码小鼠Fgfr1级和第二层是P.Soriano博士（华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心）赠送的礼物。小鼠cDNASox2系统是H.Kondoh博士（日本大阪大阪大学）赠送的礼物。小鼠cDNAFgf20型是S.L.Mansour博士（犹他州盐湖城犹他大学）的礼物，以及Fgfr公司4是a.McMahon博士（马萨诸塞州波士顿哈佛大学）的礼物。根据DIG-11-UTP（罗氏）制造商手册制备地高辛（DIG）标记探针，并根据Hayashi等人（2007）. The就地使用抗DIG碱性磷酸酶偶联二级抗体（Roche）和NBT（硝基四氮唑）/BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸）对产物进行可视化。

耳蜗RNA的定量PCR分析。

从有/无30μ米SU5402使用TRIzol（Invitrogen）。每个实验准备三个独立的RNA池。cDNA由Superscript III逆转录酶（Invitrogen）合成，使用随机引物和2.5μg总RNA作为模板，并使用cDNA和以下引物集进行定量PCR（Q-PCR）（引物库鉴定）：企业风险管理（24528550a1）和豌豆3（6679271a2）。使用光学监测器（遗传技术）进行Q-PCR，并记录达到对数相位的周期。PCR使用SYBR绿色母体混合物（Applied Biosystems）。所有样本均归一化为GAPDH公司（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。

结果

体外FGF信号分析

我们所知道的关于FGF在小鼠耳蜗发育中的作用的大部分信息来自对敲除小鼠的分析。尽管这些实验对于在耳蜗发育过程中涉及特定FGF或受体非常有价值，但很难确定FGF信号的时间要求，因为该基因在整个耳蜗发展过程中被删除。然而，有几个组使用了在体外定义耳蜗发育中需要诱导信号事件的关键时期的方法。为了确定耳蜗发育的时期，当感觉上皮的形成需要FGF信号时，我们用FGF受体小分子抑制剂（SU5402）处理外植体培养物。SU5402是一种高效的FGF受体抑制剂(Mohammadi等人，1997年)并曾在耳蜗发育后期使用，以检查支持细胞发育对FGFR3的需求(Mueller等人，2002年;Jacques等人，2007年). 我们通过使用30μg的E18培养液治疗E18培养物，验证了SU5402治疗现象复制了耳蜗发育后期FGF受体缺失的影响米SU5420 48小时；与之前的研究一致，对耳蜗发育的影响与Fgfr3级敲除：柱细胞无法形成其特征形态（内外毛细胞行之间没有明确的空间，表明柱头），并且不表达p75（补充图1A类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

为了确定前感觉期需要FGF信号传导的时间，我们从E12.5、E14或E15中制作外植体培养物，并处理它们40小时；然后取出SU5402，将外植体培养不同时间，如所示图1A类将外植体固定并标记Sox2和肌球蛋白6（Myo6）或Sox2与Prox1的组合，以确定感觉上皮（定义为Sox2+区域）的整体范围以及该区域内毛细胞和支持细胞的数量（分别为Myo6+或Prox1+）。我们发现用30μ米SU5402在三个周期中的每一个都会导致毛细胞数量的减少(图1B类)，但当外植体从E14处理到E16时，发现最大程度的减少(图1C类,D类). 毛细胞数量从对照培养物中的1422（±263.3）减少到30μ米SU5402处理的E14–E16培养物(图1B类). 在此最敏感时期（E14–E16）毛细胞的减少与剂量有关（对照组，1422±263.3；3μ米, 1204 ± 343; 15 μ米, 778 ± 192; 30 μ米, 52 ± 20). 15μ米(第页<0.002）和30μ米(第页<0.0001）与对照组相比有显著差异。这些形成的毛细胞被组织成小簇(图1D类)，类似于在条件Fgfr1级删除(Pirvola等人，2002年). 用SU5402处理的所有外植体（12个外植体中的12个）从E14到E16都显示出毛细胞簇，这些簇从外植体的底部到顶端都可以看到。当外植体在E12处处理时，10个外植体中的6个显示出减少的无簇的截短感觉上皮，10个外植体中有4个显示出除截短上皮外的毛细胞簇。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250001.jpg

