跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
摩尔癌症研究。作者手稿；PMC 2009年9月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Mol Cancer Res.2008年9月；6(9): 1499–1506.
2008年8月22日在线发布。 doi（操作界面）：10.1158/1541-7786.MCR-07-2130
PMCID公司：PMC2597364型
NIHMSID公司：NIHMS61508标准
PMID：18723829

SIRT1通过改变线粒体代谢部分促进癌细胞对顺铂的耐药性

梁兴杰,1,2 芬克尔,三 丁武深,1 尹俊杰,4 阿道詹·阿萨洛斯,1和迈克尔·戈特斯曼1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

肿瘤经常对顺铂产生耐药性，顺铂是一种铂类药物，被用作当今化疗方案的基石，大大降低了其在临床上的用途。虽然已知顺铂耐药（CP-r）癌细胞通常生长较慢，对包括营养素在内的各种化合物的摄取减少，但肿瘤代谢对顺铂耐药的影响尚不清楚。研究发现，与顺铂敏感性（CP-s）亲代癌细胞相比，CP-r细胞中的2-脱氧葡萄糖摄取量因线粒体的功能障碍和形态改变而减少。CP-r细胞过度表达SIRT1，这是一种组蛋白去乙酰化酶，在DNA损伤反应和转录沉默中起着核心作用。在低糖培养基中培养药敏细胞可诱导SIRT1的表达，并增加细胞对顺铂的耐药性。SIRT1 SMART siRNA双链减少SIRT1的表达，使>20倍耐药的CP-r细胞对顺铂治疗的敏感性增加1.5至2倍，SIRT1 cDNA转染过度表达使CP-s细胞的顺铂耐药增加2至3倍。因此，我们的研究结果表明，SIRT1介导的葡萄糖使用减少和线粒体代谢改变是导致细胞对顺铂耐药的几个变化之一。

介绍

最初对治疗有积极反应后复发的肿瘤通常对化疗药物有耐药性。顺铂（顺二胺二氯折叠蛋白II），在DNA中相邻嘌呤之间产生加合物(1)是治疗人类各种恶性实体瘤和转移瘤最有效、应用最广泛的抗癌药物之一(2). 然而，癌细胞中顺铂耐药性的发展是临床治疗的主要障碍。顺铂耐药的几种机制已被推测，包括药物积累减少、细胞内巯基水平增加和DNA修复增加(三). 迄今为止，临床肿瘤对顺铂耐药的机制尚不完全清楚，尽管进行了深入的研究以确定耐药的基础。探讨顺铂耐药的机制对于提高顺铂的治疗指数和克服临床上出现的对该药物的耐药性具有重要意义。

我们发现，与CP-s细胞相比，CP-r细胞对各种化合物（包括葡萄糖等营养物质）的摄取减少(4,5). 当营养素缺乏时，成功的肿瘤生存策略需要动态改变其代谢。介导这些变化的分子机制基本上是未知的。一般来说，葡萄糖饥饿会引起广泛的反应，包括基因表达和生化活性的改变。最近，沉默信息调节器2（Sir2）与导致线粒体功能失调的广泛代谢适应有关。它作为组蛋白去乙酰化酶发挥作用，在营养限制条件下严格调节染色质稳定性、转录沉默、DNA损伤反应和衰老(6). SIRT1是Sir2的哺乳动物同源基因，与细胞的能量状态有关，因为SIRT1的活性依赖于NAD+/NADH公司+比率。SIRT1在调节细胞或生物体基因组稳定性、新陈代谢和对营养耗竭的抵抗力方面发挥着关键作用，并正在成为调节细胞存活以应对各种类型压力的关键因素(7,8).

为了探讨顺铂耐药的机制，我们分离了两个来源于人类KB表皮样腺癌细胞（KB-CP）和人类BEL7404肝癌细胞（7404-CP）的独立细胞群。我们实验室以前的工作表明，随着顺铂耐药性的增加，顺铂耐药（CP-r）细胞的生长速度和不同营养素的摄入显著降低(9,10). SIRT1是一种已知的营养代谢调节剂，在当前的研究中在CP-r细胞中进行了测量。CP-r细胞线粒体膜电位显著改变，线粒体超微结构异常，耗氧量减少，葡萄糖摄取减少。SIRT1在NAD高的CP-r细胞中过度表达+浓度。SIRT1 SMART siRNA敲除或SIRT1全长cDNA转染对SIRT1表达的调节改变了癌细胞对顺铂的耐药性。在低糖培养基中培养药敏细胞可增加SIRT1的表达，并增加细胞对顺铂的耐药性。这些数据表明，当葡萄糖稳态受到限制时，SIRT1有助于介导顺铂抵抗。

