胃肠病学。作者手稿；PMC 2008年12月4日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理2593881
美国国立卫生研究院：NIHMS14106标准
Raf激酶抑制剂蛋白的缺失促进人肝癌细胞的增殖和迁移
,1 ,1 ,2 ,1和1
韩楚利（Han Chu Lee）
1罗德岛医院和布朗医学院肝脏研究中心，布朗大学，普罗维登斯，RI 02903
博天
1罗德岛医院肝脏研究中心和布朗大学布朗医学院，普罗维登斯，RI 02903
约翰·塞迪维
2罗得岛州普罗维登斯布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系02903
杰克·R·旺兹
1罗德岛医院和布朗医学院肝脏研究中心，布朗大学，普罗维登斯，RI 02903
米兰·金
1罗德岛医院和布朗医学院肝脏研究中心，布朗大学，普罗维登斯，RI 02903
1罗德岛医院和布朗医学院肝脏研究中心，布朗大学，普罗维登斯，RI 02903
2罗得岛州普罗维登斯布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系02903
通信地址：Miran Kim博士，肝脏研究中心，55 Claverick Street，4第个佛罗里达州普罗维登斯，RI 02903，美国，电话：（401）44444 93，传真：（401）4442939，电子邮件：ude.nworb@miK_nariM 摘要
背景和目标
Raf激酶抑制剂蛋白（RKIP）被确定为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径的抑制剂。RKIP功能的丧失促进前列腺癌和黑色素瘤的肿瘤转移。IGF-I介导的MAPK级联在肝细胞癌（HCC）中经常被激活，但RKIP在这些肿瘤的分子发病机制中的作用尚不清楚。本研究旨在评估RKIP在肝癌发生发展中的作用。
方法
采用免疫组织化学和Western blot分析方法检测肝癌及癌旁组织中RKIP的表达水平。通过免疫印迹分析、Raf激酶活性测定、肝癌细胞株中RKIP过度表达或下调后的细胞增殖和迁移测定来评估RKIP的潜在机制。
结果
与癌旁组织相比，人肝癌中RKIP表达下调。低RKIP水平与细胞外信号调节激酶（ERK）/MAPK通路激活增强相关。重组实验拮抗IGF-I介导的MAPK通路激活，从而减少磷酸化ERK的核积累。相反，使用siRNA敲低RKIP表达可诱导ERK/MAPK通路的激活。RKIP的异位表达改变了肝癌细胞的增殖和迁移。
结论
我们的研究结果表明，RKIP表达下调是人类肝癌发生过程中IGF-I/ERK/MAPK通路激活的主要因素。
介绍
肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌的80-90%，是世界上最常见、最具破坏性的恶性疾病之一。HCC发生的主要危险因素是慢性乙型或丙型肝炎感染。1,2肿瘤的发展与生长因子和细胞因子协调反应的失败有关，这导致增殖-凋亡过程的平衡受损。因此，生长因子和细胞因子的放松调控表达可能是这一多步骤过程的重要因素，三——6其中胰岛素样生长因子（IGF-I和II）似乎起着关键作用。7一项研究报告称，90%的HCC中IGF信号发生改变，包括IGF的自分泌、IGF结合蛋白（IGFBP）、IGFBP蛋白酶和IGF受体的表达。8IGF-I与IGF-I受体细胞外结构域（IGF-IR）的结合诱导构象变化，导致受体的自身磷酸化转化为活性形式。这一事件触发多个下游信号通路的启动，包括MAPK和磷脂酰肌醇3'-激酶（PI3-K）信号级联，导致细胞增殖、转化和抑制凋亡。9——11
丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路高度保守，参与细胞生长、分化、存活和侵袭。12,13MAPK主要有三种途径：细胞外信号调节激酶（ERKs）；c-Jun N末端激酶（JNK或SAPK1）；和p38 MAPK（SAPK2/RK）。一般来说，ERK1/2是增殖信号的关键传感器，通常被有丝分裂原激活。相反，SAPK/JNK和p38受到有丝分裂原的微弱刺激，但受到细胞应激的强烈激活。许多不同的生长因子受体，包括胰岛素受体和IGF-IR，通过小G蛋白Ras激活ERK/MAPK途径，从而结合Raf-1激酶，从而将Raf-1招募到细胞膜内表面。事件发生后，Raf-1磷酸化MEK，MEK反过来磷酸化并激活ERK。磷酸化ERK转位到细胞核，并通过与各种转录因子（如CREB、AP-1、Ets和c-Myc）的相互作用调节基因表达。14已有研究表明，该途径在包括肝癌在内的许多恶性肿瘤中被激活。15——17此外，该途径的激活可导致耐药表型，并诱导肿瘤细胞快速增殖。阻断这一级联反应可能会增加药物敏感性并促进细胞凋亡。14,18,19
Raf激酶抑制剂蛋白（RKIP）被鉴定为MAPK信号通路的抑制剂。20——25RKIP是一种组织广泛表达的保守细胞溶质蛋白，与其他激酶抑制剂没有显著同源性。26,27杨等。24,25结果表明，RKIP直接与Raf-1和MEK相互作用，并中断Raf-1/MEK的相互作用，从而阻止MEK和信号级联下游组件的激活。过度表达RKIP抑制MAPK信号传导，下调RKIP则产生相反的效果。
异常的RKIP表达可能在恶性过程中起关键作用。28——30与非转移性细胞系相比，转移性前列腺中的RKIP表达下调。免疫组织化学染色显示，正常前列腺和原发性前列腺肿瘤中RKIP的表达为中到高水平，而转移灶中则为低水平或检测不到的水平。RKIP的修复减少了自发性肺转移。31,32这些观察结果将RKIP定义为13个已知转移抑制基因之一。33舒尔等。22另据报道，与正常黑素细胞相比，在黑色素瘤细胞系中发现RKIP显著下调。用RKIP稳定转染黑色素瘤细胞显示出显著的侵袭性抑制在体外.