FGF受体抑制对毛细胞发育的影响。A类，实验设计。采用三种不同的治疗方案来确定FGF受体抑制毛细胞发育的敏感期。线的开始表示耳蜗移植和开始治疗的时间；该行的黄色部分显示SU5402添加到培养基中的时期。所有外植体培养至E18.5的当量。B类，不同处理组的对照（蓝色条）和处理（黄色条）外植体毛细胞数量图。抑制E14至E16的FGF受体对毛细胞数量的影响最大，尽管所有治疗方案都显示出显著效果(*第页< 0.0005). 图中的每一条代表六个外植体的平均值。误差条指示SD。C类,D类，控制(C类)并经过处理(D类)文化。用Sox2（红色）和Myo6（绿色）抗体对外植体培养物进行免疫标记。C′,D′，面板中装箱区域的更高放大率图像C类和D类.E类,F类，控制(E类)并进行了治疗(F类)取自Math1–GFP小鼠的外植体，用p75免疫标记以显示柱细胞。

使用Math1–GFP菌株的外植体证实毛细胞数量减少(图1E类,F类). 有趣的是，如p75免疫反应所示，SU5402处理的培养物中发育的支持细胞主要是柱状细胞(图1E类,F类). 我们还发现SU5402治疗会导致培养物中发育的支持细胞数量严重减少。我们用Prox1抗体标记治疗和对照培养物(图2)，支持细胞标记(Bermingham-McDonogh等人，2006年)发现Prox1+细胞数量显著减少(图2C类). 与处理过的培养物中的毛细胞一样，剩余的支持细胞有时也聚集在小玫瑰花丛中(图2B类,B′,C类).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250002.jpg

FGF受体抑制对支持细胞发育的影响。外植体培养中的支持细胞通过Prox1免疫标记（红色）进行鉴定。A类,B类，控制示例(A类)并进行了治疗(A类)外植体培养。A′,B′，中装箱区域的高倍图像A类和B类.C类，不同处理组的对照（蓝色条）和处理（黄色条）外植体Prox1-阳性支持细胞数图。图中的每一条代表六个外植体的平均值。误差条指示SD(*第页< 0.0001).

FGF受体抑制对感觉细胞发育的影响很快。我们分析了FGF信号下游的两种转录因子在其他系统中的表达，豌豆3和企业风险管理SU5402治疗后豌豆3和企业风险管理在上皮和间质中下调(图3A–D). 通过Q-PCR分析，我们确认在使用SU5402治疗的12小时内两者都显著减少(图3E类). 此外，我们分析了数学1表达式使用就地SU5402处理后杂交(图3F–H（飞行高度）).数学1解剖时耳蜗中没有表达(图3F类)，但在对照培养物中，它在24小时内表达(图3G公司); 然而，在SU5402处理的培养物中，数学1在耳蜗中未表达(图3H（H）). 有趣的是数学1此时前庭上皮不受影响(图3F–H（飞行高度），V）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250003.jpg

SU5402治疗迅速下调ERM和Pea3，并抑制Math1的表达。A–DERM和Pea3的表达模式就地E14.0耳蜗组织块的杂交(A类,B类)或使用(C类,D类) 30 μ米SU5402持续24小时。比例尺，100μm。E类Q-PCR显示，在SU5402治疗后12 h，ERM和Pea3的表达降低(*第页< 0.02).F–H（飞行高度）,现场耳蜗外植体中Math1的杂交。F类，培养前的外植体表明，在此阶段（E14），Math1尚未表达。G公司，在对照条件下培养的外植体在培养24小时后出现Math1。H（H）SU5402处理的培养物在培养24小时后未显示Math1的表达，尽管前庭上皮（V）的表达不受处理的影响。比例尺，500μm。