结果

CP-r细胞葡萄糖摄取和耗氧量降低

为了阐明癌症中顺铂耐药的机制，我们的实验室发现人类腺癌KB-3-1和人类肝癌BEL7404 CP-r细胞对多种不同营养素的摄取普遍存在缺陷(9,11). 我们以前的研究表明，CP-r细胞的细胞增殖率随着顺铂耐药性的增加而降低(10). 葡萄糖的利用被认为是肿瘤发展的一个重要特征。首次在不同时间点测量KB-3-1和BEL7404系列CP-r细胞的葡萄糖摄取。研究发现14-与敏感的KB-3-1和BEL7404细胞相比，CP-r细胞中的2-脱氧葡萄糖减少(图1A类). C的积累14-30分钟后测量，KB-3-1细胞中的2-脱氧葡萄糖比KB-CP 20多5倍，BEL7404细胞中的2-deoxyglucose比BEL7404-CP20多4倍。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms61508f1.jpg
CP-s和CP-r细胞的葡萄糖摄取和氧消耗

答：。C的积累14-2脱氧葡萄糖在CP-r KB-3-1和BEL7404细胞中降低。这些数字代表了具有标准偏差的三个单独实验的平均值。B。在CP-r电池中，通过ESR测量的耗氧量降低。对耗氧量进行了五次测量。所示为每个时间点测得的耗氧率与未处理样品中的耗氧速率。误差线代表标准偏差。

为了确定葡萄糖摄取减少对细胞通过糖酵解利用葡萄糖能力的影响，检查了耗氧速率。与观察到的葡萄糖摄取减少一致，在CP-r KB-3-1和BEL7404细胞中，通过血氧饱和度测定测得的耗氧量随着顺铂耐药性的增加而减少。CP-r KB-3-1和BEL7404细胞的耗氧量被抑制了30%至60%(图1B). 尽管环境中氧气有限，但癌细胞通常保持较高的糖酵解代谢和利用率。CP-r细胞耗氧量减少或糖酵解速率改变可能是肿瘤对抗癌药物敏感性降低的一个指标。

CP-r细胞线粒体功能障碍

经过一轮又一轮的抗癌药物筛选后，肿瘤可能会通过有缺陷的线粒体降低能量消耗。研究表明，细胞顺铂耐药导致葡萄糖摄取和氧气利用减少(图1A类和B)，我们试图测量线粒体膜电位（Δψ米)是整个质子动力的组成部分，因为它通过线粒体中葡萄糖和氧气的利用对氧化磷酸化很重要。Δψ米，用CBIC测量2（3） 通过流式细胞术，发现在CP-r细胞中较高(图2A类)，这与定量共焦显微镜测量一致，可以直接观察线粒体(图2B). KB-3-1和BEL 7404细胞的Δψ均增加米（在图2B)随着顺铂耐药性的增加。面板B中单个图像下的数字表示Δψ的值米在CP-s和CP-r细胞中。结合耗氧量的测量，这些结果表明顺铂敏感性（CP-s）细胞和CP-r细胞之间的代谢存在显著差异。与CP-s细胞中的线粒体相比，CP-r细胞中线粒体发挥着不同的代谢作用。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms61508f2.jpg
流式细胞术和共焦显微镜测定线粒体膜电位的极化

答：。流式细胞术测定线粒体膜电位。B。共焦显微镜测量线粒体膜电位。橙色表示红色[CBIC2（3）单体]和绿色[CBIC2（3）聚集体]的组合。数字是指共焦显微镜定量的相对任意线粒体膜电位值。C。电子显微镜观察CP-s和CP-r细胞线粒体的形态。实验中的代表性图像一式三份。

CP-r细胞线粒体形态的改变

不仅线粒体在CP-r细胞中表现出功能性改变，而且电子显微镜显示CP-r中的线粒体比CP-s细胞中的线粒体相对较小(图2C). 与Δψ一致米线粒体呈典型的核周染色模式，在大多数亲本细胞中呈纤维状、管状结构。然而，CP-r细胞的线粒体分散在整个细胞中，外观紊乱。此外，CP-r细胞的线粒体比CP-s亲本细胞的线粒体电子密度大得多。CP-r细胞线粒体嵴较厚且不规则(图2C类).