虽然RKIP抑制ERK/MAPK信号通路的分子机制已部分阐明，但关于RKIP在人类肝癌发生中的作用以及RKIP如何在HCC细胞中调节的尚不清楚。在本研究中，我们证明了RKIP表达水平是HCC中ERK/MAPK信号传导的关键因素，并定义了HCC生长的分子机制。
材料和方法
肝癌组织和细胞系
手术时获得17个废弃的HCC肿瘤组织，并在切除后30分钟内用液氮冷冻。对肿瘤和相应的瘤周组织进行组织学确认。人类肝癌细胞系FOCUS、Huh7、Hep3B和HepG2在Eagle's Minimal Essential Medium（MEM）中生长，其中含有10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺（马里兰州盖瑟斯堡生命科技公司）和MEM非必需氨基酸（密苏里州圣路易斯西格玛）。
免疫组织化学
通过免疫组织化学方法对福尔马林固定、石蜡包埋肿瘤和邻近未累及的瘤周组织切片进行RKIP蛋白表达筛查。对切片进行脱蛋白、复水，然后在4°C下与抗RKIP抗体（纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology）孵育过夜。生物素标记的抗兔IgG在室温下孵育30分钟；免疫反应检测采用链霉亲和素-生物素法，以辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺为显色剂（组织染色试剂盒；佐米德，加利福尼亚州旧金山）。使用苏木精（Zymed）对切片进行复染，并在光学显微镜下进行检查。2名独立观察者将免疫染色强度评分为阴性（−）、弱阳性（+）、中度阳性（++）或强阳性（+++）。
定量实时RT-PCR分析
使用TRIzol®试剂（Invitrogen™，Carlsbad，CA）从17对肝组织或HCC细胞系中提取总RNA。使用用于逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）（AMV）的第一链cDNA合成试剂盒（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN）从250ng总RNA合成第一链互补DNA（cDNA）。为了确定人类RKIP mRNA的表达水平，使用iCycler-iQ多色实时PCR检测系统（加州Hercules Bio-Rad）与SYBR Green PCR Master Mix（加州福斯特市Applied Biosystems）、400 nM每个引物和5 ng cDNA（等效总RNA）组成的混合物进行实时RT-PCR反应来自未知样本。引物序列如下：RKIP、GACATCAGCAGTGGCACAGT和GTCACACTTTAGCGCTGT、18S rRNA、GGACACGAGAGATGACA和ACCCACGAATCGAGAAGA。PCR产物被切除并克隆到PCR 2.1载体（Invitrogen™）中，并双向测序。序列确认后，用每种PCR产物的10倍稀释液制备实时RT-PCR的标准品。通过测定Ct值量化RKIP mRNA的拷贝数，然后归一化为18S rRNA和每个基因的标准曲线。实验一式三份。
RKIP表达和转染研究
对于瞬时转染实验，用2µg CMV5-HA-RKIP质粒转染6孔板中的HCC细胞，汇合率为60-70%25或使用LipofectAMINE 2000试剂（Invitrogen）的空载体质粒（对照）。为了获得用空载体或RKIP质粒稳定转染的FOCUS细胞系，在转染后48小时使用800µg/mL G418开始选择（马里兰州盖瑟斯堡生命技术公司）。每4天更换一次选择培养基。分离并扩增G418-耐药细胞的克隆以进一步鉴定。
Western Blot分析
对17个配对冷冻肿瘤和瘤周组织或肝癌细胞中的8个进行了裂解，并如前所述进行了Western blot分析。34细胞用无血清培养基饥饿24小时，然后用100 nM IGF-I刺激10–30分钟。为了检测磷酸-ERK的核转位，使用NE-PER核和细胞质提取试剂（皮尔斯、罗克福德、IL）制备了细胞溶质和核提取物。使用以下主要抗体：RKIP（Upstate，Waltham，MA）；c-Raf、磷酸化-c-Raf（Ser338）、MEK1、磷酸化-MEK1、ERK和磷酸化-ERK（细胞信号传导，马萨诸塞州贝弗利）；肌动蛋白和Histone-H1（加州圣克鲁斯圣克鲁斯）。一级抗体随后与辣根过氧化物酶偶联二级抗体和Western Lighting System（PerkinElmer™Life Sciences，Boston，MA）孵育。必要时，用Restore™Western Blot剥离缓冲液（Pierce）剥离膜并重新进行处理。对于蛋白质定量，扫描条带，使用NIH Image 1.61软件进行定量，并标准化为肌动蛋白对照。结果报告为三次分析的平均值。
RKIP-siRNA
对照小干扰RNA（siRNA）（siCONTROL非靶向siRNA）和人类RKIP特异性siRNA（siGENOME SMARTpool试剂，人类PBP）购自Dharmacon（Lafayette，CO），并使用DharmaFECT 4转染试剂（Dharmcon）以100 nM的浓度转染到HepG2 HCC细胞中。转染48小时后，用无血清培养基饥饿细胞24小时，用或不用IGF-I激活细胞15分钟。
Raf激酶活性测定
使用非放射性Raf激酶检测试剂盒（Upstate）对Raf激酶活性进行分析，并进行了一些修改。简单地说，每个细胞裂解液中500µg总蛋白与2µg小鼠单克隆抗Raf-1抗体（Santa Cruz）在4°C下孵育过夜，然后与UltraLink固定化蛋白A/g凝胶（Pierce Biotec）孵育。在广泛清洗后，将凝胶与非活性MEK-1底物在30°C下孵育30分钟。用兔抗磷酸MEK-1抗体（Upstate）进行Western blot检测反应混合物中磷酸化的MEK-1。
光染色法
FOCUS细胞在培养箱载玻片中生长（伊利诺伊州纳珀维尔Nalge Nunc）。细胞在冷甲醇中固定，并用5%的山羊和马血清封闭。对于双标记免疫荧光染色，细胞与抗RKIP和抗磷酸-ERK抗体在4°C的封闭溶液中孵育过夜。冲洗细胞，并在室温下应用FITC-结合抗鼠IgG和德克萨斯红结合抗兔IgG二级抗体30分钟。最后，使用带有DAPI（Vector Laboratories）的防伪Vectashield介质安装盖玻片，以对细胞核进行反染色，并在Olympus IX70荧光显微镜下进行检查（马萨诸塞州牛顿市DSC Optical Services）。