为了确定SU5402处理的培养物中毛细胞和支持细胞的减少是否归因于细胞死亡，我们使用TUNEL染色定量了处理和对照E14外植体培养物中Sox2+域中凋亡细胞的数量。在SU5402治疗40小时后，我们未发现治疗组和对照组培养物中Sox2+域内凋亡细胞的数量存在显著差异（对照组：96±20，n个= 5; SU5402治疗：139±20，n个= 5;第页=0.124，学生的t吨测试）。SU5402治疗对毛发和支持细胞发育的影响也不太可能归因于抑制祖细胞向这些细胞的增殖，因为我们在大多数耳蜗中的某个时间（E14）看到了SU5402的治疗效果，毛细胞和支持细胞的前体已经退出细胞周期(鲁本，1967年;Lee等人，2006年). 我们用溴脱氧尿苷（BrdU）培养E14.0 Math1–GFP耳蜗40小时，并在整个培养期间将BrdU添加到培养基中。我们在感觉上皮中发现了一些BrdU+（<20）细胞，如表达Math1–GFP的毛细胞所定义的，但这些仅限于基底，而不在毛细胞中（补充图2C类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。在耳蜗发育的早期阶段（E12–E14），感觉上皮内仍有有丝分裂细胞，因此阻断FGF受体的一些作用可能归因于毛细胞祖细胞增殖的减少（补充图2A类,B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。然而，在耳蜗发育的后期（>E14），绝大多数毛细胞祖细胞已经退出有丝分裂周期，因此我们观察到的SU5402治疗的效果并不是由于抑制增殖。

的表达模式Fgf20型及其在发育中的感觉上皮中的信号成分

在一个就地我们发现，筛选已知的FGF是调节耳蜗发育的良好候选基因Fgf20型在耳蜗发育的不同时期，即从E13.5到E16.5，在假定的感觉上皮结构域中高度表达(图4). FGF20是FGF9亚家族的成员。FGF9亚家族激活所有FGFRc亚型(Zhang等人，2006年). 在E13.5中Fgf20型出现在基地(图4A类，第1圈），但不是顶点(图4A类，转动2）。的表达式Fgf20型在E14.0–E15.5耳蜗的所有转弯处持续存在(图4B类,C类). 在E16.5处，Fgf20型仍然表现在顶点的转折处(图4D类，第3和第4轮），但在底座中仅显示非常低的表达水平(图4D类，第1圈和第2圈，D′). 因此，Fgf20型表示为从底部向顶点扩散的波浪，然后以类似的模式下降。确定Fgf20型,Fgfr1级、和Sox2系统我们比较了这些基因在相邻片段中的表达模式。胎儿生长因子20和Sox2系统在E14和E15的表达模式基本上重叠(图5A–D,G公司).Fgfr1级显示了更分散的表达模式(图5E类); 然而，它在E15.0发育中的感觉上皮区域上调(图5F类)，并且这种上调从底部扫向顶点。Fgf20/Sox2表达式与重叠Fgfr1级表达；然而Fgfr1级在发育过程中，感觉上皮比Fgf20型领域(图5H（H）,我).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250004.jpg

发育性表达模式胎儿生长因子20.耳蜗匝从底部（1）到顶点（2-4）进行编号。A类，的表达式胎儿生长因子在发育中的耳蜗底部E13.5处为20。B类,C类，的表达式Fgf20型E14.0处(B类)和E15.5(C类)延伸到顶点。D类，的表达式Fgf20型在E16.5，毛细胞在顶端减少，在基部几乎消失，毛细胞正在分化，如该切片的Myo6染色所示(D′). 在所有面板中，顶点位于左上角。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250005.jpg

Fgf20型,Sox2系统、和Fgfr1级在发育中的耳蜗中以类似的结构域表达。A类,C类,E类，E14.0耳蜗相邻部分。B类,D类,F类，E15.0耳蜗相邻部分。耳蜗旋转从底部（1）到顶点（3）进行编号。G–I型，为了直接比较表达域，显微照片B′,D′、和F′使用Adobe Photoshop进行假彩色覆盖。G公司,Fgf20型(B′)与Sox2系统(D′).H（H）,Fgf20型(B′)与Fgfr1级(F′).我,Sox2系统(D′)与Fgfr1级(F′). 比例尺，100μm。

发育中感觉上皮中FGF受体及其下游靶点的表达模式

我们检查了所有四种FGF受体的表达模式，以确定哪些FGF受体可能作为FGF20的受体。Fgfr1级和第二层都在耳蜗发育的早期胚胎阶段表达(图6A类,B类).Fgfr1级在耳蜗上皮和E13.5处有一定的扩散表达模式(图6A类和补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），但在耳蜗上皮的腹侧区域表达更高(图6A类，箭头）。这种较高的腹侧表达在E 15.5变得更加明显(图6F类，箭头）。Fgfr1级也表达于间充质细胞(图6A类). 相反，第二层表达于耳蜗导管背外侧区，在假定的血管纹和发育中的螺旋突起中，在我们检查的所有阶段(图6B类,G公司,M（M）).Fgfr3级在E13.5–E15.0时在耳膜细胞中表达，但在耳蜗管中不表达(图6C类、箭头和补充图3，可从网址：www.jneurosci.org作为补充材料），但在开发的后期阶段（E15.5和E18.5），Fgfr3型表情描绘了感官领域(图6H（H）,N个和补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些表达模式表明Fgfr1级是FGF20最可能的受体，因为它在正确的时间和地点表达。Fgfr4型在间充质细胞中表达，但从未在发育中的感觉上皮中表达（补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250006.jpg