SIRT1过度表达与KB-3-1和BEL7404细胞顺铂抵抗增加相关

在哺乳动物细胞中，SIRT1水平可能在正常细胞向癌细胞生长的过程中发生变化(12). 此外，能量减少的生物生成可以通过增加SIRT1脱乙酰酶的表达来促进细胞的长期存活(13,14). 此外，SIRT1过表达与耐药细胞和肿瘤中MDR1表达增加有关(15). 与CP-r细胞中生物能量减少一致，在全细胞裂解物和细胞核部分中有更多的SIRT1表达。随着CP-r KB-3-1和BEL7404细胞中耐药性水平的增加，SIRT1表达增加3倍和5倍(图3A类). 通过半定量RT-PCR测定，与CP-s细胞相比，CP-r细胞中SIRT1 mRNA的表达也增加了（BEL CP-20细胞是2倍，KB CP-20细胞则是4倍）(图3B). 通过电泳凝胶的蛋白质染色和RNA琼脂糖凝胶的EB染色确定蛋白质或RNA的等载量。由于与CP-s细胞相比，CP-r细胞中标准蛋白（如肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白）的表达发生了变化，家政基因不能用作负荷控制(16,17). 这些SIRT1表达水平通过共焦显微镜证实。图像显示，与CP-s细胞相比，CP-r细胞细胞核中SIRT1的表达更高(图3C类). 此外，NAD+SIRT1过度表达的CP-r细胞中的浓度显著升高(图3D类)，这表明SIRT1需要NAD的存在+为了发挥作用。我们的结果表明，SIRT1在不表达MDR1的CP-r KB-3-1和BEL7404细胞中过表达。因此，SIRT1的过度表达可能是有或无MDR1表达的癌症耐药表型的标记物和/或调节剂。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms61508f3.jpg
SIRT1在CP-s和CP-r细胞KB-3-1和BEL7404细胞中的表达

答：。Western blotting检测SIRT1在CP-s、CP-r细胞KB-3-1和BEL7404细胞的全细胞裂解液中的表达。B。半定量RT-PCR检测SIRT1的表达。从每种类型的细胞中提取RNA，并使用特定的寡核苷酸进行三次RT-PCR分析。实验中的代表性图像一式三份。BCP、BEL7404-CP 20细胞；KCP、KB-CP 20细胞。C。共聚焦显微镜检测SIRT1的表达。红色染色显示SIRT1的表达与德克萨斯红结合抗体。用DAPI标记并安装在防褪色介质中的细胞核显示为蓝色。比例尺：20µm。D。北美+与CP-s细胞相比，CP-r细胞中的浓度增加。北美+浓度测量如所述材料和方法结果表示为平均值（SD）。各组比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行评估。当S.D.高于平均值的两倍时，采用非参数检验来评估差异。当P<0.05时，假设存在显著差异。结果显示为三个单独实验的平均值。条形图上的星号表示CP-r和CP-s细胞之间存在统计上的显著差异。

葡萄糖利用受限导致SIRT1过度表达增加顺铂抵抗

Rodgers等人(18)表明糖稳态受损与SIRT1表达相关。我们对KB-3-1和BEL7404细胞的研究表明，当葡萄糖从4.5 g/L降至0.5 g/L时，敏感细胞与培养基孵育时，SIRT1的表达增加(图4A类). 这些结果与营养限制培养的PC-12细胞中SIRT1水平增加相一致(19). 此外，由于有限的葡萄糖培养诱导SIRT1过度表达与顺铂耐药性增加有关(图4B).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms61508f4.jpg
低糖培养诱导SIRT1表达，增加细胞对顺铂的耐药性

答：。KB-3-1和BEL7404细胞在不同浓度（4.5、2、1和0.5 g/L）葡萄糖的培养基中培养3天。蛋白质提取物经标准化后用于SIRT1表达的Western blotting，肌动蛋白作为对照。具有代表性的图像显示为三份实验结果。B。低葡萄糖孵育增加了亲代CP-s KB-3-1和BEL7404细胞对顺铂的耐药性。接种在平板中的细胞用不同浓度的顺铂处理。结果表示为平均值（SD）。各组比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行评估。当S.D.高于平均值的两倍时，采用非参数检验来评估差异。当P<0.05时，假设存在显著差异。结果显示为三个单独实验的平均值。

SIRT1表达的改变介导癌细胞对顺铂的耐药性

为了进一步测量SIRT1表达对癌细胞顺铂耐药性的影响，我们建立了转染SIRT1 SMART siRNA的CP-r细胞和转染pCruzHA SIRT1全长cDNA的CP-s细胞。研究发现，与用非靶向随机siRNA转染的CP-r细胞相比，SIRT1 SMART siRNA双重转染可有效降低CP-r KB-CP20和7404-CP20细胞中SIRT1的表达(图5A). 在BEL 7404-CP20细胞中SIRT1表达减少5倍，在KB-CP20细胞中减少3倍。SIRT1表达的减少使CP-r KB-CP 20细胞和BEL7404-CP 20细胞对顺铂治疗的敏感性增加约1.5到2倍(图5B). 此外，当pCruzHA-SIRT1全长cDNA转染后，SIRT1在CP-s细胞中过度表达，72小时后通过Western blotting检测(图5C)，亲本CP-s KB-3-1和BEL7404细胞对顺铂治疗的耐药率分别增加3倍和2倍(图5D). 同样，转染全长WT SIRT1载体的PC-12细胞显示顺铂耐药性增加了3倍（数据未显示）。这表明SIRT1表达的改变可以直接介导KB-3-1和BEL7404癌细胞对顺铂的细胞耐药性。然而，众所周知，在CP-r细胞中经常会出现多种同时改变。CP-r细胞对顺铂的耐药性是CP-s细胞的20倍。SIRT1的表达改变是影响细胞对顺铂耐药性的变异之一，在这些精心设计的模型中，SIRT1表达的改变似乎绕过了10%-20%的顺铂耐药性。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms61508f5.jpg
SIRT1介导的细胞对顺铂耐药性的改变