细胞增殖试验
我们使用CellTiter 96 AQeous非放射性细胞增殖测定法（Promega，Madison，WI）。简言之，将稳定转染CMV5-HA-RKIP或空质粒的FOCUS细胞以1000个细胞/孔的密度，在含有或不含100 nM IGF-I的无血清MEM中，放置在96 well板中。细胞在37°C下培养3天，每24小时更换一次培养基。用MTS/PMS联合溶液（Promega）孵育2小时后测量细胞增殖；测定活增殖细胞的比色法。结果显示为一次实验中六个孔的平均吸光度，并报告为三次分析的平均值。
细胞迁移测定
如前所述，使用基于发光的分析评估细胞迁移。35将稳定转染CMX5-HA-RKIP或空质粒的FOCUS细胞用于此细胞迁移分析。简言之，5×104将含有1%BSA的0.5 mL MEM中的细胞接种到12孔板的上腔中，该12孔板由具有8-µm孔的聚碳酸酯膜（透明PET膜；加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences）隔开。将含有1%BSA和100 nM IGF-I的0.75 mL MEM注入下室。在37°C下孵育3小时后，用无菌棉签采集膜上表面（非迁移）的细胞，并将其放入含有良好溶解缓冲液中。将膜（迁移的粘附细胞）放置在另一个孔中，将迁移的非粘附细胞悬浮液放置在下室的第三个孔中（包含溶解缓冲液）。添加ATPLite基板（PerkinElmer™），并在TopCount微孔板阅读器（Packard Instrument Company，Meriden，CT）中测量每秒的发光计数。结果以迁移细胞占总细胞的百分比表示，实验一式三份。
伤口愈合试验
将空载体转染的FOCUS细胞系和稳定的RKIP转染克隆置于六孔板中。用无菌塑料微吸管尖端刮除汇合单层。伤口闭合作为迁移的指标，在24小时内进行观察，并在0、6、12和18小时用显微镜进行拍照。
统计分析
数据通过Student t检验进行分析。A类P（P）值小于0.05被认为具有统计学意义。
结果
人肝癌中RKIP蛋白表达下调
通过免疫组织化学方法评估17对人肝癌肿瘤和癌旁未累及组织中RKIP蛋白的表达水平(). 83%（14/17）的癌周组织中检测到RKIP染色，但只有12%（2/17）的HCC肿瘤组织中检测到RKIP染色(P（P）< 0.001).显示了具有代表性的免疫组织化学染色结果。此外，对17对肝癌中的8个和邻近未累及组织样本进行的免疫印迹分析显示，与邻近的瘤周组织相比，7/8肝癌中的RKIP蛋白水平降低(P（P）< 0.0001) (). 与这些观察结果相一致的是，在8个HCC组织中，有7个组织的磷酸化ERK也升高，RKIP表达降低(). 接下来，我们通过实时RT-PCR评估RKIP mRNA水平。出乎意料的是，RKIP mRNA水平仅下降了41%，增加了47%，而在12%的肝癌中没有变化。总的来说，RKIP mRNA表达水平没有显著差异(P（P）>0.5）HCC肿瘤和相应的瘤周组织之间(). 这些结果表明，在HCC中观察到的RKIP蛋白水平的一些差异可能是由于转录后机制。
人肝癌组织样本中RKIP蛋白的表达。用抗RKIP抗体（棕色）对肝癌和瘤周区域的代表性病例进行免疫染色，并用苏木精（蓝色）进行复染。放大倍数为200倍(A类)遗漏一级抗体作为阴性对照。(B)肿瘤周围组织中的低（+）染色。不到50%的肝细胞表现出免疫反应。(C)瘤周组织中度（++）染色。几乎所有的肝细胞都显示出均匀的中度免疫反应。(天)肿瘤周围组织的强（+++）染色。(E类)HCC肿瘤的阴性（−）染色。
肝癌组织中RKIP蛋白、mRNA和磷酸化ERK的表达。(A类)RKIP和磷酸化-ERK表达水平的Western blot分析。用抗RKIP或抗磷酸化-ER抗体对来自8对HCC肿瘤（T）和瘤周（pT）组织的细胞裂解物进行免疫印迹。Actin充当加载控件。注意，RKIP表达降低的HCC组织中磷酸化-ERK表达增加。(B)条形图表示通过密度扫描获得的RKIP蛋白水平（T/pT）的比率。8例HCC肿瘤中有7例RKIP表达降低（肿瘤与瘤周组织相比：P（P）< 0.0001). (C)定量实时RT-PCR测定人肝癌组织中RKIP mRNA的表达水平。RKIP mRNA水平归一化为18S rRNA。条形图显示RKIP的mRNA水平比率（T/pT）。肝癌组织和瘤周组织中RKIP mRNA表达水平无差异（P>0.5）。
表1
| 样品编号。 | 第页 | T型 |
|---|
| 1 | ++ | − |
| 2 | + | − |
| 三 | + | − |
| 4 | + | − |
| 5 | − | − |
| 6 | ++ | − |
| 7 | ++ | + |
| 8 | + | − |
| 9 | + | − |
| 10 | + | − |
| 11 | +++ | − |
| 12 | ++ | − |
| 13 | − | − |
| 14 | + | − |
| 15 | − | − |
| 16 | +++ | − |
| 17 | ++ | + |
|
| 17 | 82.3% (14/17) | 11.8% (2/17) |
肝癌细胞系中RKIP mRNA和蛋白的表达
我们评估了4个肝癌细胞株中RKIP蛋白和mRNA的表达水平；焦点、Huh7、Hep3B和HepG2(). 这4株HCC细胞系之前已经在形态学、生长速度、白蛋白的产生、软琼脂中的非锚定生长和裸鼠体内的肿瘤形成方面进行了表征。36——38根据这些标准，这些HCC细胞系的分化状态被分类为：FOCUS<Huh7<Hep3B<HepG2（未分化<分化最强）。有趣的是，分化程度最低的FOCUS细胞的RKIP蛋白水平最低，而分化程度高的HepG2细胞的RJIP蛋白水平最高。这些结果表明RKIP表达与HCC细胞分化之间的关系(,). 肝癌细胞中RKIP mRNA表达水平与其蛋白表达水平大致相关。然而，具有相似mRNA水平的HepG2和Hep3B细胞之间的蛋白表达水平不同，这表明受复杂机制的调节().