发育性表达模式胎儿生长因子受体和下游靶点。所有面板都显示了耳蜗导管的基底转向。A类,Fgfr1级在E13.5发育中的耳蜗以及周围的间质中广泛表达。F类,L（左），表达更集中于耳蜗腹管，尤其是E15.5处假定的感觉上皮区(F类); 当毛细胞在E18.5分化时，表达下调(L（左）).B类,G公司,M（M）,第二层仅在E13.5处发育中的耳蜗管外侧区表达(B类)，E15.5处(G公司)和E18.5处(M（M）). 这是将产生血管纹的区域。C类,H（H）,N个,Fgfr3级E13.5中未表示(C类)但在E15.5处的感觉区特异性表达(H（H）)，这种表达仅限于E18.5的柱细胞和Deiters’(N个).D类,E类,我,J型,O（运行）,P（P）、企业风险管理(D类,我,O（运行）)和豌豆3(E类,J型,P（P）)，FGF信号的下游靶点也在E13.5中表示(D类,E类)并集中到假定的感觉域（通过p27染色在K（K）)E15.5处(我,J型)并在E18.5的发育柱和Hensen细胞中继续表达(O（运行）,P（P）).问，发育中的毛细胞标记有Myo6，与P（P）.

我们还检测了FGF信号的潜在下游靶点/效应器在Fgf20型表达式。豌豆3和Erm（错误）已知通过FGF信号传导进行转录调控。两者都有Erm（错误）和豌豆3E13.5在耳蜗导管腹侧区域广泛表达(图6D类,E类). 在接下来的几天里，这种表达会局限于导管中产生感觉细胞的区域(图6I–K型). 在E18.5处，Erm公司和豌豆3只在发育中的柱状细胞和Claudius/Hensen细胞区表达(图6O–Q公司).

Fgf20型是感觉上皮发育所必需的

的表达模式Fgf20型我们认为这可能是发育中耳蜗感觉规范期间FGFR1配体的候选配体。为了验证这个假设，我们从E12.5–E13.0开始培养耳蜗外植体，如上所述。然后，我们在一些不同浓度的培养物中添加了抗FGF20的阻断抗体，而姐妹培养物则获得了同等浓度的IgG对照抗体(图7). 单独使用IgG（60μg/ml）处理的培养物与未处理的外植体具有相似数量的毛细胞；当在E13处移植时，培养中发育的毛细胞数量介于E12和E14的值之间（比较图1B类). 然而，我们发现用抗FGF20抗体处理的培养物中的毛细胞受到剂量依赖性抑制（对照IgG，1011±200 vs 60μg/ml抗FGF20,88±42）。此外，那些形成的毛细胞被组织成小簇(图7B类,B′)类似于我们在SU5402处理的培养物中观察到的结果。加入重组FGF20蛋白可以缓解在抗FGF20存在下培养的耳蜗毛细胞发育受到的抑制。FGF20抗体与FGF20的比例为1:1，产生423±64个毛细胞，而仅抗体产生88±42个毛细胞(图7C类,D类). 我们无法使用更高浓度的FGF20（典型的抗体拯救实验），因为在外植体培养中，FGF20对间充质细胞的增殖有强大的影响，导致其快速过度生长。总之，我们的数据支持FGF20是正常毛细胞发育所必需的假设。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250007.jpg

抗-FGF20抗体抑制移植耳蜗培养中毛细胞的形成。A–C′，用对照IgG处理外植体(A类,A′)，30μg/ml FGF20阻断抗体(B类,B′)或用9μg/ml重组FGF20阻断抗体60μg/ml(C类,C′)从E13持续5天A′,B′、和C′是框中区域的高分辨率图像吗A–C由于山羊体内均产生Sox2和FGF20抗体，因此红色通道中的背景值较高。每个条代表五个外植体的平均值。毛细胞用Myo6（绿色）和Sox2（红色）抗体进行免疫标记。D类，毛细胞数量随抗FGF20（黄色条带）、60μg/ml IgG对照抗体（蓝色条带）、60μg/ml抗FGF20抗体加9μg/ml重组FGF20（rFGF20；绿色条带）浓度增加而增加的图。N、 外植体数量。误差条指示SD*第页< 0.02; **第页< 0.00002.