答：。SIRT1 SMART siRNA转染可降低CP-r KB-CP20和BEL7404-CP 20细胞中SIRT1的表达。SIRT1表达通过特异性抗SIRT1抗体测定，肌动蛋白作为对照，通过Western blotting。该实验是三个独立实验的代表。B。在用SIRT1 SMART siRNA转染的CP-r KB-CP20和BEL7404-CP 20细胞中测量细胞活力。细胞计数试剂盒-8用于细胞活力测定，如方法和材料。所提供的数据代表了至少三个实验的平均值。C。pCruzHA SIRT1全长cDNA转染增加了CP-s KB-3-1和BEL7404细胞中SIRT1的表达。肌动蛋白被用作对照。该图像代表了三个实验。D。用pCruzHA SIRT1全长cDNA转染CP-s KB-3-1和BEL7404细胞，测定细胞活力。所提供的数据代表了至少三个实验的平均值。

讨论

细胞对顺铂的耐药性是多因素的，可能包括限制顺铂吸收和积累的机制、改变的修复机制以及促进细胞生存的变化(20). 我们以前的研究和其他人的工作表明，由于膜结合/转运蛋白减少和内吞减少，顺铂的摄取发生改变(9,21). 在这项研究中，我们发现SIRT1上调也与线粒体代谢改变相关，从而导致顺铂耐药。

众所周知，细胞通过线粒体中进行的氧化磷酸化获得高达95%的能量。糖酵解代谢途径的细微变化可能会影响能量生物合成反应和细胞面对压力的敏感性。哈珀等人确定并描述了一种区分耐药细胞和药物敏感细胞的细胞代谢策略(22). 根据这一策略，当葡萄糖受到限制时，耐药细胞利用非葡萄糖碳源（脂肪酸）消耗线粒体氧气，耐药细胞中的线粒体功能失调。异常的线粒体结构可能会对细胞代谢产生重大影响，尤其是对线粒体代谢，线粒体代谢在应激抵抗、染色质依赖性基因调节和基因组稳定性方面发挥着重要作用。支持线粒体作为顺铂毒性直接靶点的研究表明，线粒体数量减少的肠上皮IEC-6 rho（0）细胞比正常细胞对顺铂更具耐药性(23). 这与我们的结果一致，我们的结果表明，由于Cp-r细胞中线粒体的功能障碍和形态改变，2-脱氧葡萄糖的摄取减少。

此外，葡萄糖转运蛋白1（GluT1）是大多数抗糖尿病药物的常见分子靶点，它不再局限于CP-r细胞的质膜（数据未显示），这与我们之前报道的恶性CP-r细胞跨膜蛋白（多药耐药蛋白1，MRP1）的再循环缺陷类似(5). GluT1是基础葡萄糖摄取的介质，是人类癌症中的主要葡萄糖转运蛋白，在大多数癌细胞中表达。CP-r细胞中2-脱氧葡萄糖摄取减少可能是由于GluT1（将葡萄糖运输到肿瘤细胞的主要膜蛋白）的定位发生改变，其机制尚未阐明。Aft等人发现，谷氨酸转运体蛋白的过度表达与2-脱氧葡萄糖治疗的乳腺癌细胞葡萄糖摄取增加有关(24). 通过耗氧量和线粒体膜电位测定，CP-r细胞葡萄糖摄取中断与线粒体功能异常有关。先前发现SIRT1过度表达可通过与PC-12细胞中的PGC-1作用，减少耗氧量并改变线粒体生物神经发生(19). 鉴于氧气消耗与活性氧的生成有关，活性氧水平与顺铂毒性有关(25)这些结果可能对SIRT1如何调节顺铂耐药性具有重要意义。