RKIP在IGF-I诱导的肝癌ERK/MAPK通路激活中的作用。(A类)肝癌细胞株中RKIP蛋白和ERK/MAPK通路下游成分的表达水平。对含有100µg总蛋白的FOCUS、Huh7、Hep3B和HepG2细胞的细胞裂解液进行RKIP、MEK1、ERK及其磷酸化形式的免疫印迹；肌动蛋白起到了负荷控制的作用。(B)条形图表示密度分析的结果，并揭示了RKIP和肌动蛋白、磷酸-MEK1和总MEK1以及磷酸-ERK和总ERK的比率(C)RKIP异位表达阻断了IGF-I诱导的FOCUS细胞ERK/MAPK信号通路。用RKIP或载体质粒瞬时转染细胞。在24小时血清饥饿后，用100 nM IGF-I（+）处理细胞15分钟或不处理细胞（-）。制备细胞裂解物，并对RKIP和通路下游信号成分（c-Raf、MEK1、ERK和磷酸化形式）进行免疫印迹；肌动蛋白作为负载对照。(天)条形图描述了密度分析的结果(C)，表示为RKIP与肌动蛋白、磷酸化c-Raf与总c-Raf、磷酸化-MEK1与总MEK1、磷酸化-ERK与总ERK的比值。结果显示为三次实验的平均值±SE。（E） 用siRNA敲低RKIP表达可激活IGF-I诱导的HepG2细胞ERK/MAPK信号。使用DharmaFECT 4转染试剂用对照si-RNA（C-siRNA）或RKIP-siRNA转染细胞。在血清饥饿后用100 nM IGF-I（+）处理细胞15分钟或未经处理（−）24小时，然后用免疫印迹法检测RKIP和通路下游信号成分（c-Raf、MEK1、ERK和磷酸化形式）；肌动蛋白起到了负荷控制的作用。(F类)条形图描述了密度分析的结果(E类)、和表示为RKIP和肌动蛋白、磷酸化-c-Raf和总c-Raf、磷酸化-MEK1和总MEK1、磷酸化-ERK和总ERK的比率。
表2
| 肝癌细胞系 | mRNA表达1（副本编号） | mRNA表达2 | 蛋白质表达2 |
|---|
| 集中 | 56.4 ± 24.7 | 25 | 3.6 |
| 嗯7 | 119.0±17.6 | 44.2 | 16.1 |
| Hep3B型 | 263.0 ± 3.2 | 92.9 | 44.6 |
| HepG2型 | 283.0 ± 1.6 | 100 | 100 |
RKIP表达水平对IGF-I诱导ERK/MAPK通路激活的影响
RKIP与Raf-1和MEK结合，干扰它们的相互作用并抑制下游信号传导。24,25我们探索了四种肝癌细胞系中通过该途径的信号转导。在表达低RKIP蛋白水平的FOCUS细胞中，我们观察到高MEK和ERK磷酸化。相反，HepG2细胞中MEK和ERK磷酸化水平较低，表达高水平的RKIP蛋白(). 这些结果表明，RKIP可能直接影响ERK/MAPK通路的激活。为了进一步研究RKIP对ERK/MAPK级联的影响，我们首先恢复了FOCUS细胞中RKIP的表达。正如预期的那样，IGF-I刺激FOCUS细胞增加了ERK/MAPK途径成分Raf、MEK和ERK的磷酸化。RKIP异位表达抑制IGF-I诱导的MEK和ERK磷酸化，但不抑制Raf，因为它是RKIP的上游(). siRNA对RKIP表达的抑制增加了HepG2细胞中MEK和ERK的磷酸化，这意味着ERK/MAPK途径的激活(). 为了进一步证实RKIP对肝癌细胞ERK/MAPK通路的影响，我们以MEK-1为底物进行了Raf激酶活性测定。在FOCUS细胞中，IGF-I刺激增加了Raf激酶活性，但RKIP过度表达降低了该活性。此外，我们发现，与基础Raf激酶活性相比，当IGF-I刺激HepG2细胞时，使用siRNA抑制RKIP表达可诱导Raf激酶的活性(). 这些结果表明，RKIP水平对于HCC细胞中IGF-I诱导的ERK/MAPK信号传导的调节是重要的。
RKIP表达水平影响Raf激酶活性。(A类)肝癌细胞系中RKIP蛋白的表达。在FOCUS细胞中，转染空载体（C）或RKIP表达质粒。对照siRNA（C-siRNA）或RKIP-siRNA转染HepG2细胞。在血清饥饿24小时后，用（+）或不使用（−）IGF-I处理细胞10分钟。肌动蛋白的Western blot作为对照，以使蛋白质浓度正常化。(B)Raf激酶活性测定。用小鼠单克隆抗Raf抗体免疫沉淀每个样品的500微克蛋白质，然后进行Raf激酶活性测定，如材料和方法.对MEK的印迹进行剥离和重复，证明添加了等量的重组MEK-1底物。“w/o裂解物”通道表示不添加细胞裂解物的分析，并用作阴性对照。“活性Raf”通道表示使用从0.1µg活性Raf蛋白中获得的免疫沉淀物作为阳性对照进行分析。免疫沉淀Raf蛋白显示磷酸化MEK（pMEK）。条形图表示通过密度扫描获得的pMEK水平（pMEK与MEK）。请注意，RKIP的过度表达降低了FOCUS细胞中的Raf激酶活性，而RKIP被敲除则诱导了HepG2细胞中的活性。
激活的ERK转位到细胞核并通过转录因子的磷酸化调节基因表达。因此，我们研究了RKIP对核磷酸ERK积累的影响。IGF-I刺激FOCUS细胞导致磷酸化ERK在细胞质中积聚，RKIP的恢复可消除这种积聚(). 此外，IGF-I刺激导致磷酸化-ERK的核积累增加，这被RKIP的恢复所抑制。RKIP对HCC细胞中ERK的总量没有影响().