为了确定抑制FGF20是否会阻碍支持细胞和毛细胞的发育，我们使用Math1–GFP报告小鼠的耳蜗外植体，并用支持细胞标记物Prox1对其进行筛选。我们发现，用抗FGF20处理培养物会导致Math1表达的深度抑制(图8C–C〃)与IgG对照组相比。除了对毛细胞发育的影响外，我们发现FGF20的抑制也阻断了支持细胞的发育；与IgG对照培养物相比，经抗FGF20处理的培养物中Prox1+支持细胞的数量大大减少(图8C–C〃). 我们还用FGF8抗体（30μg/ml）处理培养物；在治疗的这个阶段，抗FGF8对毛细胞或支持细胞的发育没有影响(图8B′-B‴)，而如前所述，抗FGF8抗体在后期阻止了柱细胞的发育（补充图1B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250008.jpg

阻断FGF20抑制外植体培养中支持细胞的发育。用抗FGF20抗体处理外植体(C–C‴)，抗FGF8抗体(B–B‴)，或对照山羊IgG(A–A‴)来自E13的外植体持续5天。外植体来自Math1–GFP小鼠株，显示毛细胞（绿色），并用Prox1抗体（红色）标记以显示支持细胞。高倍图像取自相邻低倍图像中的方框区域。

讨论

我们研究了耳蜗发育早期对FGF信号的需求。我们发现，在发育过程中有一个特别敏感的时期（E14–E16），此时FGF信号的抑制对感觉细胞的发育有显著影响。抑制FGF信号传导对感觉规范的影响不是由于细胞死亡增加或增殖变化，而是由于豌豆3和Erm（错误）和抑制数学1攻击。我们还发现，一种特定的FGF，FGF20，在适当的时间和地点表达，以调节感觉细胞的规格；此外，用一种特定抗体阻断FGF20，以类似于FGF受体抑制剂的方式抑制毛细胞并支持细胞发育。因此，我们的结果确定了FGF依赖性感觉细胞规范的时期以及在耳蜗发育中调节这一步骤的配体。

以前的实验Pirvola等人（2002年）表明组织特异性缺失Fgfr1级导致毛细胞和支持细胞的发育出现严重缺陷。尽管这些实验确定了FGF信号在感觉细胞规范中的作用，但他们无法确定需要该受体的确切时间。我们的就地杂交结果表明Fgfr1级在E13到E16的假定感觉域中表达，我们使用SU5402的实验定义了E14到E16之间的最敏感期。鉴于Pirvola等人（2002年）提出FGF10可能是FGFR1在耳蜗发育早期的配体，最近的研究表明Fgf10型耳蜗发育中无毛细胞缺陷(Pauley等人，2003年). 另一种在胚胎发育期间也在感觉上皮中表达的FGF是FGF8。我们发现用抗FGF8的培养物处理对毛细胞发育没有影响，尽管我们确实发现了在以前的出版物中报道的柱细胞发育受到抑制。相反，我们的结果表明，在耳蜗发育的感觉细胞规范阶段，FGF20可能是FGFR1的配体，原因如下：（1）Fgf20型在假定的感觉上皮结构域中高度表达的时间很短，从E13.5到E16，这（2）与Fgfr1级FGF信号的两个潜在下游靶点的表达，企业风险管理和豌豆3; （3）用特定抗体抑制FGF20会阻碍感觉细胞的发育。FGF20已被证明对所有c-型FGF受体都有活性，首选受体FGFR3c(Zhang等人，2006年).Fgfr3级在发育中的耳蜗中也表达，接近FGF信号抑制对感觉细胞发育产生影响的时间；然而，我们认为它没有参与这一过程，原因有三。(1)Fgfr3级在E15.5之前不在耳蜗中表达，然后只在基底部表达（补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料），因此Fgfr3级只有在感官规格结束时才重要。（2） 更重要的是，Fgfr公司3只敲除小鼠的毛细胞和支持细胞数量没有减少(Hayashi等人，2007年); 相反，这些突变体中的毛细胞数量增加。如果我们观察到SU5402或抗FGF20治疗的效果是通过Fgfr3级（3）虽然FGF20对FGFR3的活性高于FGFR1，但只有两倍的差异，我们发现胎儿生长因子20高度表达，因此可能在发育中的感觉上皮中激活FGFR1c。