单独限制葡萄糖利用会导致SIRT1在KB-3-1和BEL7404细胞中过度表达，并增加亲代CP-s KB-3-1和BEL74细胞对顺铂的耐药性。CP-r KB-CP 20和BEL7404-CP 20细胞的生物能量功能障碍表明，降低葡萄糖代谢也会导致SIRT1过度表达，从而使顺铂对KB-3-1和BEL74 04细胞产生耐药性。SIRT1过度表达如何导致顺铂耐药？顺铂在与DNA或RNA结合时扰乱核酸的结构和功能，从而导致肿瘤细胞被杀死。已知SIRT1能去乙酰化p53蛋白，该蛋白能识别并结合顺铂修饰的DNA(26). 有人提出SIRT1的脱乙酰化减少p53依赖性细胞凋亡以应对DNA损伤(27). p53和SIRT1之间的相互作用可能在DNA损伤和p53介导的DNA修复之间提供了分子联系。本文研究了CP-r细胞对多种细胞毒试剂的交叉耐药性，包括重金属、烷基化试剂和甲氨蝶呤(5,9)可以反映SIRT1介导的细胞凋亡的一般效应。

众所周知，SIRT1参与细胞代谢，为了发挥作用，SIRTl需要NAD的存在+然而，对于NAD是否+直接控制体内SIRT1活性(28,29). 在这项研究中，我们发现NAD+SIRT1过度表达的CP-r细胞中的浓度较高(图3D). 如果细胞NAD+浓度较低时，SIRT1脱乙酰酶活性会减弱，从而通过乙酰化形式的p53增加细胞衰老或凋亡的机会(30). Lai及其同事(31)通过证明在顺铂诱导的细胞凋亡过程中野生型p53的乙酰化增加，提供了这方面的证据。此外，NAD的要求+SIRT1的脱乙酰酶活性表明SIRT1可能参与NAD的代谢+作为代谢调节器。SIRT1可能起到桥梁的作用，协调代谢状态和与顺铂抗癌相关的关键靶基因的调控。因此，NAD较高+CP-r细胞中SIRT1水平有助于减少有效的凋亡途径。

CP-r细胞中脂肪酸合成、蛋白质合成和细胞生长等需要能量的过程受到抑制(9,10,32)可能通过SIRT1作为中央调制器的作用。在CP-r细胞中过度表达SIRT1可能通过靶向多种细胞因子导致更高的凋亡阈值。SIRT1可能通过其NAD发挥代谢传感器的作用+依赖性，将能量消耗与调节应激反应的转录程序联系起来。SIRT1对转录复合物的脱乙酰化通常与通过从某些转录因子（例如NF-κB、FOXO和p53等）的赖氨酸中去除乙酰基而减少的转录激活有关(8,30,33). 一些转录因子，如NF-κB、YB-1、mtTFA、Ets-1和AP-1被顺铂激活，并参与耐药和DNA修复(34). SIRT1可以作为一个支架来连接各种转录复合物。Brunet等人(8)发现SIRT1通过增强DNA修复增强了对足叶乙甙的抵抗，并且发现来自SIRT1基因敲除小鼠的胸腺细胞对电离辐射更敏感。因此，SIRT1的过度表达可能会使顺铂耐药性的转录依赖性反应从细胞死亡转向细胞存活。

顺铂耐药的细胞机制是多因素的，导致临床使用顺铂的严重限制。我们的研究表明，顺铂耐药反映了与CP-r KB-CP20和BEL7404-CP20细胞葡萄糖摄取减少相关的生物神经发生减少。CP-r KB-CP20细胞最初对顺铂的耐药性是亲代细胞的1152倍。有趣的是，相同的细胞在没有顺铂选择压力的情况下孵育94天后，对顺铂的耐药性增加了330倍，这降低了SIRT1的表达（Shen，DW，Gottesman MM，未发表的数据）。SIRT1过度表达使亲本CP-s KB-3-1和BEL7404细胞能够通过有限的营养培养存活，并导致CP-s细胞对顺铂治疗产生细胞耐药性。这与siRNA降低SIRT1的效果一致，siRNA使CP-r细胞对顺铂治疗敏感。我们目前的数据揭示了由葡萄糖稳态调节的SIRT1如何促进肿瘤细胞对顺铂的耐药性，并提供了可能有助于癌症患者克服耐药性的治疗方法。

材料和方法

单元格行

KB-3-1（表皮样腺癌）和BEL7404细胞（肝癌细胞）是本研究中使用的亲本CP-s细胞。通过将亲代KB-3-1细胞一步暴露于0.5µg/ml顺铂来选择KB-CP.5细胞。KB-CP 20细胞来源于KB-3-1细胞，顺铂浓度逐步增加至20µg/ml，BEL7404-CP 20细胞也是如此。细胞系均以单层培养的形式在37°C和5%CO中生长2使用DMEM和10%的优质FCS（批号0S010F；BioWhittaker Inc.，CAMBREX Bioproducts，Walkersville，MD），我-谷氨酰胺、青霉素（50单位/mol）和链霉素（50µg/ml；Quality Biological Inc.，马里兰州盖瑟斯堡）。在这些实验中，将BEL7404-CP 20和KB-CP20细胞保存在含有5µg/ml顺铂的培养基中。