RKIP水平的恢复抑制了FOCUS细胞中磷酸化ERK核的积聚。(A类)用（+）或（-）100 nM IGF-I刺激RKIP或转染载体的FOCUS细胞15分钟。免疫印迹法检测细胞液和核组分的RKIP、磷酸化ERK（pERK）和总ERK表达；肌动蛋白和组蛋白-H1分别起到细胞溶质和核负荷控制的作用。(B)用RKIP（红色）和磷酸化-ERK（绿色）对对照组和RKIP转染的FOCUS细胞（生长在培养箱载玻片上）进行免疫染色，用DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。底部面板显示了磷酸化ERK和DAPI染色的合并图像，表明核共定位。箭头表示核pERK。
以瞬时转染RKIP或空载体质粒的FOCUS细胞的抗RKIP和抗磷酸-ERK抗体作为对照，通过双标记免疫荧光染色进一步证实了这些观察结果。与对照细胞相比，转染RKIP的细胞中观察到RKIP强烈的细胞质染色(). 磷酸化-ERK的免疫染色显示对照细胞的细胞质和细胞核中有强烈的信号，这些水平因RKIP过度表达而显著降低(). 仅在对照细胞中观察到磷酸化ERK的核染色，但在RKIP转染细胞中未观察到(). 这些观察结果表明，RKIP的恢复阻断了IGF-I诱导的FOCUS细胞ERK/MAPK通路的激活，并导致核磷酸化ERK的减少。
恢复RKIP降低的肝癌细胞增殖和运动能力体外试验
ERK/MAPK通路的激活导致细胞增殖、迁移和细胞凋亡的抑制。我们的结果表明，RKIP的异位表达抑制了FOCUS细胞中的这一途径。因此，我们评估了肝癌细胞中RKIP表达的功能意义。Western blot分析显示，稳定转染FOCUS细胞后，RKIP过度表达(). 当用IGF-I刺激对照细胞时，细胞增殖增加。然而，RKIP过度表达抑制了这种增强的细胞增殖()对照组和RKIP过度表达细胞的凋亡率没有差异（数据未显示）。然后我们评估RKIP表达是否影响肝癌细胞迁移。与对照细胞（56%）相比，RKIP异位表达显著降低了FOCUS细胞迁移率（28%）(). 为了进一步证实RKIP对细胞迁移的影响，在汇合条件下对对照和RKIP过度表达的FOCUS细胞进行电镀，并刮除单层。对照细胞迅速迁移，伤口愈合18小时。相比之下，RKIP的过度表达在同一时间间隔内仅封闭伤口22%()进一步强化了RKIP在功能上与HCC细胞迁移相关的概念。综上所述，我们得出结论，RKIP过度表达可对抗肝癌中ERK/MAPK级联的IGF-I激活，下游生物学后果是减少增殖和迁移。
RKIP的恢复降低了FOCUS细胞的增殖和迁移。用空载体（对照）或RKIP表达质粒稳定转染FOCUS细胞。(A类)通过蛋白质印迹分析证明RKIP蛋白表达。(B)RKIP表达抑制FOCUS细胞增殖。细胞在含有或不含100 nM IGF-I的无血清MEM中生长。使用CellTiter 96水性非放射性细胞增殖试验测定细胞增殖。结果表示为三次分析的平均值±SE。IGF-I刺激增加了对照细胞的细胞增殖[C-IGF-I（+）vs.C-IGF-I（−）]，但RKIP转染的FOCUS细胞中的细胞增殖率没有变化[RKIP-IGF-I。P（P）<0.05（第2天和第3天）(C)RKIP表达抑制FOCUS细胞迁移。为了评估细胞穿过聚碳酸酯膜（孔径为8-µm）的能力4将含有1%BSA的0.5 mL无血清MEM中的细胞置于上部培养箱中，并将含有1%BS A和100 nM IGF-I的0.75 mL无血清ME充满下部培养箱。在37°C下培养3小时后，分别采集上腔细胞和附着在膜上或迁移到下腔的细胞，并将其置于裂解缓冲液中。将ATPLite基板添加到每个组分中，并在TopCount微孔板阅读器中测量每秒的发光计数。结果以迁移细胞占总细胞的百分比表示，实验重复三次。P（P）<0.001（对照组与RKIP）
RKIP抑制FOCUS细胞增殖和运动。将对照FOCUS细胞和稳定的RKIP转染体置于六孔板中。用无菌塑料微量移液管尖端在融合的单层中形成伤口，并通过每次保持开放的伤口区域显示伤口闭合的百分比，如下图所示。注意，FOCUS细胞中异位RKIP表达显著减少了细胞迁移。
讨论
胰岛素/IGF-I/IRS-1/MAPK级联在2/3肝切除术后和胚胎发育期间调节肝脏再生中起着重要作用。39,40在无限制生长的情况下，胰岛素/IGF-I/IRS-1/MAPK级联因IRS-1表达增强而结构性激活已在大多数HCC中发现。39事实上，IRS-1过度表达与ERK/MAPK级联的激活有关，并导致HCC肿瘤增大。41——43IRS-1蛋白是胰岛素/IGF-I受体的主要底物，并通过与含有SH-2结构域的分子相互作用发出下游信号。研究表明，90%以上的肿瘤中IRS-1过度表达和/或此信号通路的一个或多个成分激活，说明胰岛素/IGF-I/IRS-1信号在人类肝癌中的作用。44此外，显性阴性IRS-1突变蛋白抑制胰岛素/IGF-I/IRS-1介导的信号转导逆转了人肝癌细胞的恶性表型。45因此，除了IRS-1的过度表达外，确定是否还有其他分子机制有助于此途径的激活，这是非常有趣的。在这方面，RKIP功能丧失似乎是HCC发病机制中的一个主要事件，因为这里评估的大约80-90%的肿瘤的RKIP蛋白水平降低。更重要的是，在RKIP表达降低的86%肝癌组织中，磷酸化-ERK表达增加。总之，这些研究强调了胰岛素/IGF-I信号在调节肝脏生长中的重要性，并进一步表明异常激活在绝大多数HCC肿瘤中发挥致癌作用。
RKIP在包括恶性黑色素瘤和前列腺肿瘤在内的多种肿瘤中的作用已被研究。然而，没有关于肝脏尤其是肝癌中RKIP功能的信息。我们假设RKIP可能在HCC的分子发病机制中发挥作用，因为功能丧失将有助于ERK/MAPK通路的激活。我们的实验表明，RKIP在人类肝癌中的表达下调，类似于在黑素瘤和前列腺癌中观察到的情况。22,29尽管人们认为RKIP表达对抑制转移很重要，但RKIP蛋白水平如何调节的细胞机制尚未确定。在对RKIP启动子序列进行生物信息学分析的基础上，可能通过一些转录因子如AP-1、SP-1和YY1（YY1）来调节其表达。21此外，Huerta-Yepez等人发现，用NF-κB抑制剂或转录抑制因子YY1治疗前列腺癌细胞株会导致RKIP表达上调。46在这项研究中，尽管人肝癌中RKIP蛋白水平明显降低，但RKIP mRNA水平仅下降了41%，因为剩余的肿瘤要么增加要么没有变化。因此，RKIP蛋白的表达可能在转录后水平上受到调节，至少在一些人类肝癌中是如此。之前没有报道将RKIP在不同细胞类型中的表达作为分化功能的特征。我们的研究结果表明，RKIP蛋白水平与HCC细胞分化程度直接相关。综上所述，这些观察结果表明，RKIP表达可能根据细胞类型和分化状态在不同水平上受到调节。