FGF20–FGFR1如何调节感觉细胞规格？Pirvola等人（2002年）得出的结论是，在条件Fgfr1级缺失可归因于其祖细胞增殖的减少。然而，在开发的早期阶段，很可能Fgfr1级调节细胞增殖，我们不认为毛细胞祖细胞增殖的减少可以解释我们的结果，因为SU5402治疗在耳蜗发育的E14到E16期间抑制毛细胞和支持细胞形成最为显著，当几乎所有毛细胞和支持细胞的前体都退出细胞周期时(鲁本，1967年;Lee等人，2006年)（补充图2，网址：网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。FGF20或FGF受体的抑制也不太可能通过增加培养物中的细胞死亡而导致毛发和支持细胞减少，因为我们没有发现对照组和处理组之间的凋亡细胞数量有显著差异。相反，我们认为FGF信号直接或间接负责Math1表达的上调，这种上调通常发生在耳蜗发育的这一阶段。FGF20对FGFR1的激活可能通过上调E26转化特异性（Ets）域转录因子的表达而起作用。在开发中果蝇属脉络膜器官，在神经前束簇中表达低水平的无调性。无调性的上调（以及对脉络膜前体命运的相应承诺）由受体酪氨酸激酶EGFR的激活触发，后者反过来上调Pnt公司（苍蝇豌豆3/ERM通过MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）途径表达。低水平无调性和高Pnt结合形成复合物，共同作用于邻近的电子盒和Ets-结合位点无调性的促发剂，用于驱动形成脉络膜前体所必需的高水平无调性(zur Lage等人，2004年). 哺乳动物耳蜗毛细胞分化开始时也可能发生类似的过程。与此模型一致，我们发现哺乳动物耳蜗中FGF信号的抑制会导致Pnt公司同系物豌豆3和企业风险管理并阻止Math1表达式的开始。

FGF20如何与当前耳蜗发育数据相匹配的模型如所示图9已知对耳蜗感觉上皮发育至关重要的最早因素之一是Sox2(Kiernan等人，2005a). 这种转录因子在Jagged1基因敲除小鼠中的表达减少，而Jagged2基因敲除鼠本身对发育的初级阶段至关重要(莫里森等人，1999年;Brooker等人，2006年;Kiernan等人，2006年). Hesr1和Hesr2在发育的这个阶段由Notch调节，并可能调节Jagged1信号(Hayashi等人，2008年). 在Hesr1/2表达后不久，我们发现胎儿生长因子20由假定的感觉上皮域内的细胞表达，作为Sox2+表达细胞的一个子集。在耳蜗发育的这个阶段，我们的数据显示FGFR1是该区域中唯一表达的FGF受体，因此FGFR1可能是FGF20的受体。FGF20至FGFR1的信号激活Ets结构域转录因子家族的下游成员Pea3和Erm，我们提出，它们直接或通过一种尚未确定的因子继续激活Math1的表达。Math1在感觉上皮中的表达导致毛细胞发育(伯明翰等人，1999年;Chen等人，2002年)这些细胞通过Jagged2和Dll1向周围细胞发出信号(Lanford等人，1999年;Kiernan等人，2005年b)直接支持细胞（Prox1+）命运(Bermingham McDonogh等人，2006年). 支持细胞通过后期的FGF信号进一步特化，FGF8从内毛细胞到支柱和Deiters细胞中的FGFR3(Colvin等人，1996年;Mueller等人，2002年;Shim等人，2005年;Hayashi等人，2007年). 虽然这个模型仍然是推测性的，但从我们的数据中可以清楚地看出，在Math1发病之前，感觉上皮发育中存在FGF20依赖性步骤；需要进行额外的调查以确定模型的细节。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns0230849250009.jpg