测量14C-2-脱氧葡萄糖摄取

对14在无葡萄糖Hanks缓冲盐水溶液（HBSS）中测量细胞单层的C-2-脱氧葡萄糖，该溶液含有示踪量14C-2-脱氧葡萄糖。清洗后，在2 ml 0.1N NaOH中收集单层，用于通过液体闪烁计数测量放射性和蛋白质测定。

电子自旋共振（ESR）氧压法检测CP-s、CP-r KB和BEL7404细胞的耗氧量

ESR测氧法是基于O的双分子碰撞2使用自旋标记，导致更短的自旋晶格弛豫时间并加宽线宽。因此，线宽减小表示持续耗氧。在本工作中，自旋标记4-氧代-2,2,6,6-四甲基哌啶-d日16-1-15使用了N-氧基（N-PDT）（马萨诸塞州安多弗市剑桥同位素实验室），因为该自旋探针的线宽对O非常敏感2浓度。通过测量在一段时间内获得的线宽，可以评估ESR仪器中定位的细胞的呼吸。为此，用5×10的悬浮液填充ESR室5/ml细胞和0.2 mM N-PDT，密封室。由于电池耗氧量降低了氧气浓度，导致密闭室系统中N-PDT的线宽减小。用带有可变温度控制器附件的瓦里安E-109 X波段光谱仪每隔2分钟记录一次20分钟的ESR光谱。信号通过0.5 mW入射微波功率和100 KHz调制获得。所有ESR光谱都是在N-PDT的低场线和37°C下记录的。

细胞对顺铂敏感性的测定

细胞活性通过敏感比色法测定（细胞计数试剂盒-8，CCK-8，Dojindo Molecular Technologies，Gaithersburg，MD）。在96个孔中用含有连续稀释顺铂的100µl培养基（西格玛公司，密苏里州圣路易斯）培养5000个细胞。孵育约3天后，向每个孔中添加10µl CCK-8溶液后，使用微孔板阅读器在450nm吸光度下测量不同浓度顺铂下的细胞存活率。根据药物浓度计算每个细胞系的IC50，该药物浓度将细胞活力降低至对照无药培养基中细胞活力的50%。每个细胞系的相对电阻系数通过划分IC来确定50顺铂耐药细胞系的顺铂值与相应的顺铂敏感细胞系的值相比较。这些值是至少三次测定的平均值。

蛋白质表达的免疫印迹检测

1 × 107细胞在对数期采集，用冷PBS洗涤两次。细胞通过1400×离心沉淀克在冰镇TD溶液缓冲液（2mM DTT、1%抑肽酶、1mM AEBSF和DNase）中悬浮10分钟，在冰上悬浮5分钟。细胞被超声三次破坏。样品在相控显微镜下进行检查，发现80%以上的细胞破碎。对SIRT1抗体进行蛋白质电泳和免疫印迹。抗SIRT1抗体购自Upstate Biotechnology（Lake Placid，NY）。肌动蛋白被用作单克隆抗β-肌动蛋白（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）检测到的蛋白质负荷控制。Samuel W.Cushman博士善意地提供了抗-GluT（GluT1、GluT2、GluT3、Glu T4、GluT5）多克隆抗体。简单地说，样品在4-12%梯度凝胶上通过SDS-PAGE分离，并转移到PVDF膜上。随后，在室温下用抗人SIRT1（1:1000）、肌动蛋白（1:10000）、谷氨酸转氨酶（1:500）单克隆抗体对细胞膜进行免疫染色1小时。制造商（伊利诺伊州罗克福德Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）所述的增强化学发光试剂用于开发信号。

SIRT1 SMART siRNA或pCruzHA SIRT1 cDNA转染细胞

SIRT1 SMART siRNA双链由Dharmacon RNA技术公司（伊利诺伊州芝加哥）设计。将稀释后的CP-r细胞置于无抗生素培养基中，根据Dharmacon协议转染SIRT1 SMART siRNA。siCONTROL非靶向池被用作siRNA控制，它经过化学修饰以提高稳定性，并在与已知人类、小鼠或大鼠基因没有完美匹配的情况下进行优化。通过将SIRT1 siRNA稀释剂与GeneSilencer siRNA转染试剂（Genlantis，San Diego，CA）结合来制备转染混合物。在转染时将该混合物以60%的汇合率直接加入到接种的CP-r细胞中。在不同时间点测量SIRT1的表达。使用非靶向随机siRNA作为对照。此外，将SIRT1全长cDNA克隆到pCruzHA哺乳动物表达载体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。FuGene 6（印第安纳波利斯罗氏诊断公司）用作pCruzHA-SIRT1质粒转染CP-s细胞的转染试剂。转染72小时后通过Western blotting检测SIRT1的表达。