已有明确的文献证明，MAPK通路在包括肝癌在内的多种肿瘤中被组成性激活。47——53然而，对促成这一过程的机制了解甚少。我们证明ERK/MAPK通路活性的增强与FOCUS细胞中RKIP表达的缺乏有关，FOCUS是所评估的HCC细胞系中恶性程度最高且分化较差的细胞。然而，RKIP的恢复通过MEK和ERK的失活阻断了IGF-I刺激的ERK/MAPK通路的激活。这一观察结果使我们探讨了RKIP蛋白的恢复是否可以调节HCC细胞的增殖和迁移。事实上，与空载体转染的对照细胞相比，稳定转染RKIP的FOCUS细胞的细胞增殖率降低，而凋亡率没有任何变化。此前有报道称，RKIP通过改变细胞周期而非促进凋亡来抑制胰腺β细胞的生长。30尽管有报道称RKIP过度表达会使RC1细胞（前列腺癌细胞系）和NHL细胞对化疗药物敏感，但似乎不会增加自发凋亡率。21,28相反，RKIP的过度表达触发了乳腺癌细胞系的凋亡。28因此，在缺乏化疗药物的情况下，对RKIP过度表达的凋亡反应可能与环境有关。除了RKIP对细胞增殖的影响外，我们的研究还表明，RKIP的恢复显著抑制FOCUS细胞的迁移和运动，表明该途径在肝肿瘤发生中很重要。最近的一项研究表明，帕米膦酸钠抑制了肝癌细胞系ERK的磷酸化并减少了迁移。54另一项研究还表明，ERK信号通路的激活增强了F9壁内胚层细胞中的细胞迁移，而这种迁移被MEK抑制剂抑制。55然而，ERK/MAPK途径如何调节细胞迁移的机制尚不清楚，还需要进一步的研究。
总之，这些观察结果证明，肝癌中RKIP表达下调有助于ERK/MAPK通路的组成性激活，并促进肝癌细胞的增殖和迁移。此外，IGF-I刺激的ERK/MAPK通路的激活可以通过RKIP水平的恢复来阻断。此外，RKIP的表达可能有助于肝癌细胞的分化。RKIP表达的调控可能涉及转录和/或转录后机制，需要进一步研究。最后，RKIP提供了一个有吸引力的分子靶点来调节肝癌的增殖和分化。
致谢
部分资金由国立卫生研究院CA-35711、AA-02666（JRW）、P20 RR015578（MK）以及韩国肝病研究协会葛兰素惠康肝病学家肝炎研究基金（HCL）提供。
使用的缩写
| 18S rRNA | 18S核糖体RNA |
| cDNA | 互补DNA |
| 肝癌 | 肝细胞癌 |
| IGF公司 | 胰岛素样生长因子 |
| MAPK公司 | 丝裂原活化蛋白激酶 |
| RKIP公司 | Raf激酶抑制剂蛋白 |
| 逆转录聚合酶链反应 | 反转录聚合酶链反应 |
| 小核糖核酸 | 小干扰RNA |
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
工具书类
1Bosch FX、Ribes J、Diaz M、Cleries R.《原发性肝癌：全球发病率和趋势》。胃肠病学。2004;127：S5–S16。2004. [公共医学][谷歌学者] 2Moradpour D，Blum HE。肝细胞癌的发病机制。《欧洲胃病与肝病杂志》。2005;17:477–483.[公共医学][谷歌学者] 三。Fausto N，Laird A，Webber E.生长因子和细胞因子在肝再生中的作用。美国财务会计准则委员会J。1995;9：1527–1536。[公共医学][谷歌学者] 4Park YN，Chae KJ，Kim YB，Park P，Theise N.肝硬化相关肝癌发生中的细胞凋亡和增殖。癌症。2001;92:2733–2738.[公共医学][谷歌学者] 5Tannapfel A，Wittekind C.参与肝细胞癌的基因：细胞周期和凋亡的失调。Virch Arch公司。2002;440:345–352.[公共医学][谷歌学者] 6Thorgeirsson SS、Teramoto T、Factor VM。肝细胞癌细胞凋亡的失调。精液肝病。1998;18:115–122.[公共医学][谷歌学者] 7Humbel RE。胰岛素样生长因子I和II。欧洲生物化学杂志。1990;190:445–462.[公共医学][谷歌学者] 8Scharf J，Braulke T。IGF轴在肝癌发生中的作用。Horm Metab研究。2003;35:685–693.[公共医学][谷歌学者] 9Alexia C，Fallot G，Lasfer M，Schweizer-Groyer Gc，Groyer A.胰岛素样生长因子（IGF）和I型IGF受体信号在肝癌发生和肝癌细胞抵抗药物诱导凋亡中的作用评估。生物化学药物。2004;68:1003–1015.[公共医学][谷歌学者] 10Radcliff K，Tang TB，Lim J，Zhang Z，Abedin M，Demer LL，Tintut Y。胰岛素样生长因子-I通过细胞外信号调节的蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶途径调节钙化血管细胞的增殖和成骨细胞分化。Cir研究。2004;96:398–400.[公共医学][谷歌学者] 11王毅，孙毅。作为抗癌靶点的胰岛素样生长因子受体-1：阻断转化和诱导凋亡。当前癌症药物靶点。2002;2：191–207。[公共医学][谷歌学者] 12凹口M，Siu LL。Ras和Raf-激酶作为癌症治疗靶点的原理。当前药物设计。2003;8:2231–2242.[公共医学][谷歌学者] 13O'Neill E，Kolch W.承认普遍存在的Raf/MEK信号通路的特异性。Br J癌症。2004;90:283–288. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Chang F，Steelman L，Lee J，Shelton J，Navolanic P，Blalock W，Franklin R，McCubrey J.从细胞因子受体到转录因子的Ras/Raf/MEK/ERK途径介导的信号转导：治疗干预的潜在靶向。