FGF信号在耳蜗发育感觉规范阶段的作用模型。

脚注

这项工作得到了美国国立卫生研究院DC005953、P30DC00466和P30HD002274以及听力再生倡议的支持。我们感谢Jane Johnson博士的Math1-GFP小鼠菌株；H.Kondoh博士、P.Soriano、A.McMahon和S.Mansour博士负责DNA探针；Thomas Reh博士对这份手稿发表评论；和Reh实验室成员进行有益的讨论。

工具书类

  • Alvarez Y、Alonso MT、Vendrell V、Zelarayan LC、Chamero P、Theil T、Bosl MR、Kato S、Maconochie M、Riethmacher D、Schimmang T。内耳形成期间FGF3和FGF10的要求。发展。2003;130:6329–6338.[公共医学][谷歌学者]
  • Bermingham NA、Hassan BA、Price SD、Vollrath MA、Ben-Arie N、Eatock RA、Bellen HJ、Lysakowski A、Zoghbi HY。Math1：内耳毛细胞生成的必要基因。科学。1999;284:1837–1841.[公共医学][谷歌学者]
  • Bermingham-McDonogh O，Oestere EC，Stone JS，Hume CR，Huynh HM，Hayashi T.小鼠耳蜗发育过程中Prox1的表达。《计算机神经学杂志》。2006;496:172–186. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Brooker R、Hozumi K、Lewis J.Notch配体具有对比功能：小鼠内耳中的Jagged1和Delta1。发展。2006;133:1277–1286.[公共医学][谷歌学者]
  • Chen P，Johnson JE，Zoghbi HY，Segil N.Math1在内耳发育中的作用：将感觉原基的建立与毛细胞命运决定分离开来。发展。2002;129:2495–2505.[公共医学][谷歌学者]
  • Colvin JS、Bohne BA、Harding GW、McEwen DG、Ornitz DM。缺乏成纤维细胞生长因子受体3的小鼠骨骼过度生长和耳聋。自然遗传学。1996;12:390–397.[公共医学][谷歌学者]
  • Ford-Perriss M，Abud H，Murphy M.中枢神经系统发育中的成纤维细胞生长因子。临床实验药理学。2001;28:493–503.[公共医学][谷歌学者]
  • Hayashi T，Cunningham D，Bermingham McDonogh O。Fgfr3缺失导致小鼠Corti器官毛细胞过度发育。开发动态。2007;236:525–533.[公共医学][谷歌学者]
  • Hayashi T、Kokubo H、Hartman BH、Ray CA、Reh TA、Bermingham McDonogh O.Hesr1和Hesr2可能是发育中耳蜗中Notch信号的早期效应器。开发生物。2008;316:87–99. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 伊藤N.FGF作为多功能信号分子：结构和功能的多样性。Seikagaku。2001;73:525–535.[公共医学][谷歌学者]
  • Itoh N，Ornitz DM。Fgf和Fgfr基因家族的进化。趋势Genet。2004;20:563–569.[公共医学][谷歌学者]
  • Jacques BE，Montcouquiol ME，Layman EM，Lewandowski M，Kelley MW。Fgf8诱导哺乳动物耳蜗中的柱状细胞命运并调节细胞模式。发展。2007;134:3021–3029.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiernan AE、Pelling AL、Leung KK、Tang AS、Bell DM、Tease C、Lovell-Badge R、Steel KP、Cheah KS。哺乳动物内耳的感觉器官发育需要Sox2。自然。2005年a；434:1031–1035.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiernan AE、Cordes R、Kopan R、Gossler A、Gridley T。Notch配体DLL1和JAG2协同调节哺乳动物内耳毛细胞的发育。发展。2005年b；132:4353–4362.[公共医学][谷歌学者]
  • Kiernan AE，Xu J，Gridley T.哺乳动物内耳感觉祖细胞发育需要缺口配体JAG1。公共科学图书馆-遗传学。2006;2：e4。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ladher RK、Wright TJ、Moon AM、Mansour SL、Schoenwolf GC。FGF8启动鸡和小鼠内耳诱导。基因发育。2005;19:603–613. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Lanford PJ、Lan Y、Jiang R、Lindsell C、Weinmaster G、Gridley T、Kelley MW。Notch信号通路介导哺乳动物耳蜗毛细胞发育。自然遗传学。1999;21:289–292.[公共医学][谷歌学者]