免疫荧光共聚焦显微镜检测SIRT1的表达

细胞在无菌18-mm盖玻片上培养3天，然后用3.5%甲醛在PBS中固定10分钟，然后用0.1%Triton X-100处理5分钟以进行渗透。清洗后，用3%BSA在PBS中处理细胞30分钟，然后用一级抗-SIRT1抗体处理1小时。清洗三次后，用德克萨斯红结合亲和纯化二级抗体（1:100稀释）培养细胞（杰克逊免疫研究实验室）。将带有处理细胞的盖玻片安装在显微镜载玻片上，并使用含有DAPI的荧光安装介质进行细胞核染色（Dako，Carpintia，CA）。背景荧光是从仅用次级抗体处理的细胞中测定的，但以与初级抗体相同的方式处理。共聚焦图像是使用安装在尼康Optiphot显微镜上的Bio-Rad MRC 1024共聚焦扫描头获得的，该显微镜带有60×平复消色差透镜（Bio-Rad，Hercules，CA）。

北美+含量测定

北美+通过NAD的转换来确定浓度+如前所述，使用乙醇脱氢酶反应合成NADH(16).

统计分析

实验一式三份，对从实验中获得的所有计数进行分析、平均并表示为平均值±SD。使用双向方差分析测试比较多组数据，而非配对学生的吨-测试用于比较两组数据。除非另有说明，显著性水平为P<0.05。

致谢

这项研究得到了美国国立卫生院国家癌症研究所的校内研究计划的支持。我们感谢乔治·雷曼（George Leiman）协助编辑这份手稿，感谢苏珊·加菲尔德（Susan H.Garfield）博士和斯蒂芬·温科维奇（Stephen M.Wincovitch）博士的技术协助。我们还感谢Samuel W.Cushman博士就2-DG摄取提供的技术援助。我们感谢Kunio Nagashima博士对电子显微镜技术的帮助。NAD+和NADH测量方案来自加利福尼亚大学S.-J.Lin。我们也感谢中国科学院“百人计划”（07165111ZX）的支持。