白血病。2003;17:1263–1293.[公共医学][谷歌学者] 15Mitsui H、Takuwa N、Maruyama T、Maekawa H、Hirayama M、Sawatari T、Hashimoto N、Takuva Y、Kimura S。MEK1-ERK-MAP激酶途径和PI 3-激酶-Akt途径独立介导HepG2肝癌细胞的抗凋亡信号。国际癌症杂志。2001;92:55–62.[公共医学][谷歌学者] 16Schmidt CM、McKillop IH、Cahill PA、Sitzmann JV。原发性肝细胞癌中MAPK表达和活性增加。生物化学与生物物理研究委员会。1997;236:54–58.[公共医学][谷歌学者] 17Schmidt CM、McKillop IM、Cahill PA、Sitzmann JV。cAMP MAPK信号传导在体外调节人肝细胞癌生长中的作用。欧洲胃病与肝病杂志。1999年；1:1393–1399.[公共医学][谷歌学者] 18Dent P，Grant S.有丝分裂原激活的细胞外调节激酶/有丝分裂素激活的蛋白激酶信号转导途径的药理学阻断：在促进细胞毒性药物作用中的潜在作用。临床。癌症研究。2001;7:775–783.[公共医学][谷歌学者] 19Weinstein-Openheimer CR、Henriquez-Roldan CF、Davis JM、Navolanic P、Saleh OA、Steelman L、Franklin R、Robinson PJ、McMahon M、McCubrey J.Raf信号转导级联在抗癌药物阿霉素体外耐药性中的作用。临床癌症研究。2001;7:2898–2907.[公共医学][谷歌学者] 20Keller ET，Fu Z，Brennan M。Raf激酶抑制剂蛋白（RKIP）在健康和疾病中的作用。生物化学药物。2004;68:1049–1053.[公共医学][谷歌学者] 21Odabaei G、Chatterjee D、Jazirehi AR、Goodglick L、Yeung KC、Bonavida B.Raf-1激酶抑制剂蛋白：结构、功能、细胞信号的调节以及在凋亡中的关键作用。高级癌症研究。2004;91:169–200.[公共医学][谷歌学者] 22Schuerer MM、Bataille F、Hagan S、Kolch W、Bosserhoff AK。黑色素瘤细胞系中Raf激酶抑制剂蛋白表达的减少与Ras-细胞外信号调节激酶信号的增加有关。癌症研究。2004;64:5186–5192.[公共医学][谷歌学者] 23Trakul N，Rosner MR.Raf激酶抑制蛋白对MAP激酶信号级联的调节。细胞研究。2005;15:19–23.[公共医学][谷歌学者] 24Yeung KC、Janosch P、McFerran B、Rose DW、Mischak H、Sedivy JM、Kolch W.Raf激酶抑制剂蛋白抑制Raf/MEK/细胞外信号调节激酶途径的机制。分子细胞生物学。2000;20:3079–3085. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Yeung KC、Seitz T、Li S、Janosch P、McFerran B、Kaiser C、Fe F、Katsanakis KD、Rose DW、Mischak H、Sedivy JM、Kolch W.通过RKIP抑制Raf-1激酶活性和MAP激酶信号。自然。1999年；401:173–177.[公共医学][谷歌学者] 26Banfield MJ、Barker JJ、Perry AC、Brady RL.结构功能？人磷脂酰乙醇胺结合蛋白的晶体结构表明其在膜信号转导中发挥作用。结构。1998;6:1245–1254.[公共医学][谷歌学者] 27Serre L、de Jesus KP、Zelwer C、Bureaud N、Schoentgen F、Benedetti H。YBHB和YBCL的晶体结构形成大肠杆菌，这是Raf激酶抑制剂蛋白的两种细菌同源物。分子生物学杂志。2001;310:617–634.[公共医学][谷歌学者] 28Chatterjee D、Bai Y、Wang Z、Beach S、Mott S、Roy R、Braastad C、Sun Y、Mukhopadhyay A、Aggarwai BB、Darnowski J、Pantazis P、Wyche J、Fu Z、Kitagwa Y、Keller ET、Sedivy JM、Yeung KC。RKIP使前列腺癌和乳腺癌细胞对药物诱导的凋亡敏感。生物化学杂志。2004;279:17515–17523.[公共医学][谷歌学者] 29Fu Z，Smith PC，Zhang L，Rubin MA，Dunn RL，Tao Z，Keller ET。Raf激酶抑制剂蛋白表达对前列腺癌转移的抑制作用。美国国家癌症研究所杂志。2003;95:878–889.[公共医学][谷歌学者] 30Zhang L，Fu Z，Binkley C，Giordano T，Burant CF，Logsdon CD，Simeone DM。Raf激酶抑制蛋白抑制β细胞增殖。外科手术。2004;136:708–715.[公共医学][谷歌学者] 31Keller ET。转移抑制基因：raf激酶抑制剂蛋白（RKIP）的作用抗癌药物。2004;15:663–669.[公共医学][谷歌学者] 32Keller ET，Fu Z，Brennan M。前列腺癌转移抑制蛋白的生物学：Raf激酶抑制剂蛋白。细胞生物学杂志。2005;94:273–278.[公共医学][谷歌学者] 33考夫曼EC、Robinson VL、Stadler WM、Sokoloff MH、Rinker-Schaeffer CW。转移抑制：转移抑制基因在次级位置调节癌细胞生长的进化作用。J乌罗。2003;169:1122–1133.[公共医学][谷歌学者] 34Merle P、de la Monte S、Kim M、Herrmann M、Tanaka S、von dem Bussche A、Kew MC、Trepo C、Wands JW。