  • Lee YS，Liu F，Segil N.在Corti器官发育期间，p27Kip1转录的形态发生波引导细胞周期退出。发展。2006;133:2817–2826.[公共医学][谷歌学者]
  • Lim DJ，Anniko M.小鼠内耳的发育形态学。扫描电子显微镜观察。耳鼻咽喉学报增刊。1985;422:1–69.[公共医学][谷歌学者]
  • Mansour SL、Goddard JM、Capecchi MR。靶向破坏原癌基因int-2的纯合子小鼠在尾部和内耳有发育缺陷。发展。1993;117:13–28.[公共医学][谷歌学者]
  • 马萨诸塞州格罗夫斯·马丁·K。颅外胚层对Fgf信号的反应能力表明耳板诱导的两步模型。发展。2006;133:877–887.[公共医学][谷歌学者]
  • Mohammadi M、McMahon G、Sun L、Tang C、Hirth P、Yeh BK、Hubbard SR、Schlessinger J。成纤维细胞生长因子受体酪氨酸激酶结构域与抑制剂复合物的结构。科学。1997;276:955–960.[公共医学][谷歌学者]
  • Morrison A、Hodgetts C、Gossler A、Hrabe de Angelis M、Lewis J.小鼠内耳中Delta1和Serrate1（Jagged1）的表达。机械开发。1999;84:169–172.[公共医学][谷歌学者]
  • Morsli H，Choo D，Ryan A，Johnson R，Wu DK。小鼠内耳的发育及其感觉器官的起源。神经科学杂志。1998;18:3327–3335. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Mueller KL，Jacques BE，Kelley MW。成纤维细胞生长因子信号调节Corti器官中的柱细胞发育。神经科学杂志。2002;22:9368–9377. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Ohyama T，Groves AK，Martin K。迈向听力的第一步：耳板诱导机制。国际开发生物学杂志。2007;51:463–472.[公共医学][谷歌学者]
  • Ornitz DM，Itoh N.成纤维细胞生长因子。基因组生物学。2001;2：审查3005。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pauley S、Wright TJ、Pirvola U、Ornitz D、Beisel K、Fritzsch B。FGF10在哺乳动物内耳发育中的表达和功能。开发动态。2003;227:203–215. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pirvola U、Spencer-Dene B、Xing-Qun L、Kettunen P、Thesleff I、Fritzsch B、Dickson C、Ylikoski J.FGF/FGFR-2（IIIb）信号对内耳形态发生至关重要。神经科学杂志。2000;20:6125–6134. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Pirvola U、Ylikoski J、Trokovic R、Hebert J、McConnell S、Partanen J。FGFR1是听觉感觉上皮发育所必需的。神经元。2002;35:671.[公共医学][谷歌学者]
  • Ruben RJ。小鼠内耳的发育：末端有丝分裂的放射自显影研究。耳鼻咽喉学报增刊。1967;220:1–44.[公共医学][谷歌学者]
  • Sher AE。小鼠内耳的胚胎发育和出生后发育。耳鼻喉科。1971;285（补充）：1–77。[公共医学][谷歌学者]
  • Shim K、Minowada G、Coling DE、Martin GR.Sprouty2是一种小鼠耳聋基因，通过拮抗FGF信号调节听觉感觉上皮细胞的命运决定。开发单元。2005;8:553–564.[公共医学][谷歌学者]
  • Wright TJ、Mansour SL.Fgf3和Fgf10是小鼠耳板编码诱导所必需的。发展。2003;130:3379–3390.[公共医学][谷歌学者]
  • Wright TJ、Hatch EP、Karabagli H、Karabagli P、Schoenwolf GC、Mansour SL。小鼠成纤维细胞生长因子和成纤维细胞增长因子受体基因在内耳发育早期的表达。开发动态。2003;228:267–272.[公共医学][谷歌学者]
  • Zhang X，Ibrahimi OA，Olsen SK，Umemori H，Mohammadi M，Ornitz DM。成纤维细胞生长因子家族的受体特异性。完整的哺乳动物FGF家族。生物化学杂志。2006;281:15694–15700. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • zur Lage PI、Powell LM、Prentice DR、McLaughlin P、Jarman AP。EGF受体信号传导触发果蝇属通过刺激前神经基因自动调节来感知器官前体。开发单元。2004;7:687–696.[公共医学][谷歌学者]
文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会