缩写

人物配对关系顺铂或顺铂
CP-r公司抗顺铂药物
CP-s公司顺铂敏感性
SIRT1型无声信息调节器二正交1

工具书类

1王德，李柏德SJ。铂类抗癌药物的细胞加工。国家版次。2005;4:307–320.[公共医学][谷歌学者]
2Jamieson ER，Lippard SJ。顺铂-DNA加合物的结构、识别和处理。化学版次。1999;99:2467–2498.[公共医学][谷歌学者]
三。Siddik ZH公司。顺铂：细胞毒性作用方式和耐药性的分子基础。致癌物。2003;22:7265–7279.[公共医学][谷歌学者]
4Shen DW，Su A，Liang XJ，Pai-Panandiker A，Gottesman MM。顺铂耐药细胞中小GTPase表达减少和叶酸结合蛋白基因甲基化。Br J癌症。2004;91:270–276. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
5梁晓杰，沈德伟，加菲尔德S，戈特斯曼MM。顺铂耐药肿瘤细胞系中与多药耐药相关的膜蛋白定位错误。癌症研究。2003;63:5909–5916.[公共医学][谷歌学者]
6Guarente L，Picard F.卡路里限制——SIR2连接。单元格。2005;120:473–482.[公共医学][谷歌学者]
7Chen D，Steele AD，Lindquist S，Guarente L。热量限制期间活动增加需要Sirt1。科学。2005;310:1641.[公共医学][谷歌学者]
8Brunet A、Sweeney LB、Sturgill JF等。SIRT1脱乙酰酶对FOXO转录因子的应激依赖性调节。科学。2004;303:2011–2015.[公共医学][谷歌学者]
9Shen D，Pastan I，Gottesman MM。人类顺铂耐药细胞系对甲氨蝶呤和金属的交叉耐药是由于这些与降低的质膜结合蛋白相关的化合物积累的多效性缺陷所致。癌症研究。1998;58:268–275.[公共医学][谷歌学者]
10Ying YL，Shen DW，Liang XJ，Gottesman MM。体细胞杂交中顺铂耐药性的共显性。细胞生理学杂志。2003;196:63–69.[公共医学][谷歌学者]
11Shen DW，Goldenberg S，Pastan I，Gottesman MM。人体抗顺铂细胞中[14C]卡铂积累减少是由于能量依赖性摄取减少所致。细胞生理学杂志。2000;183:108–116.[公共医学][谷歌学者]
12Ford J，Jiang M，Milner J.SIRT1的癌症特异性功能使人类上皮癌细胞能够生长和存活。癌症研究。2005;65:10457–10463.[公共医学][谷歌学者]
13.Cohen HY、Miller C、Bitterman KJ等。热量限制通过诱导SIRT1脱乙酰酶促进哺乳动物细胞存活。科学。2004;305:390–392.[公共医学][谷歌学者]
14Nemoto S、Fergusson MM、Finkel T。营养素利用率通过叉头依赖途径调节SIRT1。科学。2004;306:2105–2108.[公共医学][谷歌学者]
15.Chu F，Chou PM，Zheng X，Mirkin BL，Rebbaa A.长寿基因sirt1对多药耐药基因mdr1和化疗耐药的控制。癌症研究。2005;65:10183–10187.[公共医学][谷歌学者]
16Shen DW，Liang XJ，Gawinowicz MA，Gottesman MM。细胞骨架[14C]卡铂结合蛋白的鉴定揭示了顺铂耐药细胞系中肌动蛋白和丝蛋白的表达减少和结构紊乱。摩尔药理学。2004;66:789–793.[公共医学][谷歌学者]
17Shen DW，Akiyama S，Schoenlein P，Pastan I，Gottesman MM。从人肝癌细胞系和人KB腺癌细胞建立的高水平顺铂耐药细胞系的特征：交叉耐药性和蛋白质变化。英国癌症杂志。1995;71:676–683. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
18Rodgers JT、Lerin C、Haas W、Gygi SP、Spiegelman BM、Puigserver P。通过PGC-1alpha和SIRT1复合物对葡萄糖稳态的营养控制。自然。2005;434:113–118.[公共医学][谷歌学者]
19Nemoto S、Fergusson MM、Finkel T.SIRT1与代谢调节器和转录辅激活剂PGC-1{alpha}在功能上相互作用生物化学杂志。2005;280:16456–16460.[公共医学][谷歌学者]
20Andrews PA，Howell SB。顺铂的细胞药理学：获得性耐药机制的观点。癌细胞。1990;2:35–43.[公共医学][谷歌学者]
21Safaei R，Howell SB。铜转运蛋白调节细胞药理学和对铂类药物的敏感性。Oncol Hemat评论。2005;53:13–23.[公共医学][谷歌学者]
22.Harper ME，Antoniou A，Villalobos-Menuey E等。耐药肿瘤细胞使用的新代谢策略的表征。美国财务会计准则委员会J。2002;16:1550–1557.[公共医学][谷歌学者]
23Qian W，Nishikawa M，Haque AM，等。线粒体密度决定细胞对顺铂诱导的细胞死亡的敏感性。美国生理学杂志。2005;289：C1466–C1475。[公共医学][谷歌学者]
24Aft RL，Zhang FW，Gius D.2-脱氧-D-葡萄糖作为化疗药物的评估：细胞死亡机制。英国癌症杂志。2002;87:805–812. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Rybak LP，Whitworth CA。耳毒性：治疗机会。今日毒品光盘。2005;10:1313–1321.[公共医学][谷歌学者]
26Pivonkova H，Brazdova M，Kasparkova J，Brabec V，Fojta M。p53蛋白对顺铂损伤DNA的识别：p53 C末端结构域的关键作用。生物化学-生物物理研究公司。2006;339:477–484.[公共医学][谷歌学者]
27.Chen WY，Wang DH，Yen RC，Luo J，Gu W，Baylin SB。肿瘤抑制因子HIC1直接调节SIRT1以调节p53依赖性DNA损伤反应。单元格。2005;123:437–448.[公共医学][谷歌学者]
28Lin SJ，Defossez PA，Guarente L.通过限制啤酒酵母中的热量来延长寿命的NAD和SIR2要求。科学。2000;289:2126–2128.[公共医学][谷歌学者]
29Anderson RM、Latorre-Esteves M、Neves AR等。通过热量限制延长酵母寿命与NAD波动无关。科学。2003;302:2124–2126. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
30Vaziri H、Dessain SK、Ng Eaton E等。hSIR2（SIRT1）作为NAD依赖的p53脱乙酰酶发挥作用。单元格。2001;107:149–159.[公共医学][谷歌学者]
31Lai MD，Lin WC，Sun YM，Chang FL。磷酸化和低乙酰化突变型p53在缺乏转录激活或翻译的情况下通过caspase-9途径增强顺铂诱导的凋亡。国际分子医学杂志。2005;15:725–734.[公共医学][谷歌学者]
32Liang XJ，Mukherjee S，Shen DW，Maxfield FR，Gottesman MM。顺铂耐药癌细胞内循环室改变。癌症研究。2006;66:2346–2353. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
33Yeung F，Hoberg JE，Ramsey CS，等。SIRT1脱乙酰酶对NF-κB依赖性转录和细胞存活的调节。EMBO J。2004;23:2369–2380. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
34Brabec V，Kasparkova J.抗肿瘤铂类药物耐药性的分子方面。抗药性更新。2002;5:147–161.[公共医学][谷歌学者]