人类肝细胞癌中Frizzled-7受体过度表达的功能后果。胃肠病学。2004;127:1110–1122.[公共医学][谷歌学者] 35de la Monte SM，Lahousse SA，Carter J，Wands JR，ATP发光运动侵袭试验。生物技术。2002;33:98–100.[公共医学][谷歌学者] 36Darlington G，Kelly J，Buffone G。人类肝癌细胞在特定培养基中的生长和肝特异性基因表达。体外细胞开发生物学。1987;23:349–354.[公共医学][谷歌学者] 37He L，Isselbacher KJ，Wands JR，Goodman HM，Shih C，Quaroni A.一种新的人类肝癌细胞系的建立和鉴定。体外。1984;20:493–504.[公共医学][谷歌学者] 38Knowles B、Howe C、Aden D。人肝癌细胞株分泌主要血浆蛋白和乙型肝炎表面抗原。科学。1980;209:497–499.[公共医学][谷歌学者] 39Khamzina L、Gruppuso P、Wands JR。正常肝脏发育中通过IRS-1和IRS-2的胰岛素信号传导。胃肠病学。2003;125：572–585。[公共医学][谷歌学者] 40Sasaki Y、Nishiyama ZX、Avruch M、Wands JR。大鼠肝再生过程中胰岛素受体底物1的表达和磷酸化。生物化学杂志。1993;268:3805–3808.[公共医学][谷歌学者] 41Ito T，Sasaki Y，Wands JR。人胰岛素受体底物1的过度表达通过丝裂原活化蛋白激酶的激活诱导细胞转化。分子细胞生物学。1996;16:943–951. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Tanaka S，Ito T，Wands JR。胰岛素受体底物-1过度表达诱导的肿瘤转化需要与Grb2和Syp信号分子相互作用。生物化学杂志。1996;271:14610–14616.[公共医学][谷歌学者] 43Tanaka S、Mohr L、Schmidt EV、Sugimachi K、Wands JW。肝细胞中人胰岛素受体底物过度表达的生物学效应。肝病学。1997;27:598–604.[公共医学][谷歌学者] 44Wands JR，Maradpour DW。肝细胞癌的分子发病机制。收录人：B.TD ZD，编辑。肝病学：肝病教科书。第5版。WB桑德斯；2006年出版。[谷歌学者] 45Tanaka S，Wands JR。一种羧基末端截短的胰岛素受体底物-1显性阴性蛋白与人类肝细胞癌恶性表型的比较。临床投资杂志。1997;98:2100–2108. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Huerta-Yepez S、Vega M、Jazirehi AR、Garban H、Hongo F、Cheng G、Bonavida B。一氧化氮通过NF-kB失活和Bcl抑制使前列腺癌细胞株对TRAIL介导的凋亡敏感-x升表达式。致癌物。2004;23:4993–5003.[公共医学][谷歌学者] 47Alexia C，Lasfer M，Groyer A.组成性激活和胰岛素样生长因子刺激的ERK1/2信号在人肝癌细胞增殖和凋亡中的作用。肿瘤细胞系异质性的证据。Ann NY科学院。2004;1030:219–229.[公共医学][谷歌学者] 48Ito Y、Sasaki Y、Horimoto M、Wada S、Tanaka Y、Kasahara A、Ueki T、Hirano T、Yamamoto H、Fujimoto J、Okamoto E、Hayashi N、Hori M。人类肝细胞癌中有丝分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节的激活。肝病学。1998;27:951–958.[公共医学][谷歌学者] 49Mishima K、Yamada E、Masui K、Shimokawara T、Takayama K、Sugimura M、Ichijima K。ERK/MAP激酶在口腔鳞癌中的过度表达。中度病理学。1998;11:886–891.[公共医学][谷歌学者] 50Price DT、Rocca GD、Guo C、Ballo MS、Schwinn DA、Luttrell LM。人前列腺癌细胞外信号调节激酶的激活。J乌罗。1999年；162:1537–1542.[公共医学][谷歌学者] 51Sivaraman VS，Wang H，Nuovo GJ，Malbon CC。有丝分裂原活化蛋白激酶在人类乳腺癌中的高表达。临床投资杂志。1997;99:1478–1483. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 52Tsuboi Y、Ichida T、Sugitani S、Genda T、Inayoshi J、Takamura M、Matsuda Y、Nomoto M、Aoyagi Y。细胞外信号调节蛋白激酶在人肝癌中的过度表达及其与增殖的关系。肝脏Int。2004;24:432–436.[公共医学][谷歌学者] 53Vicent S、Garayoa M、Lopez-Picazo JM、Lozano MD、Toled G、Thunnissen FB、Manzano RG、Montuenga LM。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1在非小细胞肺癌中过表达，是患者预后的独立预测因子。临床癌症研究。2004;10:3639–3649.[公共医学][谷歌学者] 54Wada A、Fukui K、Sawai Y、Imanaka K、Kiso S、Tamura S、Shimomura I、Hayashi N.Pamidronate在肝细胞癌中诱导的抗增殖、凋亡和抗迁移作用。肝素杂志。2006;44:142–150.[公共医学][谷歌学者] 55Hong T，Grabel LB。F9壁内皮细胞的迁移受ERK途径调节。细胞生物化学杂志。2005;97(6):1339–1349.[公共医学][谷歌学者] 
